Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

פלזמה מהירה ובידוד של מרכיבי דם שלמים בדגימות שהתקבלה מהגדרה מבוססת-קהילה

Published: November 30, 2015 doi: 10.3791/52227
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4, 5, 6, 7, 6, 1,2
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

Abstract

איסוף ועיבוד של דגימות דם כל בהגדרה הלא-קלינית מציע הזדמנות ייחודית כדי להעריך אנשים המתגוררים בקהילה עם או בלי תנאי preexisting. עיבוד מהיר של דגימות אלה הוא חיוני כדי למנוע השפלה של רכיבים סלולריים מפתח. כלולות כאן הם שיטות לתא בו זמנית היקפי mononuclear הדם (PBMC), DNA, RNA ובידוד בסרום מתיקו דם יחיד שבוצע בבתיהם של משתתפים בהסכמה ברחבי מטרופולין, עם עיבוד יזמו בתוך 2 שעות של אוסף. יש לנו בשימוש בטכניקות אלה לעבד מעל 1,600 דגימות דם חומר מניב עקבי, באיכות גבוהה, אשר לאחר מכן נעשה שימוש במתילציה DNA, genotyping, ביטוי גנים מוצלח וcytometry זרימת מנתח. חלק מהשיטות המועסקות הם סטנדרטיים; עם זאת, בשילוב באופן המתואר, הם מאפשרים עיבוד יעיל של דגימות ממשתתפי population- ו / ולקהילה,מחקרים מבוססים שבדרך כלל לא ניתן להעריך בסביבה קלינית. לכן, יש פרוטוקול זה הפוטנציאל להשיג דגימות (ובהמשך נתונים), כי הם יותר מייצג של האוכלוסייה הכללית.

Introduction

מחקרים רבים אפיינו הבדלים בביטוי גנים, מתילציה DNA ותת-קבוצה של תאים בדם בקרב אנשים עם ובלי נפש (או אחר) המחלות 1-4. מחקרים אלה, לעומת זאת, התקבלו מהגדרות קליניות שבו ההבדלים הקשורים מחלה עלולים להיות מוגדלים בשל האופי בדרך כלל חמור יותר של המחלות שחולים מחפשים טיפול. בשל התקדמות ב" ה"אומיקה "גישות, בעשור האחרון ראה התפוצצות של עניין בקבלת דגימות ביולוגיות מהקהילה ו / או הגדרות אפידמיולוגיים 5-7, על מנת לספק הערכות מבוססות-אוכלוסייה של שכיחות מחלה ותמונה רחבה יותר של גורמים סביבתיים של מחלות נפש ו / או פיזיות אלה.

אתגר מרכזי בהקשר זה הוא הדרישה לעיבוד מהיר של הדגימות שנאספו. השפלה של תאי mononuclear, רכיבי מערכת חיסון מפתח שfrequently משמש כדי להעריך את בריאותו של אדם, מתחילה מייד עם תיקו דם עם ירידה משמעותית בהתאוששות לאחר שעה 2 של אוסף 8-10. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מציגים פרוטוקול מותאם שברכיבים מרובים של כל דם האנושי מבודדים זמנית מדגימות שהתקבלו בבתיהם של נושאים המתגוררים באזור מטרופולין גדול. הפרוטוקול מבוסס על האוסף והשינוי של טכניקות הנוכחיות, כוללים אחסון של כל השברים "תוספת" במקרה טכניקות עתיד לאפשר לבידוד נוסף שלנו / מנתח. בעוד שיטות או ערכות חלופיות עשויות להיות מועסקות במקום של השיטות בודדות שתוארו כאן, התוו אלה הוכיחו להיות אמצעי אמין ויעיל לעיבוד דגימות באופן תפוקה גבוהה. שברים באיכות גבוהה (PBMCs, DNA, סרום, ו- RNA) של דם טרי יכול להיות מיוצרים בשעה 2 של אוסף וכל דגימות assay-מוכן יכול להיות זמין בתוך 2 ימים (איור 1).

פרוטוקול זה פותח כדי לאפשר העיבוד יעיל של דגימות שנאספו מהקהילה-מגורים, התושבים בוגרים של העיר דטרויט לבדיקה במחקר בריאות שכונת דטרויט (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), המבוסס אוכלוסייה- מחקר של הגורמים החברתיים והביולוגיים של הפרעת דחק פוסט טראומטית (PTSD) ומחלות נפש אחרות. השכיחות של PTSD בדטרויט היא יותר מכפול מהממוצע הארצי 11,12. זיהוי גורמים ביולוגיים של PTSD באוכלוסייה זו עשויה לעזור לפתח תרופתי מתאימה ו / או התערבויות קוגניטיביות-התנהגותיות לסייע לאלו הסובלים מההפרעה, הן באוכלוסייה עירונית זה, ובאוכלוסיות בסיכון גבוה אחרים (למשל, חוזר יוצאי צבא). המעבדה שלנו, הממוקמת בעבר באוניברסיטה ויין סטייט בדטרויט, מישיגן, נבחרה לעיבוד המבוסס על המומחיות שלנו בטיפול בדגימות רקמה טריות המיוצרות ממגווןמקורות, את ההכרח להתחיל עיבוד הדגימות בתוך שעה 2 של אוסף, והקרבה שלנו לאתרי האיסוף. עם הזדמנות ייחודית זו ביד, המטרה שלנו הייתה כדי לייעל את העיבוד לתשואה הגדולה ביותר של ה- DNA, RNA, סרום ותאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) מכל דגימה (כוללת של N = 1,639 דגימות מעל 5 גלים של אוסף דגימה). הנהלים שתוארו כאן ניתן לבצע בו זמנית בסביבה הלא-קלינית, ובכך לייצר חומר מוצא (ראה טבלה 1 לתשואות ממוצעת) עבור מספר רב של יישומים במורד הזרם כוללים microarray, אפיגנטיים, בזמן אמת RT-PCR, וcytometry זרימת מנתח.

