Abstract
Indsamling og behandling af fuldblodsprøver i en ikke-kliniske omgivelser giver en enestående mulighed for at evaluere community-bolig individer både med og uden allerede eksisterende forhold. Hurtig behandling af disse prøver er afgørende for at undgå nedbrydning af vigtige cellulære komponenter. Inkluderet her er metoder til samtidig perifere mononukleære celler (PBMC), DNA, RNA og serum isolation fra en enkelt blodprøve udført i hjemmene af samtykkende deltagere på tværs af et storbyområde, med behandling påbegyndes inden for 2 timer for indsamlingen. Vi har brugt disse teknikker til at behandle over 1.600 blodprøver giver ensartet, høj kvalitet materiale, som efterfølgende er blevet brugt i en vellykket DNA-methylering, genotypning, genekspression og flowcytometri analyser. Nogle af de anvendte metoder er standard; Men når de kombineres på den beskrevne måde, de gør det muligt effektiv behandling af prøver af deltagere fra befolkningsbaserede og / eller community-baserede undersøgelser, der normalt ikke ville blive evalueret i en klinisk indstilling. Derfor er denne protokol har potentialet til at få prøver (og senere data), som er mere repræsentative for den almindelige befolkning.
Introduction
Flere undersøgelser har karakteriseret forskelle i genekspression, DNA-methylering og celledelmængde i blod blandt individer med og uden mentale (eller andre) sygdomme 1-4. Disse undersøgelser har dog stammer fra kliniske hvor sygdomsassocierede forskelle kan blive forstørret på grund af den generelt mere alvorlige karakter af de sygdomme, hvor patienterne søger behandling. På grund af fremskridt i "omik" tilgange, har det seneste årti set en eksplosion af interesse i at opnå biologiske prøver fra fællesskabet og / eller epidemiologiske indstillinger 5-7, for at give populationsbaserede skøn over prævalens sygdom og et bredere billede af miljømæssige determinanter for disse mentale og / eller fysiske sygdomme.
En central udfordring i denne forbindelse er kravet om hurtig behandling af de indsamlede prøver. Nedbrydning af mononukleære celler, centrale immune systemkomponenter, som Frequently anvendes til at vurdere sundheden for en person, begynder straks efter blod uafgjort med et signifikant fald i bedring efter 2 timer for indsamlingen 8-10. For at løse denne udfordring, præsenterer vi en optimeret protokol, hvor flere komponenter af humant fuldblod samtidig isoleret fra prøver opnået i hjem af motiver, der bor i et stort byområde. Protokollen er baseret på vor udarbejdelse og ændring af de nuværende teknikker, herunder opbevaring af alle "ekstra" fraktioner i tilfælde fremtidige teknikker gør det muligt for yderligere isolering / analyser. Mens alternative metoder eller kits kan anvendes i stedet for de enkelte metoder er beskrevet her, der er skitseret har vist sig at være en pålidelig og effektiv middel til behandling af prøver i en high-throughput måde. Høj kvalitet fraktioner (PBMC'er, DNA, serum, og RNA) af frisk blod kan produceres inden for 2 timer for indsamling og alle assay-ready prøver kan være til rådighed inden for 2 dage (figur 1).
Denne protokol blev udviklet for at muliggøre effektiv behandling af prøver indsamlet fra community-bolig, voksne beboere i byen Detroit til test i Detroit Neighborhood Health Study (DNHS, DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), en befolkning-baseret undersøgelse af de sociale og biologiske determinanter af post-traumatisk stress disorder (PTSD) og andre psykiske sygdomme. Forekomsten af PTSD i Detroit er mere end det dobbelte af landsgennemsnittet 11,12. Identificering af biologiske determinanter for PTSD i denne population, kan bidrage til at udvikle passende farmakologiske og / eller kognitive adfærdsterapi interventioner for at hjælpe dem, der lider af sygdommen, både i dette bybefolkningen, og i andre højrisiko-populationer (f.eks returnering militære veteraner). Vores laboratorium, der tidligere placeret på Wayne State University i Detroit, Michigan, blev udvalgt til forarbejdning baseret på vores ekspertise i håndtering af friske vævsprøver stammer fra en rækkekilder, på nødvendigheden begynde at behandle prøverne inden 2 timer for indsamling, og vores nærhed til indsamlingssteder. Med denne enestående mulighed ved hånden, vores mål var at optimere behandlingen for størst udbytte af DNA, RNA, serum og perifere mononukleære celler (PBMC'er) fra hver prøve (i alt N = 1.639 prøver over 5 bølger af prøvetagning). Procedurerne beskrevet her, kan udføres samtidig i en ikke-kliniske omgivelser, hvorved der frembringes udgangsmateriale (se tabel 1 for gennemsnitlige udbytter) for et væld af downstream applikationer, herunder microarray, epigenetisk, real-time RT-PCR, og flowcytometri-analyse.
