Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

Summary

Calcium ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Signalwegen beteiligt sind. Live Cell Imaging erfordert spezielle Geräte und kann zeitaufwendig sein. Eine schnelle, einfache Methode mit einem Durchflusszytometer, um relative Veränderungen in zytosolischen Kalzium in adhärenten Epithelzellen in Suspension gebracht bestimmen optimiert.

Abstract

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Introduction

Calcium ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff für die Übertragung von zellulären physiologischen und pathophysiologischen Signale ¹ verantwortlich. Cytosolischen Calciumkonzentrationen werden durch die Aktivität der Calciumpumpen und Calciumtauscher gering gehalten. Das Sarkoplasma / Endoplasmatischen Retikulum Kalzium-ATPase (SERCA) füllt das endoplasmatischen Retikulum (ER) Calciumspeicher als Teil einer "Pumpe Leck" System, während die Plasmamembran Calcium ATPase (PMCA) extrudiert Calcium an den extrazellulären Raum, sowohl im ATP-abhängigen Weise ^2. Physiologischen Botenstoffe, wie Hormone oder Neurotransmitter, übertragen ihre Signale über G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die Aktivierung von Phospholipase C, die Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in der Plasmamembran hydrolysiert zu Diacylglycerol und Inositoltriphosphat (IP3) ³ zu erzeugen. Während Diacylglycerin in der Plasmamembran bleibt diffundiert IP3 in das Cytosol und bindet an IP3-Rezeptors (IP3Rs), die Liganden-aktivierten Calciumkanäle, in die ER-Membran und Calcium ist von dem ER luminalen Speicher die mit einer Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration ⁴ gelöst. Eine alternative Route für Calcium in das Cytosol zu erreichen, ist durch Calciumkanäle und Wärmetauscher in der Plasmamembran vorhanden sind. Übersprechen zwischen diesen beiden Fächern wurden beschrieben: Calcium induzierte Calciumfreisetzung (CICR), wo extrazelluläres Calcium induziert Calcium-Freisetzung aus ER speichert ⁵ und Speicher betrieben Calcium Eintrag (SOCE), wo Entleerung der ER speichert durch STIM erfasst und bewirkt Öffnung Orai Calcium-Kanäle in der Plasmamembran zu fördern Nachfüllen der ER speichert ^6.

Unter pathophysiologischen Bedingungen ist die zelluläre Kalziumantwort deregulierten und cytosolischen Calciumerhöhungen in Abwesenheit von physiologischen Stimulatoren ^1. Die Calcium-Reaktion kann in einer Anzahl von Weisen beeinflusst werden: verlängerte CalciumSignal, verzögerte Calciumentfernung aus dem Cytosol, Erschöpfung der Kalziumspeichern oder lokalisierte Veränderungen der Kalzium. Darüber hinaus sind die Mitochondrien nehmen eine zentrale Rolle bei der Pufferung und der Freisetzung von Kalzium ^7. Längerer und / oder supra zytosolischen Kalziumanstieg führt zum Zelltod. In der Tat ist Calcium öfter als nicht in der zellularen pathophysiologischen Antwort beteiligt und ist ein Schlüsselereignis in einer Vielzahl von Erkrankungen, wie von neurodegenerativen Erkrankungen, Herzerkrankungen, Krebs, Knochenerkrankungen und Nierenerkrankungen, die hauptsächlich mit Zelltod verbunden sind, und Verlust oder die Veränderung von Organ- oder Gewebefunktion ^8-10. Darüber hinaus hat der Störungscalciumsignale an zellulären Anpassung und Veränderungen der zellulären Funktionen und Antworten verknüpft.

Traditionell werden Calcium-Signale mit einem negativ geladenen fluoreszierenden Calcium-Indikator, der in einer Zelle durchlässigen Acetoxymethyl (AM) in Esterform in die Zellen geladen werden, wird gemessen. Einmal durch zelluläre Esteras gespaltenes bleiben die Fluoreszenzindikatoren innerhalb des intrazellulären Kompartiment und Erhöhung der Fluoreszenzintensität, wenn Kalzium gebunden ist. Die bekannteste und verwendet Calciumindikator ist die ratiometrische Fura-2 von Roger Tsien und Kollegen ¹¹ entwickelt. Calcium-Indikatoren mit unterschiedlichen Affinitäten für Calcium erlauben verschiedene Calcium-Pools zu überwachen. Nachweismethoden umfassen Live Cell Imaging, Fluoreszenz Mikroplatten-Reader und Durchflusszytometrie. Die relativ schnelle Kinetik der Calciumsignale (in der Regel innerhalb von ein paar Sekunden bis Minuten) macht das Live Cell Imaging, die beste Methode für die Gewinnung die meisten Informationen über Eigenschaften des Calciumsignals. Abgesehen von der schnellen Kinetik der Kalzium-Signale (in Millisekunden), ist Live Cell Imaging eine bessere Methode zur Untersuchung von zellulären Kompartimentierung von Kalzium Signalisierung innerhalb einer einzelnen Zelle ^12. Absolute Calciumkonzentrationen kann durch Bestimmung der minimalen und maximalen Fluoreszenz des Calcium ind berechnet werdenicator durch Zugabe eines Calcium-Chelators und Permeabilisierung der Zellen, die jeweils in der durch die Grynkiewicz et al. ¹¹ beschrieben.