איור 1
איור 1. זרימת עבודה בסך הכל. התהליך הכולל המתואר כאן כוללת את הלוגיסטיקה של קבלת דגימות דם מזיהוי לגבי השתתפות הסכמהipants לדם לצייר את עצמו. באיכות גבוהה, שברים (תאי דם היקפי mononuclear; PBMCs, DNA, סרום, ו- RNA) של כל דם טרי יכולה להיות מיוצרים בשעה 2 של אוסף וכל דגימות assay-מוכן יכולות להיות זמינות בתוך 2 ימים. יתר על כן, שברים שהוכנו באמצעות שיטה זו מתאימים לאחסון לטווח ארוך, אם דגימות אינן להיבדק מייד. ציר הזמן כולו המתוארים כאן יכול להסתיים ביום אחד (~ 5 סך הכל שעות). עם זאת, ביום כזה יהיה מאוד עבודה אינטנסיבית במיוחד עבור טכנאי יחיד עם ניסיון רב עם הטכניקות. לפיכך, אנו ממליצים לחלק את ההליכים ביום 1 בין לפחות שני טכנאים והשלמת עיבוד RNA ביום 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר בריאות דטרויט השכונה היה נבדק ואושר על ידי אוניברסיטת Institutional Review Board של מישיגן. כל המשתתפים בתנאי הסכמה מדעת לפני השתתפותם במחקר.

1.

  1. כראוי לתעד את כל השלבים מגיוס באמצעות ניתוח של נתונים נקודת סיום. בצע את הפרוטוקולים ביום 1 בו זמנית, מיתוג ושלבים חופפים עם זמן. הרצף של שלבים כתוב כדי לייעל את יעילות ביצועים. איור 1 מספק סקירה של התהליך כולו.
    הערה: הטווח, "משתתף" משמשת בכל רחבי לסמן דגימת הדם-דה זיהה נמשכת מפרט הסכמה. הפעמים בסוגריים להלן מצביעות על ידיים בזמן. ניתן למצוא דוגמאות של גיליון המעקב ויומן דגימה בלוחות משלימים S1 ו- S2, בהתאמה. דגימות שנאספו על ידי מתרימי דם בבתיםשל אנשים שזוהו כהסכמת משתתפים על ידי רכז המחקר ומועבר למעבדה על ידי שליח (ראה מידע משלים (SI) 1 לפרטים מראש עיבוד נוספים).

2. יום התקנה 1

  1. הכן נאגר מלוח פוספט 1x (PBS).
  2. מחממים גוש חום 56 מעלות צלזיוס.
  3. הכן את פרוטאז (ראה SI 2) על ידי aliquoting 20 μl למספר המתאים של צינורות microcentrifuge עבור המשלוחים של היום (2 לכל משתתף).
  4. ודא חוצצי AW1 וAW2 (מאגרים לשטוף המסופקים בערכת בידוד DNA המגביר את טוהר של ה- DNA) מוכנים לשימוש, והוסיף 100% אתנול כפי שמצוין על התווית, במידת צורך.
  5. להתקרר צנטריפוגה בקירור עד 4 מעלות צלזיוס.
  6. להחליף את הכובע על הבקבוק של 1x PBS עם כובע מחיצת הגומי סיפק ולנקב את מחיצת הגומי עם ספייק העברה, שמירה על כובע הבורג על גבי SPI ההעברהke כדי למנוע אידוי. חזור עם הבקבוק של פתרון ייצוב RNA.
  7. בעקבות הכנת בלוק מאגרים, צנטריפוגה וחום, לתעד את מועד מסירת Vacutainer בגיליון המעקב אחר מדגם (ראה הטבלה SI).

3. יום 1: כל דגימת דם עיבוד ל- DNA, RNA PBMCs ויקוציט (2 שעות)