Figur 1. Samlet arbejde flow. Den overordnede proces afbildet her omfatter logistikken i at opnå de blodprøver fra at identificere samtykke participants til blodet tegne sig selv. Høj kvalitet, fraktioner (perifert blod mononukleære celler; PBMC'er, DNA, serum, og RNA) af frisk fuldblod kan produceres inden for 2 timer for indsamling og alle assay-ready prøver kan være til rådighed inden for 2 dage. Desuden er de fraktioner, der tilberedes ved denne fremgangsmåde er egnede til langtidsopbevaring, hvis prøverne ikke skal testes umiddelbart. Hele tidslinje her skitserede kunne gennemføres på en enkelt dag (~ 5 hr alt). Imidlertid ville en sådan dag være yderst arbejdskrævende især for en enkelt tekniker med en betydelig erfaring med de teknikker. Således anbefaler vi dividere procedurerne på dag 1 mellem mindst to teknikere og færdiggøre RNA behandling på dag 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detroit Neighborhood Health Study blev gennemgået og godkendt af University of Michigans Institutional Review Board. Alle deltagere forudsat informeret samtykke forud for deltagelsen i undersøgelsen.
1. Oversigt
- Korrekt dokumentere alle faser fra rekruttering gennem analyser af endpoint data. Udfør protokollerne på dag 1 samtidigt, skifte etaper og overlappende som tiden tillader. Sekvensen af trin er skrevet for at optimere ydeevnen effektivitet. Figur 1 giver et overblik over hele processen.
Bemærk: Udtrykket, "deltager" anvendes hele til at betyde de-identificerede blodprøve taget fra en samtykkende individ. Tiderne i parentes nedenfor angiver hands-on tid. Eksempler på sporing plader og prøven log kan findes i supplerende tabeller S1 og S2 henholdsvis. Prøver indsamlet af laboranter i boligerindivider identificeret som samtykke deltagere i undersøgelsen koordinator og transporteres til laboratoriet ved en kurer (se supplerende oplysninger (SI) 1 for yderligere oplysninger før behandling).
2. Dag 1 Opsætning
- Forbered 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
- Forvarm en varme blok til 56 ºC.
- Forbered protease (se SI 2) ved alikvotere 20 ul i et passende antal mikrocentrifugerør til dagens leverancer (2 per deltager).
- Sikre Buffer AW1 og AW2 (vask buffere leveres i DNA isolation kit, der øger renheden af DNA) er klar til brug, tilføjer 100% ethanol som angivet på etiketten, hvis det er nødvendigt.
- Køle ned kølecentrifuge til 4 ° C.
- Sæt hætten på flaske 1x PBS med det medfølgende gummiseptum hætte og gennembore gummiskillevæg med en overføringspig, bevarer skruelåget på toppen af overførslen SPIke for at forhindre fordampning. Gentag med flaske RNA stabilisering opløsning.
- Efter fremstilling af buffere, centrifuge og varmeblok, dokumentere tidspunktet for Vacutainer levering på prøven sporing ark (se tabel SI).
3. Dag 1: Behandling fuldblodsprøve for DNA, PBMC'er og leukocyt-RNA (2 timer)
- Oversigt
- Sætte tilstrækkelig tid til at minimere forsinkelsen mellem blodprøve og behandling starttidspunkt. Begynd behandling af Ficoll indeholder vakuumbeholdere inden 2 timer for blodudtagning at undgå en stigning i kontaminering af røde blodlegemer og et fald i mononukleære celler nyttiggørelse.
- Antag samling af 2 vakuumbeholdere indeholdende Ficoll gradient gel, 2 K 2 ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) vakuumbeholdere, og 1 serum vacutainer per voksen deltager. Ved levering af vacutainere til laboratoriet, har en tekniker underskrive sporing ark tilkendegiver accept af prøverne. Tiggei behandlingen straks med starttidspunktet dokumenteret på en per vacutainer grundlag prøven log.
- Serum Isolation Trin 1 (1 min)
- Dokumentér starttiden på prøven log (se tabel SI 2). Der centrifugeres (med bremse og acceleration OFF) for 7,0 ml serum (rød) vacutainer (1 per deltager) ved hjælp af en svingende spand rotor med aerosol hætter (biosikkerhed niveau 2 BSL2 certificeret) i 20 min, 1.300 xg, 4 ºC.
- DNA Isolation Trin 1 (15 min)
Bemærk: For yderligere oplysninger om denne isolation procedure, se producentens protokol 13.- Dokument starttidspunktet. I en BSL2 cellekultur hætte, invertere vakuumbeholdere indeholdende Ficoll gel 5 gange tilsæt derefter 200 pi helblod fra toppen af en af de vakuumbeholdere i hver af to 20 pi alikvoter af protease (400 pi total per deltager). Forlader protease + blod mikrocentrifugerør i hætten, fortsætte til centrifugation af Ficoll indeholder vakuumbeholdere i trin 3.4.1.