Die Verwendung von Durchflusszytometrie zur Calcium-Signale zu messen wurde zuerst in den 1980er Jahren in der immunologischen Zellen entwickelt, bei denen die Möglichkeit, mehrere Parameter, wie die Membranintegrität und die Trennung der Zellpopulation, und dem Erfordernis der Zellen in Suspension in Verbindung mit der Entwicklung der einzelnen Wellenlänge zu messen Calcium Indikatoren Durchflusszytometrie einer idealen und convenientdetection Verfahren ^13-15. In adhärenten Zellen, bietet Live Cell Imaging die meisten Informationen über Calcium-Signal, was am wichtigsten ist die Kinetik, erfordert jedoch ein kompliziertes Setup bestehend aus einem Fluoreszenzmikroskop, ein Perfusionssystem, Aufrechterhaltung der Zellumgebung, wie Temperatur, und spezialisierte Mikroskop-Software für den Erwerb und Analysieren von Daten. Alternative Verfahren, wie ein Fluoreszenzmikroplattenlesegerät oder Pharmacollogischen Mittel, durch Verwendung von Calciumchelatoren sind in Bezug auf die gewonnenen Informationen unvergleichlich. Durchflusszytometrie wird immer häufiger verwendet, um cytosolische Calcium in adhärenten Zellen, obwohl zu überwachen, in den meisten Studien nur Endpunktmessungen durchgeführt. Verwendung des Verfahrens zunächst von Gergely et al. In immunologischen B-Zellen ^16, Änderungen in der cytosolischen freien Kalziumkonzentration mittels Durchflusscytometrie mit Echtzeit-Kinetik und die Überwachung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Zellen aus einer Probenpopulation wurden erfolgreich bei Krebs epithelialen Zellen gemessen und Krebsstammzellhybriden ^17. Dieses Verfahren wurde für die Verwendung in adhärenten Epithelzellen, die schwierig mit Calcium-Indikatoren ¹⁸ zu laden sind, angepasst.

Hier mit einem verewigt adhärenten Zelllinie aus dem S1-Segment der Rattenniere proximalen Tubulus (WKPT-0293 Cl.2) ¹⁹ abgeleitet, beschreiben wir eine optimierte vereinfachte methode zur Messung von Änderungen in der cytosolischen Calciumkonzentration durch Durchflusszytometrie. Da viele Epithelzellen eine Reihe von organischen Transporter für anionische Verbindungen besitzen, können Beladung von Zellen mit einem Calcium-Indikator als eine Herausforderung sein. Um das Ausströmen von Kalzium-Indikatoren, Probenecid, der prototypischen Inhibitor der organisches Anion Transporter und ursprünglich entwickelt, um die renale Ausscheidung von Penicillin ²⁰ verringern zu verhindern, wird gleichzeitig im Inkubationsmedium aufgetragen. Die Zellen werden in Monokalziumindikator geladen gehalten, in Suspension gebracht und Calciumsignale unmittelbar nach Zugabe der Verbindung detektiert werden.

Protocol

1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen Bereiten Sie einen modifizierten Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) (in mm: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO 3, pH 7,2, kein Phenol rot). Lagerung bei 4 ° C. Machen 1,5 M CaCl 2 und 2 M 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) (pH 7,2) Stammlösung unter Verwendung von destilliertem Wasser. Bereiten Sie eine 250 mM S…

Representative Results

Um cytosolischen Calcium zu erhöhen, wurden zwei pharmakologische Verbindungen zu Nieren proximalen Tubuluszellen (WKPT-0293 Cl.2) mit zellpermeablen Kalzium bindenden Farbstoff, Fluo-3-AM beladen angewendet. Unbehandelten Kontrollproben wurden mit Calcium bindenden Farbstoff in Gegenwart von Probenecid geladen und gemischt, aber ohne den Zusatz irgendwelcher Verbindungen. Thapsigargin (TG) ist ein klassisches Inhibitor der SERCA Pumpe führt, aus dem ER Leckage und zu erhöhten zytosolischen Calcium. Tunicamycin (TUN)…

Discussion

Calcium ist ein Schlüsselereignis in mehreren Zellprozesse als second messenger-Signalmoleküls als auch als ein Mittel, um zwischen dem ER und Mitochondrien vermitteln wirkt. Die Fähigkeit, Änderungen in der freien cytosolischen Calciumkonzentrationen zu messen, ist eine nützliche Technik, die in allen Bereichen der Zellbiologie gelten können. Es gibt verschiedene Methoden, um cytosolische Calcium-Signale zu detektieren. Klassisch, Signale von einer ratiometrischen Calciumindikator, wie Fura-2, werden in lebenden …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Cell permeable
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line			Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)