  1. סקירה כללית
    1. אלוט מספיק זמן כדי למזער את העיכוב בין תיקו דם ושעת התחלת עיבוד. בגין עיבוד של vacutainers מכיל Ficoll בתוך 2 שעות של תיקו דם, כדי למנוע עלייה בזיהום של תאי דם אדום וירידה בהתאוששות תא mononuclear.
    2. תניח אוסף של 2 vacutainers המכיל ג'ל שיפוע Ficoll, 2 K 2 חומצת Ethylenediaminetetraacetic vacutainers (EDTA), וVacutainer סרום 1 למשתתף מבוגר. עם מסירת vacutainers למעבדה, יש לי טכנאי לחתום על הקבלה מסמלת גיליון מעקב של הדגימות. לְהִתְחַנֵןבעיבוד מייד עם תחילת הזמן המתועד לVacutainer בסיס ביומן הדגימה.
  2. שלב סרום בידוד 1 (1 דקות)
    1. לתעד את שעת ההתחלה ביומן הדגימה (ראה הטבלה SI 2). צנטריפוגה (עם בלם וההאצה OFF) Vacutainer 7.0 מיליליטר סרום (אדום) (1 למשתתף) באמצעות הרוטור דלי מתנדנד עם כובעי תרסיס (רמת בטיחות ביולוגית 2; BSL2 מוסמך) במשך 20 דקות, 1300 XG, 4 מעלות צלזיוס.
  3. שלב בידוד DNA 1 (15 דקות)
    הערה: לפרטים נוספים על הליך בידוד זה, ראה פרוטוקול של היצרן 13.
    1. לתעד את שעת ההתחלה. במנדף תרבית תאי BSL2, להפוך את vacutainers המכיל ג'ל Ficoll 5 פעמים ולאחר מכן להוסיף 200 μl כל דם מהחלק העליון של אחד מvacutainers לכל אחד משני 20 aliquots μl של פרוטאז (400 סך הכל μl למשתתף). השארת צינורות פרוטאז + microcentrifuge הדם במכסת המנוע, תמשיך centrifugation של Ficoll מכיל vacutainers בשלב 3.4.1.
      הערה: השתמש בVacutainer עם אוסף הנפח הגדול ביותר, תוך התחשבות בצורך של איזון צנטריפוגות (כלומר, ייתכן שיהיה צורך להסיר 200 μl מכל אחד משתי vacutainers) כאשר מסתובב vacutainers בשלב 3.4.1. בנוסף, כדי להבטיח הפרדה נאותה במהלך העיבוד של vacutainers הכחול, לרמה של דם שנותר בVacutainer לא צריכה להיות פחות מ -2.5 אינץ 'מעל שכבת Ficoll.
  4. שלב PBMC בידוד 1 (1 דקות)
    1. לתעד את שעת ההתחלה (חייב להיות בתוך 2 שעות של תיקו דם, כדי למנוע עלייה בזיהום של תאי דם אדום וירידה בהתאוששות תא mononuclear) .Invert Ficoll מכילה vacutainers 8-10 פעמים. צנטריפוגה (עם בלם ואת ההאצה) vacutainers (2 לכל משתתף) באמצעות הרוטור דלי מתנדנד עם כובעי תרסיס (BSL2 מוסמך) למשך 30 דקות, 1,600 XG, 22 מעלות צלזיוס.
  5. חזור למכסת המנוע ולהוסיף 200 μl מאגר AL לכל אחד מצינורות microcentrifuge פרוטאז + הדם (שלב 3.3.1). כובע, להסיר ממכסת המנוע, מערבולת שניות 15 ופלאש ספין.
  6. דגירה 56 מעלות צלזיוס בגוש חום, 10 דקות.
  7. הסר את הצינורות מהגוש החום. ספין פלאש. חזור למכסה מנוע BSL2. הוסף 200 אתנול 100% μl. כובע, להסיר ממכסת המנוע, מערבולת שניות 15 ופלאש ספין. ניתן להשלים את השלבים שנותרו מחוץ למכסת המנוע.
  8. החל lysate (בתוך 30 דקות של צעד 3.5.3) לטור ספין שכותרתו (בצינור 2 מיליליטר אוסף). סגור את הכובע כדי למנוע זיהום צולב באמצעות תרסיסים. צנטריפוגה 6000 XG, 1 דקות.
  9. מחק את צינור האיסוף המכיל את התסנין ולמקם את טור הספין בצינור איסוף 2 מיליליטר חדש.
  10. הוסף 500 μl מאגר AW1 לעמודה ללא הרטבת השפה, לסגור את המכסה, וצנטריפוגה 6000 XG, 1 דקות.
  11. מחק את צינור האיסוף המכיל את סינוןטה ולמקם את טור הספין בצינור איסוף 2 מיליליטר חדש.
  12. הוסף 500 μl מאגר AW2 לעמודה ללא הרטבת השפה, לסגור את המכסה, וצנטריפוגות 20,000 XG, 3 דקות.
  13. מחק את צינור האיסוף המכיל את התסנין ולמקם את טור הספין בצינור חדש 1.5 מיליליטר אוסף (לא כלול בערכה), ו צנטריפוגות 20,000 XG, 1 דקות.
  14. מחק את צינור האיסוף המכיל את התסנין ולמקם את טור הספין בצינור איסוף 1.5 מיליליטר חדש (לא כלול בערכה).
  15. הוסף 200 μl מאגר AE או מים לכל עמודה ולדגור על RT במשך 5 דקות. צנטריפוגה 6000 XG, 1 דקות.
  16. חזור על שלב 3.5.11 משחררי לתוך צינור האוסף.
  17. בריכת DNA eluted מ2 עמודים למשתתף. תשואה ~ 800 μl סה"כ למשתתף.
  18. לכמת את הדגימות באמצעות ספקטרופוטומטר כאשר הזמן מאפשר.
  19. DNA aliquot כרצוי לתוך 2 cryovials מיליליטר, המתעד את הריכוז של כל אחד על specimeיומן n. העברת cryovials לcryobox ומקום ב -80 ° C לאחסון ארוך טווח. לתעד את שעת התחלת מקפיא.
  • שלב RNA יקוציט בידוד 1 (30 דקות)
    הערה: בצע במכסת מנוע תרבית תאים מוסמכת רמת בטיחות ביולוגית 2. לפרטים נוספים על בידוד זה ראה הוראות יצרן 15.
    1. לנקב את מחיצת הגומי של Vacutainer K 2 EDTA עם ספייק העברה. שמור את הנדן ובורג כובע לשימוש בשלב 3.6.11. בעקבות שיטות סטנדרטי BSL2, דואגים להימנע מחשיפה לפתוגנים bloodborne.
    2. חבר את מחבר הפתק הלבן לראש ספייק ההעברה.
    3. תווית המסנן עם זיהוי המשתתף המקביל לאחר מכן חבר את הכניסה (הסוף התלקח) של המסנן למחבר הפתק הלבן.
    4. צרף מחט מצופה 25⅝ G לשקע (הסוף המחודד) של המסנן. הכנת ההרכבה המסנן לפני המסירה מזרזת את התהליך באופן משמעותי ולכן,מצרף את מחבר פתק הלבן לספייק ההעברה, הוספת המסנן, אז מחט הנדן וקביעת ההרכבה במעמד צינור התרבות עד לשימוש, מומלץ.
    5. בעקבות הרכבה של מערכת צינור EDTA K 2, לשלוף את המחט בצורה בטוחה (השתמש בסוף מרית מתכת). לדקור את המחט לתוך 10 מיליליטר צינור ריק דם פונו אוסף (צינור מקלט סרום) ולהפוך את ההרכבה צינור K 2 Vacutainer EDTA / מסנן / מקלט. בעקבות שיטות סטנדרטי BSL2, דואגים להימנע מחשיפה לפתוגנים bloodborne.
    6. לאפשר לדם לסנן דרך עד הסעיפים בצורת הטריז של המסנן ניקו דם. סינון לוקח בערך 2 דקות ויכול להיות ממוקם במעמד מבחנה במהלך סינון.
    7. הסר את המסנן ממכלול. השאר את המחט בצינור המכיל את התסנין וזורקים את כל ההרכבה במכל החד.
    8. צרף מזרק 5 מיליליטר לספייק ההעברה על הבקבוק של 1x PBS, בVert הבקבוק, ולסגת 3 מיליליטר.