Bemærk: Brug vacutainer med den største samling volumen, under hensyntagen til den nødvendigheden af at balancere centrifugen (dvs., kan det være nødvendigt at fjerne 200 pi fra hver af de to vacutainere) når at dreje vacutainere i trin 3.4.1. Derudover, for at sikre korrekt adskillelse under behandlingen af de blå vacutainere, bør niveauet af blod tilbage i vacutainer ikke være mindre end 2,5 inches over Ficoll lag.
- Dokument starttidspunktet. I en BSL2 cellekultur hætte, invertere vakuumbeholdere indeholdende Ficoll gel 5 gange tilsæt derefter 200 pi helblod fra toppen af en af de vakuumbeholdere i hver af to 20 pi alikvoter af protease (400 pi total per deltager). Forlader protease + blod mikrocentrifugerør i hætten, fortsætte til centrifugation af Ficoll indeholder vakuumbeholdere i trin 3.4.1.
- PBMC Isolation Trin 1 (1 min)
- Dokument starttidspunktet (skal være inden 2 timer af blod uafgjort for at undgå en stigning i forurening af røde blodlegemer og et fald i mononukleære celler opsving) .Invert den Ficoll indeholder vacutainere 8-10 gange. Der centrifugeres (med bremse og acceleration OFF) de vacutainere (2 per deltager) ved hjælp af en svingende spand rotor med aerosol hætter (BSL2 certificeret) i 30 minutter, 1.600 xg, 22 ° C.
- Retur til hætte og tilsættes 200 pi buffer AL til hver af protease + blod mikrocentrifugerør (trin 3.3.1). Cap, fjerne fra hætte, vortex 15 sek og flash spin.
- Inkuber 56 ºC i en varme blok, 10 min.
- Fjern rørene fra varmeblokken. Flash spin. Retur til BSL2 hætte. Tilføj 200 pi 100% ethanol. Cap, fjerne fra hætte, vortex 15 sek og flash spin. De resterende trin kan afsluttes uden for hætten.
- Anvend lysat (inden for 30 min i trin 3.5.3) til en mærket spinkolonne (i et 2 ml opsamlingsrør). Luk hætten for at undgå krydskontaminering via aerosoler. Centrifuger 6.000 xg, 1 min.
- Kassér opsamlingsrøret indeholdende filtrat og placere spinkolonne i en ny 2 ml opsamlingsrør.
- Tilføj 500 pi buffer AW1 til kolonnen uden fugtning fælgen, lukke låget og centrifuger 6.000 xg, 1 min.
- Kassér opsamlingsrøret indeholdende filtrate og placere spin søjle i en ny 2 ml opsamlingsrør.
- Tilføj 500 pi buffer AW2 til kolonnen uden fugtning fælgen, lukke låget og centrifuger 20.000 xg, 3 min.
- Kassér opsamlingsrøret indeholdende filtrat og placere spinkolonne i en ny 1,5 ml opsamlingsrør (ikke inkluderet i sættet), og centrifugeres 20.000 xg, 1 min.
- Kassér opsamlingsrøret indeholdende filtrat og placere spinkolonne i en ny 1,5 ml opsamlingsrør (ikke inkluderet i sættet).
- Tilsæt 200 pi buffer AE eller vand til hver søjle og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter. Centrifuger 6.000 xg, 1 min.
- Gentag trin 3.5.11 eluering i den samme opsamlingsrør.
- Pool det eluerede DNA fra de 2 kolonner per deltager. Samlet udbytte ~ 800 pi per deltager.
- Kvantificere prøverne ved hjælp af et spektrofotometer, når tiden tillader.
- Portion DNA som ønsket i 2 ml kryohætteglas, dokumenterer koncentrationen af hvert på specimen log. Overførsel kryoglas til et cryobox og sted ved -80 ° C til langtidsopbevaring. Dokument fryseren starttidspunkt.
Bemærk: Udfør i en biosikkerhedsniveau 2 certificeret cellekultur hætte. For yderligere detaljer om denne isolation se producentens anvisninger 15.
- Gennembore gummiskillevæggen af K2EDTA vacutainer med en overføringspig. Behold skeden og skruelåg til brug i trin 3.6.11. Efter BSL2 standard praksis, sørge for at undgå udsættelse for blodbårne patogener.
- Fastgør hvid begitning stik til toppen af overføringspig.
- Mærk filteret med den tilsvarende deltager id tilslut derefter indløb (tragtformede ende) af filteret til det hvide slip stik.
- Vedhæfte en beklædt 25⅝ G nål til udløbet (tilspidsede ende) af filteret. Forberedelse af filterenheden før levering fremskynder processen betydeligt, og derforfastgørelse af hvide slipkobling til overføringspig, tilsætning af filteret, så skaftet nål og indstilling af samlingen i en kultur rør rack indtil brug, anbefales.
- Efter samling af K2EDTA rørsystem, sikkert unsheathe nålen (brug slutningen af en metalspatel). Stikke nålen ind i en tom 10 ml evakueret blodtapning rør (serum receiver rør), og vend K2EDTA vacutainer / filter / modtager rør forsamling. Efter BSL2 standard praksis, sørge for at undgå udsættelse for blodbårne patogener.