    9. צרף את המזרק עם PBS לכניסה של המסנן ולשטוף את המסנן (3-5 טיפות לשנייה). לאסוף את הזרימה דרך במכל פסולת ביולוגי. לנתק את המזרק מהמסנן בלי לחזור על הבוכנה.
    10. בעקבות סינון ולשטוף PBS, לסגת 3 מיליליטר סוכן ייצוב RNA של שימוש במזרק 5 מיליליטר חדש והשיטה המתוארת בשלב 3.6.8. לשטוף את המסנן כמו בשלב 3.6.9. סוכן ייצוב RNA צריך להישאר במסנן. לנתק את המזרק מהמסנן בלי לחזור על הבוכנה.
    11. לאטום את כניסת המסנן ושקע עם כובע הנדן ובורג נשמרים מספייק ההעברה עוזב את המסנן רווי עם סוכן ייצוב RNA. המסנן יכול להיות מאוחסן בנקודה זו. אחסן את המסנן ב -80 מעלות צלזיוס עד היתרי זמן (~ 2 שעות) להשלמת צעדים 5.3 ל5.4.7.
      הערה: מסננים מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס עד שנה לאחר האיסוף עובדו ללא decreaSE באיכות RNA.
  • שלב PBMC בידוד 2 (30 דקות)
    1. הסר את vacutainers מכיל Ficoll מצנטריפוגה (שלב 3.4.1) ולהמשיך בברדס BSL2. Vacutainers צריך להציג הפרדה כמו באיור 2. אם לא, ראה טבלה 2.
    2. ברגע שVacutainer יוחזר למכסה מנוע BSL2, להסיר את הפקק ולמשוך 1.5 מיליליטר של החלק העליון, צהבהב, שכבת פלזמה (איור 2) בעזרת פיפטה סרולוגיות בלי להתקרב למונונוקלארים שכבה (ברורה / לבן). העבר את הפלזמה ל5 מיליליטר cryovial - (בריכה מ2 vacutainers - משתתף 1). התחבר הנפח שנאסף. ראה שלב 3.7.6 להוראות אחסון.
      הערה: ההפרדה הטובה ביותר ותשואות PBMC הגדולות ביותר מגיעים ממשתתפים שצמו שעות לפחות 12 לפני איסוף דם.
    3. העבר את הפלזמה שנותרה ואת השכבה לבנבנה, mononuclear (כל מה שמעל שכבת ג'ל - איור 2) uלשיר פיפטה סרולוגיות, לצינור 15 מיליליטר חרוטי, איגום שכבת mononuclear מכל אחד משני המכיל Ficoll vacutainers למשתתף לצינור אחד חרוטי.
    4. להוסיף 1X PBS להביא את הנפח הכולל של צינור חרוטי 15 מיליליטר. צינור כובע והיפוך 5 פעמים. צנטריפוגה (עם בלם וההאצה OFF) 15 דקות, 300 XG, 22 מעלות צלזיוס.
    5. חזור אל vacutainers מכיל Ficoll בשכונה ולאסוף את תאי דם האדומים (RBCs) באמצעות "pipet פסטר 5¾ למערבולת סביב ולשחרר מחוץ לשכבת ג'ל Ficoll ולהסיר אותו במידת האפשר. השתמש pipet סרולוגיות לאסוף ולהעביר את RBCs (~ 4.5 מיליליטר) ל5 מיליליטר cryovial. התחבר הנפח שנאסף.
    6. העבר 5 מיליליטר שני cryovials (פלזמה בשלב 3.7.2 וRBCs בצעד 3.7.5) למכל קצב מבוקר הקפאה ולשים ב -80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות לאחר שהזמן שהם יכולים להיות מועברים לcryobox וחזרו ל -80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח.
    7. להחזיר את שיתוףצינור nical למכסה המנוע, כאשר צנטריפוגה בשלב 3.7.4 הושלמה, ולשאוב את כל אבל ~ 500 μl של PBS מבלי להפריע גלולה. תשואת PBMC היא גדולה יותר אם ~ 200 μl של PBS נותר מעל גלולה בשלב זה.
    8. להוסיף טרי 1x PBS להביא את הנפח עד 10 מיליליטר. Resuspend גלולה בעדינות. צינור כובע והיפוך 5 פעמים. צנטריפוגה (עם בלם וההאצה OFF) 10 דקות, 300 XG, 22 מעלות צלזיוס.
  • שלב סרום בידוד 2 (10 דקות)
    הערה: בצע בברדס BSL2.
    1. Aliquot השכבה העליונה הסרום מVacutainer הסרום, לאחר צנטריפוגה (שלב 3.2.1), ל -2 מיליליטר cryovials כרצוי. תשואה טיפוסית היא 2.5 מיליליטר (טבלת 1). התחבר הנפח. לדוגמא, השתמש 4 cryovials aliquoting 200 μl ל1 cryovial, 1,000 μl לתוך 2 cryovial ולאחר מכן לחלק את היתרה לcryovials 3 ו -4.
    2. העבר את cryovials לcryobox ומקום ב -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לתעד את תחילת המקפיאזְמַן.
  • שלב PBMC בידוד 3 (15 דקות)
    1. חזור למכסה המנוע, לאחר צנטריפוגה (שלב 3.7.8), ולשאוב ככל supernatant / PBS ככל האפשר מבלי להפריע גלולה. Resuspend גלולה ידי pipetting ב2.5 מיליליטר PBMC הקפאה בינוני 1 (ראה SI 2).
    2. להוסיף 2.5 מיליליטר PBMC הקפאה בינוני 2 (ראה SI 2) לתא הפתרון הבינוני / בשלב 3.9.1. מערבולת בעדינות.
    3. Aliquot 10 μl של הפתרון הנייד לתוך 0.65 מיליליטר צינור microcentrifuge (דילול נוסף עשוי להיות נחוץ). הוסף 10 μl של 0.4% כתם הכחול trypan לתוך צינור microcentrifuge 0.65 מיליליטר ומערבבים על ידי pipetting מספר פעמים. לפרטים נוספים ראו במדריך של היצרן 16.
    4. Pipet 10 μl של התערובת לתוך תא ספירת שקופיות קאמריות ושקופיות מקום לדלפק התא בתוך 3 דקות של ערבוב. זום פנימה ולהתמקד בתאים. לחץ על "תאי רוזן" להשיג PBMC לספור.
    5. Aliquot, אם ובת קיימאמספר PBMC הוא מעל 3 מיליון תאים למיליליטר (mc / מיליליטר), כרצוי לcryovials והמשיכו לשלב 3.9.9. PBMCs חנות בעד 5 cryovials בריכוז של לפחות 3 mc / מיליליטר כל אחד.
    6. אם מספר PBMC קיימא הוא מתחת ל -3 mc / מיליליטר, לחשב את המספר הכולל של תאים על ידי הכפלת / מיליליטר mc קיימא על ידי 5 מיליליטר. מחלק את המספר הזה על ידי 4, 3, 2 או 1 מיליליטר כך שיהיה צינור אחד לפחות עם 3 MC / מיליליטר.
    7. צנטריפוגה צינור חרוטי המכיל את תאי פתרון / ההקפאה בינונית במשך 5 דקות ב 300 XG (בלם ואת ההאצה). לאחר צנטריפוגה, לשאוב את הנפח המתאים של מדיום (supernatant) הקפאה עוזב את הנפח מחושב לעיל (4, 3, 2 או 1 מיליליטר).
    8. Resuspend גלולה בsupernatant שנותר וaliquot לפחות 3 mc / מיליליטר למספר המתאים של cryovials (1-4) בשעת 1 מיליליטר / cryovial. מדיום הקפאה סופי הוא 10% דימתיל sulfoxide (DMSO) / 20% שור עוברי סרום (FBS) / 70% רוזוול פרק זיכרון מכון (RPMI) 1,640.
    9. Documאף אוזן גרון ספירת התאים לcryovial. העבר את cryovials למכל קצב מבוקר הקפאה ולשים ב -80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות לאחר שזמן cryovials עשוי להיות מועברים לcryobox ולשים במכל חנקן נוזלי (שלב אדים) לאחסון לטווח ארוך. מקפיא מסמך שעת ההתחלה.

    • 4. יום 2 התקנה

    1. מחממים aliquot (220 μl למסנן) של nuclease החופשי 0.1 מ"מ EDTA בצינור nuclease ללא 80 מעלות צלזיוס בגוש חום.
    2. להכין פתרונות לשטוף 1 ו -2 (ראו SI 2).

    5. יום 2: אחסון מדגם לטווח ארוך ועיבוד יקוציט מסנן (3 שעות)

    1. סקירה כללית.
      1. לבצע הליך זה בתוך 6 חודשים מהיישום של כדוריות דם לבנות למסנן.
        שים לב: באופן כללי, יום 2 עיבוד לוקח שעות על 3 וזמן שהוא שכותרתו "יום 2," הדרישה העיקרית היא שחלק עיבוד מסנן צריכה להתבצע ביום שביאין עיבוד יום 1 מתרחש במעבדה.
    2. אחסון לטווח ארוך מדגם (15 דקות)
      1. לבצע הליך זה בכל יום, לפני המשלוח של vacutainers החדש למעבדה לעיבוד יום 1. העבר את cryovials שאוחסנו O / N במכולות הקפאת קצב מבוקר ביום 1 בcryoboxes שכותרתו כראוי ולהחזיר אותם ל -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי (שלב אדים) לאחסון לטווח ארוך. לארגן cryovials המבוסס על סוג מדגם (למשל, ה- DNA, PBMC, RBCs, וכו ') כדי לזרז מיקום מדגם מעקב למבחני נקודות קצה.
    3. עיבוד יקוציט מסנני RNA (45 דקות).
      הערה: לקבלת מידע נוסף על הליך זה לראות הוראות היצרן 17.
      1. להביא את המסנן לRT (מפשיר כ -5 דקות).
      2. הסר את הנדן ובורג כובע מהמסנן. לחזור הבוכנה של מזרק 5 מ"ל ולחבר אותו לכניסה (הסוף התלקח) של המסנן, לוחץ על המתגלגרש את סוכן ייצוב RNA מיציאות המסנן למכל פסולת ביולוגי.
      3. לטעון מזרק 5 מיליליטר חדש עם 4 מיליליטר של פתרון isothiocyanate פנול וguanidine לבידוד RNA ולצרף אותו לכניסה של המסנן, לוחץ על המתג כדי לשטוף את הפתרון דרך המסנן, איסוף lysate בצינור 15 מיליליטר חרוטי שכותרתו (2 לכל משתתף).
      4. נתק את המזרק מהמסנן, לחזור בו מהבוכנה, מחדש לצרף אותו למסנן, ולוחץ על המתג לגרש מדגם שיורית שנלכד במסנן הדיסק לאותו צינור חרוטי 15 מיליליטר. בטל מסנן ומזרק.
      5. להוסיף 800 μl BCP לצינור חרוטי, לסגור את הצינור בחוזקה ונמרץ לנער את ההכנה למשך 30 שניות.
      6. לדגור על RT במשך 5 דקות. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 2000 x גרם.
      7. מעבירים את השלב המימי (העליון) לצינור שכותרתו טרי 15 מיליליטר חרוטי (~ 2.5 מיליליטר).
      8. הוסף 0.5 פעמים הנפח של השלב המימי של מים nuclease חינםd מערבב היטב. לאחר מכן להוסיף 1.25x הנפח המימי של 100% אתנול ומערבבים שוב.
        הערה: נפח 2.5 מיליליטר המימי, להוסיף 1.25 מיליליטר של מים nuclease ללא, לערבב, ולאחר מכן להוסיף 4.7 מיליליטר של אתנול 100% (2.5 מיליליטר x 0.5 = 1.25 מיליליטר מים nuclease חינם אז 2.5 מיליליטר + נפח המימי 1.25 מיליליטר = 3.75 מיליליטר חדש אז 3.75 מיליליטר x 1.25 = 4.7 מיליליטר אתנול 100%). שלב זה מאפשר לבידוד של רנ"א הכל, הכולל את החלק היחסי RNA הקטן. ניתן למצוא שיטה להשמיט RNA הקטן מהבידוד ב -17 במדריך.
      9. הסר את הבוכנה של מזרק 5 מ"ל ולהכניס מחסנית ספין במקומו. צרף את מכלול מחסנית / מזרק לסעפת ואקום. לחיבור מאובטח יותר לסעפת הוואקום, למקם את מכלול מחסנית / מזרק בתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם התחתית מנותקת.
      10. החל המדגם מהצעד 5.3.8 למחסנית הספין לאט עם הוואקום ב, הוסיף בזהירות יותר מדגם כפי שהוא משך במחסנית.
        הערה: אם אין ואקום הואהווה, ראה שיטת צנטריפוגה בhttp://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf.
      11. העבר את מחסנית הספין לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהוסיף 750 μl של שטפי 1. צנטריפוגה מחסנית ספין / הרכבה צינור 5 - שניות 10 ב 12,000 x ז.
      12. מחק תסנין מהצינור ולהחזיר את מחסנית הספין לאותו הצינור microcentrifuge.
      13. להוסיף 750 μl של לשטוף 2 ו צנטריפוגות מחסנית ספין / צינור ל5 - 10 שניות ב12,000 x ז. מחק תסנין כמו בשלב 5.3.12. החזר את מחסנית הספין לאותו הצינור microcentrifuge.
      14. חזור עם עוד 750 μl של לשטוף 2 וצנטריפוגה כמו בשלב 5.3.13. תסנין מחק. החזר את מחסנית הספין לאותו הצינור microcentrifuge. צנטריפוגה מחסנית ספין / צינור במהירות מרבי דקות 1 לייבש את המסנן.
      15. העבר את מחסנית הספין לטרי, שכותרתו 1.5 צינור microcentrifuge μl.
      16. הוסף 200 μl של nuclease ללא 0.1 מ"מ EDTA (שחומם מראש ל 80 & #176; ג) למרכז של מסנן מחסנית ספין (2 לכל משתתף). לדגור על RT דקות 1.
      17. צנטריפוגה דקות 1 ב XG 12,000 לelute RNA. שמור את התסנין. בטל מחסנית ספין.
      18. פיצול כל תסנין 200 μl לשתיים, 100 aliquots μl לתוך צינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge טריים, תווית ולשמור על קרח. בשלב זה, מתחיל עם 2 מסננים למשתתף יניב ארבעה 100 aliquots μl של רנ"א למשתתף.
    4. טיפול DNase (1 שעה)
      הערה: לפרטים נוספים על טיפול זה ראו פרוטוקול של היצרן 18.
      1. צור תערובת אמן על ידי שילוב של 10 μl של DNase אני הצפת ו -2 rDNase μl אני לaliquot 1 + (לחשבון pipetting שגיאה).
        הערה: ארבע דוגמאות, 100 aliquots μl להשתמש I. DNase אני הצפת rDNase μl + 10 50 μl
      2. Aliquot 12 μl של מיקס מאסטר בצעד 5.4.1 לכל אחד מaliquots RNA מצעד 5.3.18 ומערבבים בעדינות. לדגור על 37° C למשך 30 דקות בתוך גוש חום.
      3. מערבולת DNase האיון מגיב ולהוסיף 11.2 μl לכל aliquot, ומערבב היטב. לדגור על RT עבור 2 דקות vortexing 2-3 פעמים במהלך דגירה.
      4. צנטריפוגה ב 10,000 XG ב -1.5 דקות.
      5. מעבירים את supernatant (RNA) לצינור 1.5 מיליליטר טרי. Aliquots מאותו המשתתף יכול להיות נקווה כאן.
      6. הפעל כל דגימה על ספקטרופוטומטר כדי לקבל את הריכוז. ניתוח איכות של RNA מומלץ באמצעות Bioanalyzer (ראה שלב 5.5).
      7. Aliquot RNA לcryovials כרצוי. אם ניתוח Bioanalyzer לא יבוצע מייד, aliquot 1.5 μl של מדגם לתוך צינור microcentrifuge לניתוח מאוחר יותר. לתעד את הריכוזים ואת שעת התחלת מקפיא. דגימות חנות ב -80 ° C.
    5. ניתוח bioanalyzer (1 שעה)
      1. עקוב הפרוטוקול של היצרן 19. כאשר הריצה תושלם, הנתונים מאוחסנים באופן אוטומטי, אלא לשמור אותו שוב wה- i שם קטן יותר, מוכר יותר קובץ. תוצאות צפויות (איור 3): הסולם צריכים 6 פסגות, דגימות צריכה 3 פסגות (2 פסגות ריבוזומלי 44 שניות ו -50 שניות, בהתאמה ושיא סמן מוקדם 1 ב 25 שניות).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    זה חיוני כי ההליך הכולל לייצר חומר באיכות גבוהה לניתוח במגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים ביטוי גנים באמצעות microarray וניתוח RT-PCR, זיהוי של שינויים אפיגנטיים, ווריאציות משנה תא. טבלת 1 מציינת את התפוקה ואיכות הממוצעת של חומרים מכל אחד מהתהליכים. איור 3 מספק דוגמא של הפלט באיכות של שיטות עיבוד RNA בידוד יקוציט ומסנן. התמונה מהשמאל העליון של איור 3 היא תמונת ג'ל אלקטרופורזה נובעת מהנימים. כל מסלול צריך לייצר שתי להקות שונות עם הצללה מינימאלית המצביע השפלה. Chromatograms מתחת לג'ל מספק מבט נוסף ברמה והסוג של השפלה שניתן לקבוע על סמך המיקום והגודל של הפסגות. RNA היושרה מספר (רין) הוא מדד אחר איכות שנע בין 1 (נמוך; מושפל) ל10 (גבוה;, RNA הטהור באיכות טובה).