- Lad blodet filtreres gennem indtil de kileformede sektioner af filteret er renset for blod. Filtrering tager omkring 2 minutter og kan placeres i et reagensglas rack under filtrering.
- Fjern filteret fra forsamlingen. Lad nålen i rør indeholdende filtratet og kassér hele samlingen i en Sharps beholder.
- Vedhæft en 5 ml sprøjte til overføringspig på flaske 1x PBS, ivert flasken og trække 3 ml.
- Sæt sprøjten med PBS til indløbet af filteret og skyl filteret (3-5 dråber pr sekund). Saml gennemløbet i en biologisk affaldsbeholder. Tag sprøjten fra filteret uden at trække stemplet.
- Efter filtrering og en PBS vask, trække 3 ml af RNA stabiliseringsagent hjælp af en ny 5 ml sprøjte og beskrevet i trin 3.6.8 metode. Skyl filteret som i trin 3.6.9. RNA stabiliseringsagent bør forblive på filteret. Tag sprøjten fra filteret uden at trække stemplet.
- Seal filteret ind- og udløb med skeden og skruelåg bevaret fra overføringspig forlader filteret mættet med RNA stabilisering middel. Filteret kan opbevares på dette tidspunkt. Opbevar filteret ved -80 ºC, indtil tiden tillader (~ 2 timer) for at fuldføre trin 5.3 til 5.4.7.
Bemærk: Filtre opbevaret ved -80 ° C i op til et år efter samling er blevet forarbejdet uden decreaSe i RNA kvalitet.
- Fjern Ficoll indeholder vacutainere fra centrifugen (trin 3.4.1) og fortsætter i en BSL2 hætte. Vakuumbeholdere skal vise adskillelsen som vist i figur 2. Hvis ikke, se tabel 2.
- Når Vacutainer returneres til BSL2 hætte, fjerne proppen og trække 1,5 ml toppen, gullige, plasma lag (figur 2) ved anvendelse af en serologisk pipette uden at komme tæt på mononukleære (klar / hvid) lag. Overfør plasma til en 5 ml kryohætteglas - (Pool fra 2 vacutainere - 1 deltagende). Log den indsamlede mængde. Se trin 3.7.6 til opbevaring instruktioner.
Bemærk: Den bedste separation og største PBMC udbytter kommer fra deltagere, der har fastet i mindst 12 timer før blodprøvetagning. - Overfør det resterende plasma og hvidlige, mononukleare lag (alt over gellaget - figur 2) usynge en serologisk pipette til et 15 ml konisk rør, samle de mononukleare lag fra hver af de to Ficoll indeholdende vakuumbeholdere per deltager i en konisk rør.
- Tilføj 1x PBS til at bringe det totale volumen i konisk rør til 15 ml. Cap rør og invertsukker 5 gange. Centrifuge (med bremse og acceleration OFF) 15 min, 300 x g, 22 ° C.
- Retur til Ficoll indeholder vakuumbeholdere i hoved- og indsamle de røde blodlegemer (RBC) ved anvendelse af en 5¾ "Pasteur-pipette til at hvirvle rundt og løsne kanten af Ficoll gellaget og fjern den, hvis det er muligt. Brug en serologisk pipette til at indsamle og overføre RBC (~ 4,5 ml) til en 5 ml kryohætteglas. Log den indsamlede mængde.
- Overfør både 5 ml kryohætteglas (plasma i trin 3.7.2 og RBC i trin 3.7.5) til en kontrolleret hastighed frysning beholder og sættes på -80 ºC i mindst 24 timer, hvorefter de kan overføres til en cryobox og vendte tilbage til -80 ºC til langtidsopbevaring.
- Retur conisk rør til hætten, når centrifugeringen i trin 3.7.4 er færdig, og indsuge alle, men ~ 500 pi PBS uden at forstyrre pelleten. PBMC Udbyttet er større, hvis ~ 200 pi PBS efterlades over pelleten på dette stadium.
- Tilføj frisk 1x PBS til at bringe volumen til 10 ml. Resuspender pellet forsigtigt. Cap rør og invertsukker 5 gange. Centrifuge (med bremse og acceleration OFF) 10 min, 300 x g, 22 ° C.
Bemærk: Udfør i en BSL2 hætte.
- Alikvot det øverste lag serum fra serummet Vacutainer, efter centrifugering (trin 3.2.1), i 2 ml kryohætteglas som ønsket. Typisk udbytte er 2,5 ml (tabel 1). Log lydstyrken. Brug f.eks 4 kryohætteglas alikvotere 200 pi i kryohætteglas 1, 1.000 pi i kryohætteglas 2 og derefter opdele den resterende ind kryohætteglas 3 og 4.
- Overfør kryoglas til et cryobox og sted ved -80 ºC i langtidsopbevaring. Dokument start fryserentid.
- Retur til hætte, efter centrifugering (trin 3.7.8), og aspirat så meget supernatant / PBS som muligt uden at forstyrre pelleten. Resuspender pellet ved pipettering i 2,5 ml PBMC frysemedium 1 (se SI 2).
- Tilføj 2,5 ml PBMC frysemedium 2 (se SI 2) til celle / medium opløsning i trin 3.9.1. Vortex forsigtigt.
- Portion 10 pi af cellen opløsning i en 0,65 ml mikrocentrifugerør (yderligere fortynding kan være nødvendigt). Tilsæt 10 pi 0,4% trypanblåt plet i 0,65 ml mikrocentrifugerør og blandes ved pipettering flere gange. For yderligere detaljer se producentens manual 16.
- Pipetter 10 pi af blandingen i en celle tællekammer slide og sted glide ind i cellen tælleren inden for 3 minutter af blanding. Zoome ind og fokusere cellerne. Tryk på "Count Cells" for at opnå PBMC tælle.
- Portion, hvis levedygtigePBMC antallet er over 3 millioner celler per milliliter (mc / ml), som ønsket i kryoglas og fortsætte til trin 3.9.9. Store PBMC'er i op til 5 kryohætteglas ved en koncentration på mindst 3 mc / ml hver.
- Hvis det levedygtige PBMC nummer er under 3 mc / ml, beregne det samlede antal celler ved at multiplicere levedygtige mc / ml ved 5 ml. Dividere dette tal med 4, 3, 2 eller 1 ml, så der vil være mindst ét rør med 3 mc / ml.
- Centrifuger konisk rør indeholdende celler / frysemedium opløsningen i 5 minutter ved 300 xg (bremse og acceleration OFF). Efter centrifugering aspireres passende volumen af frysning medium (supernatant), der forlader volumen, beregnet ovenfor (4, 3, 2 eller 1 ml).
- Pellet resuspenderes i den resterende supernatant og alikvot mindst 3 mc / ml i et passende antal kryoglas (1-4) ved 1 ml / kryohætteglas. Endelige frysning medium er 10% dimethylsulfoxid (DMSO) / 20% kalvefosterserum (FBS) / 70% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
- Dokument celletallet pr kryohætteglas. Overfør kryoglas til en styret hastighed frysning beholderen og ved -80 ° C i mindst 24 timer, hvorefter de kryoglas kan overføres til en cryobox og sat i en flydende nitrogen tank (dampfase) til langtidsopbevaring. Dokument fryser starttidspunkt.
4. Dag 2 Opsætning
- Varm en portion (220 pi per filter) i nukleasefrit 0,1 mM EDTA i en nuklease-frit rør til 80 ° C i en varmeblok.
- Forbered vaskeopløsninger 1 og 2 (se SI 2).
5. Dag 2: Long Term Sample Opbevaring og leukocyt Filter Processing (3 timer)
- Oversigt.
- Udfør denne procedure inden for 6 måneder efter gennemførelsen af leukocytter til filteret.
Bemærk: Samlet set Dag 2 behandling tager omkring 3 timer og mens det er mærket "Dag 2", det vigtigste krav er, at filteret forarbejdning del bør udføres på en dag, hvorder er ingen Dag 1 behandling forekommer i laboratoriet.
- Udfør denne procedure inden for 6 måneder efter gennemførelsen af leukocytter til filteret.
- Langvarig prøveopbevaring (15 min)
- Udføre denne procedure hver dag, før leveringen af nye vakuumbeholdere til laboratoriet for dag 1 behandling. Overfør kryohætteglas der blev gemt O / N i kontrollerede sats indefrysning containere på dag 1 i passende mærkede cryoboxes og returnere dem til -80 ºC eller flydende nitrogen (dampfase) til langtidsopbevaring. Organiser de kryohætteglas baseret på prøvetype (f.eks, DNA, PBMC, RBC, etc.) for at fremskynde prøvested tracking for endpoint analyser.
- Leukocyt RNA Filtre Processing (45 min).
Bemærk: Yderligere oplysninger om denne procedure se producentens anvisninger 17.- Bring filteret til stuetemperatur (optøning ca. 5 min).
- Fjern hylsteret og skruelåg fra filteret. Træk stemplet af en 5 ml sprøjte og tilslut det til indgangen (tragtformede ende) af filteret, trykkes stempletat udvise RNA stabilisering agent fra filteret portene i en biologisk affaldsbeholder.
- Læg en ny 5 ml sprøjte med 4 ml af en phenol og guanidinisothiocyanat løsning til RNA isolering og fastgør den til indgangen af filteret, trykkes stemplet at skylle den løsning, gennem filteret, opsamling lysatet i en mærket 15 ml konisk rør (2 per deltager).
- Afbryd sprøjten fra filteret, trække stemplet, sætte den til filteret, og tryk stemplet at udvise resterende prøve fanget i filteret disk i de samme 15 ml konisk rør. Kassér filteret og sprøjte.
- Tilføj 800 pi BCP til den koniske rør, lukke røret stramt og energisk ryste prep i 30 sek.
- Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Centrifuger i 10 minutter ved 2.000 x g.
- Den vandige (top) fase overføres til en frisk mærket 15 ml konisk rør (~ 2,5 ml).
- Tilsæt 0,5 gange volumenet af den vandige fase af nuclease-frit vand end bland godt. Derefter tilsættes 1,25 x den vandige volumen på 100% ethanol og blandes igen.
Bemærk: For en 2,5 ml vandig volumen, tilsættes 1,25 ml nuklease frit vand, bland, tilsæt derefter 4,7 ml 100% ethanol (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml nuklease frit vand SÅ 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml nye vandigt volumen SÅ 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml 100% ethanol). Dette trin tillader isolation af total RNA, der omfatter den lille RNA-fraktionen. Fremgangsmåde at udelade de små RNA'er fra isoleringen kan findes i manualen 17. - Fjern stemplet fra en 5 ml sprøjte og indsætte et spin patron i dens sted. Fastgør patronen / monterede sprøjte til et vakuum manifold. For en mere sikker forbindelse til vakuummanifolden, placere patronen / sprøjtesamlingen i en 1,5 ml mikrocentrifugerør med bunden afskåret.
- Påføre prøven fra trin 5.3.8 til spin patronen langsomt med vakuum på, omhyggeligt at tilføje mere prøve, når den trækkes gennem patronen.
Bemærk: Hvis der ikke vakuum erstede, se centrifugering metoden ved http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf. - Overfør spin patron til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og der tilsættes 750 pi Wash 1. Centrifuger spin cartridge / rørsamling 5 - 10 sekunder ved 12.000 x g.
- Kassér filtrat fra røret og returnere spin patronen til samme mikrocentrifugerør.
- Tilføj 750 pi Wash 2 og centrifuger spin patron / rør til 5 - 10 sekunder ved 12.000 x g. Kassér filtrat som i trin 5.3.12. Retur spin patronen til samme mikrocentrifugerør.
- Gentag med en anden 750 ul Wash 2 og centrifugering som i trin 5.3.13. Kassér filtrat. Retur spin patronen til samme mikrocentrifugerør. Centrifuger spin cartridge / slange ved maksimal hastighed i 1 min for at tørre filteret.
- Overfør spin patron til en nyetiketteret 1,5 pi mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 200 pi nuclease-free 0,1 mM EDTA (forvarmet til 80 & #176; C) til centrum af spin patronfilter (2 per deltager). Inkuber ved stuetemperatur i 1 min.
- Centrifugeres i 1 minut ved 12.000 xg til eluering af RNA. Filtratet Bevar. Kassér spin-patron.
- Hver 200 pi filtrat delt i to, 100 pi prøver i frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør, etiket og holde på is. På dette tidspunkt vil der starter med 2 filtre per deltager gav fire 100 portioner af RNA per deltager pi.
- DNase-behandling (1 time)
Bemærk: For yderligere oplysninger om denne behandling se producentens protokol 18.- Opret en master mix ved at kombinere 10 pi DNase I buffer og 2 pi rDNase jeg pr portion + 1 (til betragtning ved pipettering fejl).
Bemærk: I fire prøver, 100 pi alikvoter bruger 50 pi DNase Buffer + 10 pi rDNase I. - Portion 12 pi af master mix i trin 5.4.1 i hver af RNA portioner fra trin 5.3.18 og blandes forsigtigt. Der inkuberes ved 37° C i 30 minutter i en varmeblok.
- Vortex DNase Inaktivering Reagens og tilføje 11.2 pi til hver portion, bland godt. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min vortexing 2-3 gange under inkubation.
- Centrifuger ved 10.000 x g i 1,5 min.
- Overfør supernatanten (RNA) til et frisk 1,5 ml rør. Portioner fra samme deltager kan samles her.
- Kør hver prøve på et spektrofotometer for at få koncentrationen. Der anbefales en kvalitetsanalyse af RNA ved hjælp af en Bioanalyzer (se trin 5.5).
- Alikvot RNA i kryoglas som ønsket. Hvis en Bioanalyzer analyse ikke vil blive udført med det samme, portion 1,5 pi prøve i et mikrocentrifugerør til senere analyse. Dokument koncentrationer og fryseren starttidspunkt. Opbevar prøver ved -80 ° C.
- Opret en master mix ved at kombinere 10 pi DNase I buffer og 2 pi rDNase jeg pr portion + 1 (til betragtning ved pipettering fejl).
- Bioanalyzer analyse (1 time)
- Følg producentens protokol 19. Når kørslen er færdig, bliver data automatisk gemt, men gemme den igen wed en mindre, mere genkendeligt filnavn. Forventede resultater (figur 3): stigen skal have 6 toppe, prøver bør have 3 toppe (2 ribosomale toppe ved 44 sek og 50 sek henholdsvis 1 og tidlig markør top ved 25 sek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er vigtigt, at den samlede procedure producere materiale af høj kvalitet til analyse i et væld af downstream-applikationer, herunder genekspression via microarray og RT-PCR-analyse, detektering af epigenetiske modifikationer, og celledelmængde variationer. Tabel 1 viser det gennemsnitlige udbytte og kvalitet af materialer fra hver af processerne. Figur 3 giver et eksempel på kvaliteten output af leukocyt RNA-isolering og filter forarbejdningsmetoder. Billedet øverst til venstre i figur 3 er gelbillede følge af kapillær elektroforese. Hver bane skal producere to forskellige bands med minimal skyggedannelse, som ville indikere nedbrydning. Chromatogrammerne under gelen give en ekstra kig på det niveau og typen af nedbrydning, som kan bestemmes baseret på placeringen og størrelsen af toppene. RNA Integritet Number (RIN) er en anden kvalitet foranstaltning, der går fra 1 (lav, nedbrudt) til10 (høj, rent, god kvalitet RNA).
Sådan en high-throughput metode egner sig til en lejlighedsvis fejl, men der er flere checkpoints i hele de forskellige stadier af behandlingen for at sikre kvalitetskontrol. Figur 2 viser den rigtige separation efter centrifugering af Ficoll indeholder vacutainer. Der er flere grunde en vacutainer kan ikke vise denne adskillelse, herunder en fejl i centrifugering hastighed, lav samling volumen, eller mangel på en fastende deltager som angivet i tabel 2.
Delmængder (n = 100) af prøver isolerede ved hjælp af denne procedure, er blevet analyseret med succes ved HumanMethylation27 (HM27) DNA-analyse BeadChips herunder validering af disse resultater ved at pyrosekventering 11. Genotypebestemmelse, målrettet bisulfit pyrosekventering, og real-time RT-PCR er blevet positivt resultat i Wildman og Uddin laboratorier 20,21,22,23. Serum, isoleret i parlelt med DNA-isolering for både Beadchip og genotypebestemmelse analyser blev med succes analyseret for IL-6 og C-reaktivt protein-aktivitet 24. T-celle-undergrupper fra de isolerede PBMC'er med succes er blevet analyseret ved flowcytometri 25-28. Derudover har RNA fra den modificerede leukocyt procedure blevet underkastet genom genekspression profilering 29.
Figur 2. Lagseparation efter centrifugering af Ficoll indeholdende vacutainer. En visualisering af adskillelsen af flere blodkomponenter efter centrifugering. Det mononukleære lag er oprenses yderligere, mens de andre lag opbevares ved -80 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Forventede resultater fra leukocyt-RNA behandling. Bioanalyzer resultater viser to forskellige bands, der repræsenterer 18S og 28S ribosomale RNA med RNA integritet numre (Rins) over 8 isoleret med de beskrevne leukocyt-RNA isolation og filter forarbejdningsmetoder (se protokol 3.6 og 5.3). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Samlet Gennemsnitlig Udbytte (N≈500) | Gennemsnitlig Kvalitet | |
| Serum | 2,30 ml | N / A |
| DNA fra helblod | 39.97 pg | Absorbans ved 260/280 = 1,74 |
| PBMC | 22.25 millioner levedygtige celler | Mindst 95% af den samlede rentabilitet isolation |
| RNA fra Leukocytter | 44.09 pg | Absorbans ved 260/280 = 2,01 RNA Integritet nummer (RIN) = 6.48 |
Tabel 1. Forventede udbytter. Gennemsnitlig mængde og kvalitet af prøver behandles ved hjælp af de beskrevne metoder.
| Problem | Mulig løsning |
| Ingen adskillelse efter Ficoll indeholdende Vacutainer centrifugering | Vacutainer er ikke fyldt til bristepunktet - den mindste samling volumen for en passende behandling er 6 ml. |
| Kontroller centrifuge indstillinger, skal du sørge for hastigheden er i g-force. Hvis forkert, indstillet til g-force og respin. | |
| Lav PBMC coUNT | Blodvolumen trækker for lavt. |
| Aspireret for tæt på pelleten i trin 3.7.8 | |
| Ikke-fastende deltager. | |
| Ingen adskillelse efter serum vacutainer centrifugering | Kontroller centrifuge indstillinger, skal du sørge for hastigheden er i g-force. Hvis forkert, indstillet til g-force og respin. |
| Uventet koncentration ved hjælp af NanoDrop 1000 | Sørg for, at målingen er for den relevante prøvetype (fx DNA eller RNA). |
Tabel 2. Problemløsning. Almindelige problemer med de beskrevne metoder og mulige løsninger.
Supplerende Tabel 1. Tracking ark. Et eksempel på sporing af vacutainere from blodtapning til laboratorie levering. Klik her for at se denne tabel.
Supplerende tabel 2. Specimen log. Et eksempel på det dokument, der anvendes til at dokumentere behandlingen af vacutainere ved levering til laboratoriet. Klik her for at se denne tabel.
Supplerende tabel 3. kryohætteglas nummersystem. Et eksempel på nummereringssystem der anvendes for hver deltager. Klik her for at se denne tabel.
Supplerende oplysninger 1. forbehandling af detaljer. Detaljer hvervet som Study Coordinator, Courier og bioanalytikeren. Klik her for at se supplerende oplysninger 1.
Supplerende oplysninger 2. Opskrifter. En liste over opskrifter til de nødvendige reagenser. Klik her for at se supplerende oplysninger 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en strømlinet protokol, der er blevet anvendt med succes til at behandle mere end 1.600 fuldblodsprøver i Detroit Neighborhood Health Study. Selv om mange af disse teknikker er tilgængelige i den eksisterende litteratur, vores trin-for-trin indsamling, herunder præcist timede ændringer mellem hvert trin, afspejler en optimeret, effektiv protokol, som med succes producerer en række forskellige biologiske prøver med en bred vifte af efterfølgende anvendelser, herunder DNA-methylering, mRNA-ekspression og immunologisk analyse. Disse prøver er allerede blevet afprøvet i en række eksperimenter, resultater er blevet offentliggjort i peer-reviewed litteratur og / eller præsenteret på nationale møder 11,20,21,23,24,29. Denne protokol skal derfor være af interesse for andre forskere, der søger at indsamle biologiske prøver i populationsbaserede undersøgelser svarende til DNHS.
Hvis prøver analyseres i en så høj-throughput måde, er det af yderste vigtighed at foretage nøjagtige optegnelser i alle faser. Vi anbefaler, at udvikle en database til at gemme alle de cryovialet oplysninger i begyndelsen. Denne database skal omfatte alle aspekter af prøven inden for hver cryovialet herunder volumen, koncentration, kvalitet, stregkode, og opbevaring placering (opbevaringsboks nummer og placering i boksen). Vi anbefaler at forberede pre-mærkede kryoglas og opbevaringskasser, der indeholder en stregkode. Endvidere har vi fundet det praktisk at have en "master" dokument, der indeholder de stregkoder til hvert rør, der er specifikke for hver deltager (tabel S3). Dette muliggør hurtig indlæsning af de kryoglas data i databasen uden overdreven håndtering af prøverne, at indføre unødvendige fryse / tø cykler til prøverne og eliminerer risikoen for menneskelige fejl i indtastning i stregkoder manuelt. Det er også vigtigt, at etiketterne klæber ved ekstrem (f.eks, dampe fase af flydende nitrogen -178 til -150ºC) temperaturer. Dokumentationen kan være meget tidskrævende, og nødvendigheden af effektiv behandling ved levering, har vi fundet, at der har mindst to teknikere opdele processerne frembringer den største effektivitet.
En begrænsning af denne metode er nærhed af laboratoriet til opsamlingsstedet. For PBMC isolering i særdeleshed, skal prøverne behandles inden 2 timer for indsamling for at undgå betydelige stigninger i forurening af røde blodlegemer og fald i levedygtige mononukleære celler. Som sådan bør laboratoriet ikke være mere end 30 min fra en samling sted at tage højde for eventuelle trafikrelaterede problemer, der kan opstå. Hertil kommer, at alle laboratorier foreslår foretage protokollen beskrevet her, vil kræve to teknikere på hånden for at sikre optimal prøve behandling. Desuden skal hvert laboratorium have adgang til det nødvendige udstyr til hvert trin er skitseret ovenfor. Således laboratorier med færre medarbejdere og / eller begrænset udstyr wOuld sandsynligvis være i stand til at påtage sig denne protokol.
En fordel ved denne protokol er evnen til at indsamle prøver direkte i hjem samtykkende individer. Dette gør det muligt undersøgelsen for at nå personer med psykiske eller andre sundhedsmæssige problemer, der ellers ikke typisk søge lægehjælp, måske på grund af manglende forsikring eller transport. Det er også den muliggør sammenligning af berørte og uberørte individer, der bor inden for det samme fællesskab, der har oplevet lignende udløser, men adskiller sig i forhold til deres psykiske symptomer. Indhentning af prøver på denne måde kræver præcis timing og koordinering af laboranter på området. Fordi vores laboratorium blev placeret i samfundet, vi studerede, kunne en bioanalytikeren typisk indsamle prøver fra to-tre boliger og levere prøver til laboratoriet inden for 2 timers vindue i første kollektion. Effektivitet er nøglen til vores prøve behandling, og som sådan, havde vi flere laboranter ifelt, øger behovet for præcis koordination. Laboratoriet har modtaget flere blod leverancer med op til otte deltagere pr levering afstand 2 timer fra hinanden. De laboranter mødtes på en udpeget placering og kombineret deres samlinger med kun én bioanalytikeren levere prøver til laboratoriet som en enkelt portion. De her beskrevne metoder kan let tilpasses til at studere mange andre fænotyper og de biologiske prøver indsamlet kan anvendes i en lang række efterfølgende assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25 G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5 ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5 M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1 mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1 ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15 ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2 ml and 5 ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8 ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6 ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5 ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
- Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
- Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
- Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
- Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
- Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
- Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
- Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
- Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
- Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
- Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
- Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
- Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
- Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
- Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
- Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
- Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
- Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
- Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
- Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
- Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
- Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
- Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
- Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
- Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
- Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
- Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
- Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).