    המתודולוגיה תפוקה גבוהה כגון משאילה את עצמו לשגיאה מדי פעם, אבל יש כמה מחסומים בשלבים השונים של עיבוד כדי להבטיח בקרת איכות. איור 2 מציגה את ההפרדה הראויה הבא צנטריפוגה של Vacutainer מכיל Ficoll. ישנן מספר סיבות Vacutainer עלול שלא להציג הפרדה זו כולל שגיאה במהירות צנטריפוגה, נמוך אוסף נפח, או חוסר משתתף צום כפי שצוין בטבלה 2.

    תת (n = 100) של הדגימות מבודדות באמצעות הליך זה כבר נותח בהצלחה על ידי HumanMethylation27 (HM27) BeadChips ניתוח DNA כולל אימות של תוצאות אלה על ידי pyrosequencing 11. Genotyping, ממוקד pyrosequencing bisulfite, וזמן אמת RT-PCR שבוצע בהצלחה ובוילדמן ואודין מעבדות 20,21,22,23. סרום, מבודד בסעיף allel עם בידוד DNA לשני Beadchip וgenotyping ניתוח, נותח בהצלחה לIL-6 ו- C-reactive פעילות חלבון 24. תת תא T מPBMCs המבודד כבר נותחו בהצלחה על ידי cytometry זרימת 25-28. בנוסף, RNA מהליך יקוציט שונה כבר נתון הגנום ביטוי גנים רחב פרופיל 29.

    איור 2
    איור 2. הפרדת שכבה הבאה צנטריפוגה של Vacutainer מכיל Ficoll. הדמיה של ההפרדה של רכיבי דם מרובים הבא צנטריפוגה. שכבת mononuclear היא מטוהרים נוספים בעוד השכבות האחרות מאוחסנות ב -80 ° C. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    "Jove_content" FO: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 3
    תוצאות איור 3. צפויות מעיבוד RNA יקוציט. תוצאות Bioanalyzer מוצגות שתי להקות שונות המייצגות RNA ריבוזומלי 18S ו -28 עם מספרי שלמות RNA (RINs) מעל 8 מבודדים עם שיטות עיבוד RNA בידוד יקוציט תאר ומסנן (ראה פרוטוקול 3.6 ו -5.3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    תשואה ממוצעת כוללת (N≈500) איכות ממוצעת
    נַסיוֹב 2.30 מיליליטר N /
    ה- DNA מכל דם 39.97 מיקרוגרם הספיגה ב 260/280 = 1.74
    PBMC 22,250,000 תאי קיימא בכדאיות 95% לפחות של בידוד כולל
    RNA מLeukocytes 44.09 מיקרוגרם הספיגה ב 260/280 = 2.01
    RNA היושרה מספר (רין) = 6.48

    תשואות טבלה 1. צפוי. כמות ממוצעת ואיכות של דגימות מעובד בשיטות שתוארו.

    בְּעָיָה פתרון אפשרי
    אין הפרדה לאחר צנטריפוגה Vacutainer מכילה Ficoll Vacutainer לא מלא עד אפס מקום - מינימום אוסף הנפח לעיבוד נאות הוא 6 מיליליטר.
    בדוק את הגדרות צנטריפוגות, להיות בטוח במהירות היא בז-כוח. אם שגוי, מוגדר ז-כוח וrespin.
    שיתוף PBMC נמוךUNT נפח דם לצייר נמוך מדי.
    להישאף קרוב מדי לגלולה בשלב 3.7.8
    משתתף שאינו בצום.
    אין הפרדה לאחר צנטריפוגה Vacutainer הסרום בדוק את הגדרות צנטריפוגות, להיות בטוח במהירות היא בז-כוח. אם שגוי, מוגדר ז-כוח וrespin.
    ריכוז בלתי צפוי באמצעות Nanodrop 1,000 ודא המדידה היא לסוג המדגם המתאים (למשל, ה- DNA או RNA).

    טבלת 2. פתרון בעיות. בעיות נפוצות נתקלו בשיטות שתוארו ופתרונות אפשריים.

    לוח S1
    גיליון משלים טבלת 1. מעקב. דוגמא למעקב vacutainers הלוך ושובמ 'איסוף דם למסירת מעבדה. אנא לחץ כאן לצפייה בטבלה זו.

    הטבלה S2
    יומן משלים טבלת 2. דגימה. דוגמא של המסמך המשמש לתיעוד העיבוד של vacutainers עם מסירה למעבדה. אנא לחץ כאן לצפייה בטבלה זו.

    שולחן S3
    3. מערכת לוח משלים cryovial מספור. דוגמא לשיטת המספור המשמשת לכל משתתף. אנא לחץ כאן לצפייה בטבלה זו.

    מידע משלים פרטי עיבוד מקדימים 1.. פרטי חובותיו של מתאם המחקר, השליח וPhlebotomist. אנא לחץ כאן לצפייה במידע משלים 1.

    איור S2
    מידע משלים 2. מתכונים. רשימה של מתכונים לחומרים כימיים הדרושים. אנא לחץ כאן לצפייה במידע משלים 2.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    יש לנו תיארנו פרוטוקול יעיל שיושם בהצלחה לעבד יותר מ -1,600 דגימות דם כל במחקר בריאות דטרויט השכונה. למרות שרבים מטכניקות אלה זמינים בספרות הקיימת, האוסף שלנו צעד-אחר-צעד, כוללים שינויים בעיתוי מדויק בין כל שלב, משקף פרוטוקול מותאם, יעיל שמייצר בהצלחה מגוון רחב של דגימות ביולוגיות עם מגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כולל מתילציה DNA, ביטוי mRNA וניתוח חיסוני. דגימות אלה כבר נבדקו במגוון רחב של ניסויים, תוצאות שפורסמו בספרות ביקורת עמיתים ו / או הוצגו בפגישות לאומיות 11,20,21,23,24,29. פרוטוקול זה צריך להיות כך עניין לחוקרים אחרים המבקשים לאסוף דגימות ביולוגיות במחקרים מבוססים-אוכלוסייה דומה לDNHS.

    בעת עיבוד דגימות בגבוהה throughp כזהאופן ut, זה הוא בעל חשיבות עליונה לשמירה על רישומים מדויקים בכל השלבים. אנו ממליצים לפתח מסד נתונים כדי לאחסן את כל מידע cryovial בהתחלה. מאגר זה צריך לכלול את כל ההיבטים של המדגם בתוך כל cryovial כולל נפח, ריכוז, איכות, ברקוד, ומיקום אחסון (מספר תיבת אחסון ומיקום בתוך התיבה). אנו ממליצים הכנת cryovials מראש שכותרתו וקופסות אחסון המכילות ברקוד. יתר על כן, יש לנו מצאנו אותה נוח לי מסמך "אמן" המכיל את ברקודים לכל צינור, ספציפיים לכל משתתף (הטבלה S3). זה מאפשר הזנה מהירה של נתונים cryovial לתוך מסד הנתונים ללא טיפול מופרז של הדגימות, מציג מחזורי הקפאה / הפשרה מיותרות לדגימות ומבטל את הפוטנציאל לטעויות אנוש בהזנה ברקודים ידנית. כמו כן הוא חיוני כי התוויות לדבוק בקיצונית (למשל, שלב אדים של חנקן נוזלי -178 ל-150מעלות צלזיוס) בטמפרטורות. התיעוד יכול להיות זמן רב, ועם הצורך של עיבוד יעיל עם מסירה, מצאנו כי לפחות שני טכנאים שיש לחלק את התהליכים מייצר את היעילות הגדולה ביותר.

    מגבלה של שיטה זו היא הקרבה של המעבדה לאתר האוסף. לבידוד PBMC בפרט, הדגימות חייבות להיות מעובד בשעה 2 של אוסף, כדי למנוע עלייה משמעותית בזיהום של תאי דם אדום וירידה בתאי mononuclear קיימא. ככזה, המעבדה צריכה להיות לא יותר מ -30 דקות מאתר אוסף לחשבון לנושאים הקשורים כל תנועה שעלולה להתעורר. בנוסף, כל מעבדה מציעה לבצע את הפרוטוקול המתואר כאן ידרוש שני טכנאים על יד כדי להבטיח עיבוד מדגם אופטימלי. יתר על כן, חייבת להיות כל מעבדה גישה לציוד הנדרש לכל שלב שתואר לעיל. כך, מעבדות עם פחות עובדים ו / או ציוד מוגבל wולד סביר שלא תוכל לבצע פרוטוקול זה.

    יתרון של פרוטוקול זה הוא היכולת לאסוף דגימות ישירות בבתיהם של אנשים שהסכימו. זה מאפשר מחקר כדי להגיע לאנשים עם בעיות נפשית או אחרת בריאות שלא היה בדרך כלל לפנות לעזרה רפואית, אולי בגלל חוסר ביטוח או תחבורה. זה גם מאפשר השוואה של אנשים מושפעים ויושפעו חיים בתוך אותה הקהילה שחוו גורמים דומים, אך שונות במונחים של הסימפטומים בריאות הנפש שלהם. קבלת דגימות באופן זה דורש תזמון ותיאום מדויקים של מתרימי דם בתחום. בגלל המעבדה שלנו הייתה ממוקמת בקהילה היינו לומדת, phlebotomist יכול בדרך כלל לאסוף דגימות 2-3 בתים ולספק דגימות למעבדה בתוך חלון שעה 2 של האוסף הראשון. היעילות היא מפתח לעיבוד המדגם שלנו, ובתור שכזה, היה לנו מתרימי דם מרובים בשדה, מגביר את הצורך בתיאום מדויק. המעבדה קיבלה משלוחי דם מרובים עם עד שמונה משתתפים למסירה במרווחים 2 שעות זה מזה. מתרימי הדם נפגשו במיקום מיועד ושילוב האוספים שלהם רק עם אחד phlebotomist מספק דגימות למעבדה כתצווה אחת. השיטות שתוארו כאן יכולות בקלות להיות מותאמות ללמוד רבים פנוטיפים אחרים ודגימות הביולוגיות שנאספו ניתן להשתמש במגוון רחב של מבחני במורד הזרם.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Day 1: DNA isolation
    Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P5493-1L Day 1: PBMC isolation
    5 ¾” Pasteur pipets Fisher 13-678-6A Day 1: PBMC isolation
    Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated Life Technologies 10082147 Day 1: PBMC isolation
    Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-500ml Day 1: PBMC isolation
    RPMI Medium 1640, liquid Invitrogen 11875119 Day 1: PBMC isolation
    0.4% trypan blue stain  Invitrogen T10282 Day 1: PBMC isolation
    Countess Cell Counting Chamber Invitrogen C10283 Day 1: PBMC isolation
    Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer Invitrogen C10281 Day 1: PBMC isolation
    LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit  Ambion 1933 Day 1: Leukocyte RNA isolation
    25 G x 5/8 in. needles Becton Dickinson 305122 Day 1: Leukocyte RNA isolation
    Syringes (5 ml) Becton Dickinson 309646 Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation
    Denaturing Lysis Solution  Ambion 8540G Day 2: Leukocyte RNA isolation
    5 M NaCl Life Technologies 24740011 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    TRI Reagent Ambion 9738 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    Bromo-3-chloro-propane (BCP) Sigma B-9673 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    spin cartridges  Ambion 10051G Day 2: Leukocyte RNA isolation
    0.1 mM EDTA Ambion 9912 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    DNA-free Kit Ambion AM1960 Day 2: DNase treament
    RNA 6000 Ladder  Agilent 5067-1529 Day 2: Bioanalyzer analysis
    RNA 6000 Nano Series II Kit  Agilent 5067-1511 Day 2: Bioanalyzer analysis
    RNaseZAP Ambion AM8782 Day 2: Bioanalyzer analysis
    Ethanol >99% Sigma E7023-500ml
    Isopropanol >99%  Sigma I9516-500ml
    Nuclease-free ultra pure water  Invitrogen 9938
    Pipette tips (nuclease-free) Eppendorf 22491253
    Pipetter (serological) Eppendorf 2223020-4
    Pipetters (for volumes under 1 ml) Eppendorf 3120000-054
    Pipettes (serological) Fisher 13-678-27E
    Controlled rate freezing containers Nalgene 5100-0001
    Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) Fisher 03-395-464
    Test tube rack Thermo Scientific 14-804-134
    15 ml polypropylene tubes Fisher 14-959-49D
    1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes Fisher 07-200-534 and 07-200-185
    2 ml and 5 ml cryovials Fisher 10-500-26 and 10-269-88F 
    8 ml CPT vacutainer BD Biosciences 362761 2 tubes
    6 ml K2 EDTA vacutainer BD Biosciences 367863 2 tubes
    8.5 ml SST vacutainer BD Biosciences 367988 1 tube
    Vortexer Fisher 2215365
    Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes Fisher 11-715-1250
    Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood Fisher 01-257-87
    Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid Eppendorf 22637002
    Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes Eppendorf 22628157 2, one does not need to be refrigerated
    Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device Fisher 13-400-411
    Agilent Bioanalyzer Agilent Technologies G2940CA
    Liquid nitrogen tank Thermo Scientific 11-676-56
    Sharps container Fisher 22-037-970
    Biological waste container Thermo Scientific 1223P52
    Biosafety Level 2  certified cell culture hood Thermo Scientific 13-261-315

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
    2. Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
    3. Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
    4. Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
    5. Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
    6. Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
    7. Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
    8. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
    9. Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
    10. Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
    11. Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
    12. Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
    13. Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
    14. Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
    15. Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
    16. Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
    17. Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
    18. Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
    19. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
    20. Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
    21. Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
    22. Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
    23. Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
    24. Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
    25. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
    26. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
    27. Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
    28. Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
    29. Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).

    Tags

    רפואה גיליון 105 בידוד PBMC כל דם בידוד DNA RNA בידוד מחקר מבוסס-קהילה הגדרה שאינה קלינית
    פלזמה מהירה ובידוד של מרכיבי דם שלמים בדגימות שהתקבלה מהגדרה מבוססת-קהילה
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weckle, A., Aiello, A. E., Uddin,… More

    Weckle, A., Aiello, A. E., Uddin, M., Galea, S., Coulborn, R. M., Soliven, R., Meier, H., Wildman, D. E. Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting. J. Vis. Exp. (105), e52227, doi:10.3791/52227 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter