Abstract
Innsamling og behandling av fullblodprøver i en ikke-klinisk setting tilbyr en unik mulighet til å evaluere samfunns bolig individer både med og uten preexisting forhold. Rask behandling av disse prøvene er avgjørende for å unngå degradering av viktige cellulære komponenter. Inkludert her er metoder for samtidig perifert blod mononukleære celler (PBMC), DNA, RNA og serum isolasjon fra en enkelt blodprøvetaking utført i hjemmene til samtykkende deltakere over et byområde, med behandlingen initieres innen to timer av samlingen. Vi har brukt disse teknikkene for å behandle over 1600 blodprøver, hvilket ga jevn og høy materialkvalitet, som deretter er blitt anvendt i vellykket DNA-metylering, genotyping, genekspresjon og flowcytometri analyser. Noen av metodene som benyttes er standard; imidlertid, når kombinert på den beskrevne måte, gjør det mulig at de effektiv behandling av prøver fra deltakerne i population- og / eller samfunns-baserte studier som normalt ikke ville bli evaluert i en klinisk setting. Derfor har denne protokollen potensial til å få tak i prøver (og senere data) som er mer representativt for den generelle befolkningen.
Introduction
Flere studier har karakterisert forskjeller i genekspresjon, DNA-metylering og celle-undersett i blodet hos personer med og uten mental (eller andre) sykdommer 1-4. Disse studiene har imidlertid blitt innhentet fra kliniske settinger der sykdomsassosierte forskjeller kan være forstørret på grunn av den generelt mer alvorlig karakter av sykdommer for hvilke pasienter som søker behandling. På grunn av fremskritt i "omics" nærmer seg, har det siste tiåret sett en eksplosjon av interesse i å få biologiske prøver fra samfunnet og / eller epidemiologiske innstillinger 5-7, for å gi befolkningsbaserte estimater av utbredelsen sykdom og et bredere bilde av miljømessige determinanter av disse mentale og / eller fysiske sykdommer.
En hovedutfordring i denne forbindelse er det behov for hurtig behandling av de innsamlede prøvene. Nedbrytning av mononukleære celler, nøkkelimmunsystemkomponenter som frequently brukes til å vurdere helsen til et individ begynner umiddelbart etter blodprøvetaking med en betydelig nedgang i bedring etter 2 timer av samlingen 8-10. For å møte denne utfordringen, presenterer vi en optimalisert protokoll der flere komponenter av humant fullblod samtidig isolert fra prøver tatt i hjemmene til fag som bor i et stort byområde. Protokollen er basert på vår samling og ombygging av dagens teknikker, inkludert lagring av alle "ekstra" fraksjoner i tilfelle fremtidige teknikker tillate ytterligere isolering / analyser. Selv om alternative fremgangsmåter eller sett kan anvendes i stedet for de enkelte fremgangsmåter som er beskrevet her, de som er beskrevet har vist seg å være en pålitelig og effektiv måte for å behandle prøvene i en high-throughput måte. Høykvalitets fraksjoner (PBMC, DNA, serum, og RNA) av friskt blod kan produseres innen 2 timer av samlingen og alle analyse-ready prøvene kan foreligge innen 2 dager (Figur 1).
Denne protokollen ble utviklet for å muliggjøre effektiv behandling av prøver samlet inn fra community-bolig, voksne innbyggere i byen Detroit for testing i Detroit Neighborhood Health Study (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), en populasjonsbasert studie av de sosiale og biologiske faktorer som bestemmer post-traumatisk stresslidelse (PTSD) og andre psykiske lidelser. Forekomsten av PTSD i Detroit er mer enn det dobbelte av landsgjennomsnittet 11,12. Identifisere biologiske faktorer som bestemmer PTSD hos denne pasientgruppen kan bidra til å utvikle hensiktsmessige farmakologiske og / eller kognitiv-atferdsintervensjoner for å hjelpe dem som lider av sykdommen, både i denne urbane befolkningen, og i andre høyrisikogrupper (for eksempel retur militære veteraner). Vårt laboratorium, tidligere plassert ved Wayne State University i Detroit, Michigan, ble valgt for behandling basert på vår kompetanse i å håndtere ferske vevsprøver som stammer fra en rekkekilder, til nødvendigheten begynne å behandle prøvene innen 2 timer av samlingen, og vår nærhet til innsamlingssteder. Med denne unike muligheten for hånden, vårt mål var å optimalisere behandlingen for størst utbytte av DNA, RNA, serum og perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra hver prøve (totalt N = 1639 prøver over 5 bølger av prøveinnsamling). Prosedyrene er beskrevet her kan utføres samtidig i et ikke-klinisk setting, og dermed produsere utgangsmaterialet (se tabell 1 for gjennomsnittlig avkastning) for et mangfold av nedstrøms applikasjoner, inkludert microarray, epigenetisk, real-time RT-PCR, og flowcytometri analyser.
Figur 1. Samlet arbeidsflyt. Den totale prosessen avbildet her inkluderer logistikk for å få blodprøver fra å identifisere samtykkende participants til blodet trekke seg. Høy kvalitet, fraksjonene (perifere mononukleære blodlegemer, PBMC, DNA, serum, og RNA) av ferskt fullblod kan fremstilles i løpet av 2 timer for samling og alle analyse-ready prøvene kan være tilgjengelige i løpet av 2 dager. Videre er de fraksjoner som fremstilles ved denne metoden er egnet for langtidslagring dersom prøvene ikke skal bli testet umiddelbart. Hele tidslinjen skissert her kan være ferdig i løpet av én dag (~ 5 timer totalt). Imidlertid ville en slik dag være ekstremt arbeidskrevende, spesielt for en enkelt tekniker med betydelig erfaring med teknikker. Derfor anbefaler vi å dele prosedyrene på dag 1 mellom minst to teknikere og fullføre RNA prosessering på dag 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detroit Neighborhood Helseundersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av University of Michigans Institutional Review Board. Alle deltakerne forutsatt informert samtykke før deltakelse i studien.
1. Oversikt
- Riktig dokumentere alle stadier fra rekruttering gjennom analyse av endepunkt data. Utfør protokollene på dag 1 samtidig, bytte etapper og overlapp som tiden tillater. Sekvensen av trinn er skrevet for å optimalisere ytelsen effektivitet. Figur 1 gir en oversikt over hele prosessen.
Merk: Betegnelsen "deltaker" brukes i hele til å betegne den avidentifisert blodprøve hentet fra en samtykkende person. Tidene i parentes nedenfor viser hands-on tid. Eksempler på sporings arket og prøvelogg kan finnes i tabellene supplerende S1 og S2, henholdsvis. Prøvene samles inn av phlebotomists i boligerindivider identifisert som samtykker deltakerne ved studiekoordinator og transporteres til laboratoriet ved en kurer (se Tilleggsinformasjon (SI) 1 for ytterligere pre-prosessering detaljer).
2. Dag 1 Setup
- Forbered 1x Fosfatbufret saltvann (PBS).
- Forvarm en varmeblokk til 56 ºC.
- Klargjør protease (se SI 2) ved alikvoteringsprosessen 20 ul inn riktig antall Mikrosentrifugerør for dagens leveranser (2 per deltaker).
- Buffere sikre AW1 AW2 og (vaskebuffere som er gitt i DNA isolasjonskit som øker renheten av DNA) er klar til bruk, tilsetning av 100% etanol som er angitt på etiketten, om nødvendig.
- Kjøle ned kjølesentrifuge til 4 ° C.
- Sett korken på flasken med 1x PBS med den medfølgende gummiseptum cap og pierce gummiseptum med en overføring pigg, beholde skrukork på toppen av overførings spike for å forhindre fordampning. Gjenta med flaske RNA stabilisering løsning.
- Etter fremstilling av buffere, sentrifuger og varmeblokk, dokumentere tidspunktet vakutainer levering på prøven sporings arket (se tabell SI).
3. Dag 1: Behandler helblodprøve for DNA, PBMC og Leukocytt RNA (2 timer)
- Oversikt
- Tildele tilstrekkelig tid til å minimalisere forsinkelsen mellom blodprøvetaking og behandling starttid. Begynne behandling av Ficoll-inneholdende vacutainers innen 2 timer fra blodprøvetaking for å unngå en økning i antall røde blodceller forurensning og en reduksjon i mononukleære celler utvinning.
- Anta samling av 2 vacutainers inneholder Ficoll gradient gel, 2 K 2 ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA) vacutainers, og en serum vakutainer per voksen deltaker. Ved levering av vacutainers til laboratoriet, har en tekniker signere sporing ark betegner aksept av prøvene. Tiggei behandlingen umiddelbart med starttid dokumentert på en per vakutainer basis på prøven loggen.
- Serum Isolation Stage 1 (1 min)
- Dokumentere starttid på prøven loggen (se tabell SI 2). Sentrifuge (med brems og akselerasjon OFF) 7,0 ml serum (rød) vakutainer (1 per deltaker) med en svingende bøtte rotor med spray caps (biosikkerhetsnivå 2; BSL2 sertifisert) i 20 min, 1300 xg, 4 ºC.
- DNA Isolation Stage 1 (15 min)
Merk: For mer informasjon om denne isoleringsprosedyren, se produsentens protokoll 13.- Dokumentere starttid. I en BSL2 cellekultur hette, invertere vacutainers inneholder Ficoll gelen 5 ganger og deretter legge til 200 pl fullblod fra toppen av en av de vacutainers i hver av to 20 ul delmengder av protease (400 pl totalt per deltager). Forlater protease + blod Mikrosentrifugerør i panseret, fortsetter til centrisentrifugering av Ficoll inneholder vacutainers i trinn 3.4.1.
Merk: Bruk vakutainer med den største oppsamlingsvolum, og tatt hensyn til nødvendigheten av å balansere sentrifuge (dvs., kan det være nødvendig å fjerne 200 pl fra hver av de to vacutainers) ved å spinne vacutainers i trinn 3.4.1. I tillegg, for å sikre riktig atskillelse under behandlingen av de blå vacutainers, bør nivået av blod som er igjen i vacutainer ikke være mindre enn 2,5 inches over Ficoll lag.
- Dokumentere starttid. I en BSL2 cellekultur hette, invertere vacutainers inneholder Ficoll gelen 5 ganger og deretter legge til 200 pl fullblod fra toppen av en av de vacutainers i hver av to 20 ul delmengder av protease (400 pl totalt per deltager). Forlater protease + blod Mikrosentrifugerør i panseret, fortsetter til centrisentrifugering av Ficoll inneholder vacutainers i trinn 3.4.1.
- PBMC Isolation Stage 1 (1 min)
- Dokumentere starttid (må være innenfor to timers blod uavgjort for å unngå en økning i røde blodlegemer forurensning og en nedgang i mononukleær celle recovery) .Invert Ficoll inneholder vacutainers 8-10 ganger. Sentrifuge (med brems og akselerasjon OFF) de vacutainers (2 per deltaker) ved hjelp av en svingende bøtte rotor med spray caps (BSL2 sertifisert) for 30 min, 1600 xg, 22 ° C.
- Gå tilbake til hetten og tilsett 200 ul Buffer AL til hver av protease + blod mikrosentrifugerør (trinn 3.3.1). Cap, fjern fra panseret, vortex 15 sek og flash spinn.
- Inkuber 56 ° C i en varmeblokk, 10 min.
- Fjern rørene fra varmen blokken. Flash spinn. Gå tilbake til BSL2 panseret. Tilsett 200 pl 100% etanol. Cap, fjern fra panseret, vortex 15 sek og flash spinn. De resterende trinnene kan gjennomføres utenom panseret.
- Påfør lysat (innen 30 minutter fra trinn 3.5.3) til en merket spinnkolonne (i en 2 ml oppsamlingsrør). Lukke lokket for å unngå smitte via aerosoler. Sentrifuger 6000 xg, 1 min.
- Kast oppsamlingsrøret inneholdende filtratet og plasser spinnkolonne i et nytt 2 ml oppsamlingsrør.
- Legg 500 mL buffer AW1 til kolonnen uten fukting felgen, lukker lokket, og sentrifuger 6000 xg, 1 min.
- Kast oppsamlingsrøret som inneholder den Filtrate og plasser i en ny 2 ml samling rør spinnkolonnen.
- Legg 500 mL buffer AW2 til kolonnen uten fukting felgen, lukker lokket, og sentrifuger 20.000 xg, 3 min.
- Kast oppsamlingsrøret inneholdende filtratet og plasser spinnkolonne i et nytt 1,5 ml oppsamlingsrøret (ikke inkludert i settet), og sentrifuger 20 000 xg, 1 min.
- Kast oppsamlingsrøret inneholdende filtratet og plasser spinnkolonne i et nytt 1,5 ml oppsamlingsrøret (ikke inkludert i settet).
- Tilsett 200 ul buffer AE eller vann til hver kolonne og inkuber ved romtemperatur i 5 min. Sentrifuger 6000 xg, 1 min.
- Gjenta trinn 3.5.11 eluering i samme oppsamlingsrør.
- Bassenget på elueres DNA fra 2 kolonner per deltaker. Totalt utbytte ~ 800 mL per deltaker.
- Kvantifisere prøvene ved hjelp av et spektrofotometer når tiden tillater.
- Delmengde DNA som ønsket inn i 2 ml cryovials, dokumentere konsentrasjonen av hver på specimen log. Transfer cryovials til en cryobox og sted ved -80 ° C for langtidslagring. Dokumentere fryser starttid.
Merk: Utfør i et biosikkerhetsnivå 2 sertifisert cellekultur hette. For ytterligere informasjon om dette isolert sett se produsentens instruksjoner 15.
- Pierce gummiseptumet av K 2 EDTA vakutainer med en overføring pigg. Beholde kappen og skrukork for bruk i trinn 3.6.11. Etter BSL2 standard praksis, ta vare for å unngå eksponering for blodbårne patogener.
- Fest den hvite slip-kontakten til toppen av overføringen pigg.
- Merke filter med tilsvarende deltaker ID deretter koble innløpet (blusset slutten) av filteret til den hvite slip-kontakt.
- Fest et omsluttet 25⅝ G nål til utløpet (avsmalnende ende) av filteret. Forbereder filterenheten før levering påskynder prosessen betraktelig, og derforfeste den hvite slip-kontakten til overføring pigg, og legger til filteret, deretter skjermet nål og sette menigheten i en kultur rørstativ inntil bruk, anbefales.
- Etter montering av K-2-EDTA-rør-system, trygt unsheathe nålen (bruk enden av en metallspatel). Stikke nålen inn i en tom 10 ml evakuert blodprøverøret (serum mottaker tube) og invertere K 2 EDTA vakutainer / filter / mottaker slange. Etter BSL2 standard praksis, ta vare for å unngå eksponering for blodbårne patogener.
- Tillater blodet å filtrere gjennom før de kileformede deler av filteret har ryddet av blod. Filtrering tar omtrent 2 min, og kan plasseres i et reagensrør stativ under filtrering.
- Fjern filteret fra forsamlingen. La nålen i røret som inneholder filtratet og forkaste hele forsamlingen i en Sharps container.
- Fest en 5 ml sprøyte til overføring pigg på flaske 1x PBS, iVERT flasken, og ta 3 ml.
- Fest sprøyten med PBS til innløpet til filteret og skyll filter (3-5 dråper per sekund). Samle gjennomstrømnings i et biologisk avfallsbeholder. Løsne sprøyten fra filteret uten å trekke tilbake stempelet.
- Etter filtrering og en PBS-vask, trekk 3 ml av RNA stabiliseringsmiddel ved hjelp av en ny 5 ml sprøyte og fremgangsmåten beskrevet i trinn 3.6.8. Skyll filteret som i trinn 3.6.9. RNA stabilisering agent skal forbli på filteret. Løsne sprøyten fra filteret uten å trekke tilbake stempelet.
- Tett filter innløp og utløp med slire og skrukork beholdt fra overførings pigg forlater filter mettet med RNA stabilisering agent. Filteret kan lagres på dette tidspunkt. Oppbevar filter ved -80 ºC før tiden tillater det (~ 2 timer) for å fullføre trinn 5.3 til 5.4.7.
Note: Filtre lagret ved -80 ºC i inntil ett år etter at samlingen er blitt behandlet uten decrease på RNA kvalitet.
- Fjern Ficoll inneholder vacutainers fra sentrifugen (trinn 3.4.1) og fortsette i en BSL2 hette. Vacutainers skal vise separasjon som i figur 2. Hvis ikke, se tabell 2.
- Når vakutainer returneres til BSL2 hetten fjernes stopperen og ta ut 1,5 ml av den øvre, gulaktig, plasmalaget (figur 2) ved hjelp av en serologisk pipette uten å komme nær den mononukleære (clear / hvit) lag. Overfør plasma til en 5 ml kryoampulle - (Pool fra 2 vacutainers - en deltaker). Logg volumet samlet. Se trinn 3.7.6 for oppbevaringsbetingelser.
Merk: Den beste separasjon og beste PBMC rentene kommer fra deltakere som har fastet i minst 12 timer før blodprøvetaking. - Overfør den gjenværende plasma og hvitaktig, mononukleære lag (alt over gelsjiktet - figur 2) usynge en serologisk pipette til en 15 ml konisk rør, pooling det mononukleære lag fra hver av de to Ficoll holdige vacutainers per deltaker i en konisk tube.
- Legg 1x PBS for å bringe det totale volum i den koniske rør til 15 ml. Cap tube og invertsukker 5 ganger. Sentrifuge (med bremse- og akselerasjons AV) 15 min, 300 xg, 22 ° C.
- Gå tilbake til Ficoll inneholder vacutainers i panseret og samle røde blodceller (RBC) ved hjelp av en 5 ¾ "Pasteur pipette til å virvle rundt og løsne utsiden av Ficoll gellaget og fjern det hvis det er mulig. Bruk en serologisk pipette for å samle inn og overføre RBCs (~ 4,5 ml) i en 5 ml kryoampulle. Logg volumet samlet.
- Overfør 5 ml begge cryovials (plasma i trinn 3.7.2 og RBC i trinn 3.7.5) til en kontrollert hastighet frysing beholder og satt ved -80 ° C i minst 24 timer etter hvilken tid de kan overføres til en cryobox og returnert til -80 ºC for langtidslagring.
- Returner coisk rør til hetten, når sentrifugering i trinn 3.7.4 er fullført, og aspireres alle unntatt ~ 500 ul av PBS uten å forstyrre pelleten. PBMC utbytte er større dersom ~ 200 ul PBS er igjen over pelleten på dette stadiet.
- Legg frisk 1x PBS for å bringe volumet til 10 ml. Resuspender pelleten forsiktig. Cap tube og invertsukker 5 ganger. Sentrifuge (med bremse- og akselerasjons AV) 10 min, 300 xg, 22 ° C.
Merk: Utfør en BSL2 hette.
- Alikvot toppsjiktet serum fra serum vakutainer, etter sentrifugering (trinn 3.2.1) i 2 ml cryovials som ønsket. Typisk utbyttet er 2,5 ml (tabell 1). Logg volumet. For eksempel bruke 4 cryovials alikvoteringsprosessen 200 ul inn kryoampulle 1, 1000 mL inn kryoampulle to og deretter dele de rester inn cryovials 3 og 4.
- Overfør cryovials til en cryobox og sted ved -80 ºC for langtidslagring. Dokumentere fryser starttid.
- Gå tilbake til panseret, etter sentrifugering (trinn 3.7.8), og aspirer så mye supernatant / PBS som mulig uten å forstyrre pelleten. Resuspender pellet ved pipettering i 2,5 ml PBMC Frysing Medium 1 (se SI 2).
- Legg 2,5 ml PBMC frysemedium 2 (se SI 2) til cellen / middels oppløsning i trinn 3.9.1. Vortex forsiktig.
- Alikvoter 10 ul av celleløsningen inn i en 0,65 ml mikrosentrifugerør (ytterligere fortynning kan være nødvendig). Tilsett 10 ul 0,4% trypan blå flekk inn i 0,65 ml mikrosentrifugerør og bland ved å pipettere flere ganger. For ytterligere informasjon se produsentens manual 16.
- Pipetter 10 ul av blandingen inn i en celle tellekammer lysbilde og sted lysbilde i celleteller innen 3 minutter for å blande. Zoome inn og fokusere cellene. Trykk på "Count Cells" for å få PBMC telle.
- Aliquot, hvis levedyktigPBMC antall er over 3 millioner celler per milliliter (mc / ml), som ønsket inn cryovials og fortsett til trinn 3.9.9. Oppbevar PBMC i opptil 5 cryovials ved en konsentrasjon på minst 3 mc / ml hver.
- Hvis levedyktig PBMC-tall er under 3 mc / ml, beregne det totale antall celler ved å multiplisere den levedyktige mc / ml med 5 ml. Dividere det nummer med 4, 3, 2 eller 1 ml, slik at det blir i det minste et rør med tre mc / ml.
- Sentrifuger konisk rør inneholdende celler / frysemedium oppløsningen i 5 minutter ved 300 xg (brems og akselerasjon AV). Etter sentrifugering suge det passende volumet av frysemedium (supernatant) som forlater volum beregnet ovenfor (4, 3, 2 eller 1 ml).
- Resuspender pellet i den gjenværende supernatanten og alikvot på minst 3 mc / ml inn i det passende antall cryovials (1-4) ved 1 ml / kryoampulle. Endelig frysemedium er 10% dimetylsulfoksid (DMSO) / 20% føtalt bovint serum (FBS) / 70% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
- Document celletallet per kryoampulle. Overfør cryovials til en kontrollert hastighet frysing container og satt ved -80 ºC i minst 24 timer etter som tiden cryovials kan overføres til en cryobox og satt i en flytende nitrogen tank (dampfase) for langtidslagring. Dokument fryser starttid.
4. Dag 2 Setup
- Varm en alikvot (220 pl per filter) av nuklease fri 0,1 mM EDTA i et nuklease-fri rør til 80 ° C i en varmeblokk.
- Forbered vaskeoppløsningene 1 og 2 (se SI 2).
5. Dag 2: Long Term Sample Lagring og Leukocytt Filter Processing (3 timer)
- Oversikt.
- Utfør denne prosedyren innen 6 måneder etter anvendelsen av leukocytter til filteret.
Merk: Overall, tar Dag 2 behandling ca 3 timer, og mens det er merket "Dag 2", heter det sentralt krav er at filteret behandlingen del bør utføres på en dag dadet er ingen dag 1 behandling som forekommer i laboratoriet.
- Utfør denne prosedyren innen 6 måneder etter anvendelsen av leukocytter til filteret.
- Langsiktig oppbevaring av prøver (15 min)
- Utfør denne prosedyren hver dag, før levering av nye vacutainers til laboratoriet for dag 1 behandling. Overfør cryovials som ble lagret O / N i kontrollerte rente frysecontainere på dag 1 i hensiktsmessig merket cryoboxes og returnere dem til -80 ºC eller flytende nitrogen (dampfase) for langtidslagring. Organisere cryovials basert på prøvetype (f.eks, DNA, PMBC, RBC, etc.) for å fremskynde prøven plassering sporing for endepunkt analyser.
- Leukocytter RNA Filters Processing (45 min).
Merk: For mer informasjon om denne prosedyren se produsentens instruksjoner 17.- Bringe filteret til RT (tiner ca. 5 min).
- Fjern skjede og skrukork fra filteret. Trekk tilbake stempelet på en 5 ml sprøyte og koble den til innløpet (blusset slutten) av filteret stemplet trykkeså utvise RNA stabiliseringsmiddel fra filter havner i en biologisk avfallsbeholder.
- Legg i en ny 5 ml sprøyte med 4 ml av en fenol og guanidinisotiocyanat løsning for RNA isolering og fest den til innløpet av filteret, trykk ned stempelet for å skylle løsningen gjennom filteret, samle lysatet i en merket 15 ml konisk rør (2 per deltaker).
- Koble sprøyten fra filteret, trekke stempelet, kan du legge det til filteret, og trykk ned stempelet for å utvise restprøven fanget i filteret disken inn i de samme 15 ml konisk tube. Kast filter og sprøyte.
- Legg 800 mL BCP til konisk rør, lukke røret tett og kraftig riste prep for 30 sek.
- Inkuber ved RT i 5 min. Sentrifuger i 10 minutter ved 2000 x g.
- Overfør den vandige (topp) fase til en fersk merket 15 ml konisk rør (~ 2,5 ml).
- Tilsett 0,5 ganger volumet av den vandige fase av nuklease-fri vann end bland godt. Deretter legger 1.25x det vandige volum 100% etanol og bland igjen.
Merk: For en 2,5 ml vandig volum, tilsett 1,25 ml nukleasefritt fritt vann, bland, og deretter legge 4,7 ml 100% etanol (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml nukleasefritt gratis vann SÅ 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml ny vannvolum THEN 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml 100% etanol). Dette trinnet muliggjør isolering av total-RNA som inneholder de små RNA-fraksjon. En metode for å utelate de små RNA fra isolasjonen finner du i manualen 17. - Fjern stempelet fra en 5 ml sprøyte og sette inn en spin patronen i stedet. Fest kassetten / sprøyta på et vakuum manifold. For en mer sikker tilkobling til vakuummanifolden, plasserer kassetten / sprøyta inne i en 1,5 ml mikro tube med bunnen avskåret.
- Påføre prøven fra trinn 5.3.8 til spinn patronen langsomt med vakuum på, forsiktig tilsetning av mer prøven som den trekkes gjennom patronen.
Merk: Hvis ingen vakuum erstede, se sentrifugeringsmetoden på http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf. - Overfør spin patronen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og tilsett 750 ul av vaske 1. Sentrifuger sentrifugepatron / slange 5 - 10 s ved 12 000 x g.
- Kast filtratet fra røret og returnerer spinn patronen til samme mikrosentrifugerør.
- Legg 750 ul vaske 2 og sentrifuger sentrifuge patron / røret i 5 - 10 sekunder ved 12.000 x g. Kast filtratet som i trinn 5.3.12. Returner spin patron til samme mikrosentrifugerør.
- Gjenta med ytterligere 750 mL av Wash 2 og sentrifugering som i trinn 5.3.13. Kast filtratet. Returner spin patron til samme mikrosentrifugerør. Sentrifuger spin patron / tube med maksimal hastighet i 1 min til tørk filteret.
- Overfør spin patron til en frisk, merket 1,5 mL mikrosentrifugerør.
- Tilsett 200 ul av nukleasefritt 0,1 mM EDTA (forvarmet til 80 & #176, C) til midten av spinnkassettfilter (to per deltaker). Inkuber ved RT i 1 min.
- Sentrifuger i 1 minutt ved 12.000 xg for å eluere RNA. Beholde filtratet. Kast spin patron.
- Splitte hver 200 mL filtratet i to, 100 pl prøver i nye 1,5 ml mikrosentrifugerør, etikett og holde på is. På dette punktet, vil starte med 2 filtre pr deltaker gi fire 100 ul porsjoner av RNA per deltaker.
- DNase-behandling (1 time)
Merk: For mer informasjon om denne behandlingen se produsentens protokoll 18.- Lag en master mix ved å kombinere 10 ul DNase Buffer og 2 ul rDNase jeg per porsjon på + 1 (på kontoen for pipetteringsfeil).
Merk: For fire prøver, 100 ul porsjoner bruke 50 ul DNase Buffer + 10 mL rDNase I. - Alikvoter 12 ul av konsentrat-blanding i trinn 5.4.1 inn i hver av RNA aliquoter fra trinn 5.3.18 og bland forsiktig. Inkuber ved 37° C i 30 minutter i en varmeblokk.
- Vortex DNasen Inaktive Reagens og tilsett 11,2 mL til hver prøve, bland godt. Inkuber ved RT i 2 min vortexing 2-3 ganger i løpet av inkuberingen.
- Sentrifuger ved 10000 x g i 1,5 min.
- Overfør supernatanten (RNA) til en frisk 1,5 ml rør. Porsjoner fra samme deltaker kan samles her.
- Kjøres hver prøve på et spektrofotometer for å få konsentrasjonen. En kvalitetsanalyse av RNA er anbefalt å bruke en Bioanalyzer (se trinn 5.5).
- Delmengde av RNA inn i cryovials som ønsket. Hvis en Bioanalyzer analyse ikke vil bli utført umiddelbart, alikvoter 1,5 ul prøve inn i et mikrosentrifugerør for senere analyse. Dokumentere konsentrasjoner og fryseren starttid. Oppbevar prøver ved -80 ° C.
- Lag en master mix ved å kombinere 10 ul DNase Buffer og 2 ul rDNase jeg per porsjon på + 1 (på kontoen for pipetteringsfeil).
- Bioanalyzer analyse (1 time)
- Følg produsentens protokoll 19. Når kjøringen er fullført, blir dataene automatisk lagres, men lagre det igjen with en mindre, mer gjenkjennelig filnavn. Forventede resultater (figur 3): stigen bør ha 6 topper, prøver bør ha 3 topper (2 ribosomale topper på 44 sek og 50 sek, henholdsvis, og en tidlig markør topp på 25 sek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er viktig at den samlede fremgangsmåten produsere høykvalitets materiale for analyse i et mangfold av nedstrøms applikasjoner, inkludert genekspresjon via mikromatriser og RT-PCR-analyse, deteksjon av epigenetiske modifikasjoner, og celleundergruppe variasjoner. Tabell 1 angir den gjennomsnittlige utbyttet og kvaliteten av materialene fra hver av prosessene. Figur 3 gir et eksempel på kvalitet av de leukocytt-RNA isolasjon og filterbearbeidingsmetoder. Bildet øverst til venstre i figur 3 er det gel bilde som følge av kapillær elektroforese. Hvert kjørefelt skal produsere to forskjellige band med minimal skygge som skulle tilsi degradering. Kromatogrammene under gelen gi en ekstra blikk på nivå og type av nedbrytning som kan bestemmes basert på plasseringen og størrelsen av toppene. RNA Integrity Number (RIN) er en annen kvalitet tiltak som spenner fra 1 (lav; degradert) til10 (høy, ren, god kvalitet RNA).
En så høy gjennomstrømming metodikken gir seg til en og annen feil, men det er flere kontrollposter gjennom de ulike stadiene av behandlingen for å sikre kvalitetskontroll. Figur 2 viser riktig separasjon etter sentrifugering av Ficoll inneholder vakutainer. Det er flere grunner til et vacutainer kanskje ikke vise denne separasjonen inkluderer en feil i sentrifuge hastighet og lav oppsamlingsvolum, eller mangel på en fastende deltaker som angitt i tabell 2.
Undergrupper (n = 100) av prøvene isolert ved hjelp av denne prosedyren er blitt analysert med suksess ved HumanMethylation27 (HM27) DNA-analyse BeadChips inkludert validering av disse resultatene av pyrosekvensering 11. Genotyping, målrettet bisulfite pyrosekvensering, og real-time RT-PCR har blitt utført i Wildman og Uddin laboratorier 20,21,22,23. Serum, isolert i parparallell med DNA isolert for både Beadchip og genotyping analyser, ble med hell analysert for IL-6 og C-reaktivt protein-aktivitet 24. T-celle-undersett fra de isolerte PBMC har blitt analysert ved hjelp av strømningscytometri 25-28. I tillegg har RNA fra den modifiserte leukocytt prosedyre blitt utsatt for genom Wide genekspresjon profilering 29.
Figur 2. Layer separasjon etter sentrifugering over Ficoll vakutainer inneholdende. En visualisering av separasjon av flere blodkomponenter etter sentrifugering. Den mononukleær laget er videre renset mens de andre lagene er lagret ved -80 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Forventet resultater fra leukocytter RNA prosessering. Bioanalyzer resultater som viser to forskjellige band som representerer 18S og 28S ribosomalt RNA med RNA integritet tall (Rins) over 8 isolert med rives leukocytter RNA isolering og filter bearbeidingsmetoder (se protokoll 3.6 og 5.3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Total Gjennomsnittlig yield (N≈500) | Gjennomsnittlig kvalitet | |
| Serum | 2,30 ml | N / A |
| DNA fra helblod | 39.97 ug | Absorbans ved 260/280 = 1,74 |
| PBMC | 22.25 millioner levedyktige celler | Minst 95% av den samlede isolasjon levedyktighet |
| RNA fra Leukocytter | 44.09 ug | Absorbans ved 260/280 = 2,01 RNA Integrity Number (RIN) = 6,48 |
Tabell 1. Forventet avkastning. Gjennomsnittlig mengde og kvalitet på prøvene behandlet ved hjelp av de beskrevne metoder.
| Problem | Potensiell løsning |
| Ingen separasjon etter Ficoll inneholder vakutainer sentrifugering | Vakutainer er ikke fylt til kapasitet - minimum oppsamlingsvolum for tilstrekkelig behandling er 6 ml. |
| Sjekk sentrifuger innstillinger, må du passe på hastigheten er i g-force. Dersom den er feil, satt til g-force og respin. | |
| Lav PBMC count | Volumet av blod tegne for lavt. |
| Aspirert for nær pellet i trinn 3.7.8 | |
| Ikke-faste deltaker. | |
| Ingen separasjon etter serum vakutainer sentrifugering | Sjekk sentrifuger innstillinger, må du passe på hastigheten er i g-force. Dersom den er feil, satt til g-force og respin. |
| Uventet konsentrasjon hjelp av Nanodrop tusen | Sørg for at målingen er for den aktuelle prøvetype (for eksempel DNA eller RNA). |
Tabell 2. Feilsøking. Vanlige problemene med de beskrevne metoder og mulige løsninger.
Supplerende Tabell 1. Tracking ark. Et eksempel på spore vacutainers from blodprøvetaking til laboratorie levering. Klikk her for å vise denne tabellen.
Supplerende Tabell 2. Prøve loggen. Et eksempel på dokumentet brukes til å dokumentere behandlingen av vacutainers ved levering til laboratoriet. Klikk her for å vise denne tabellen.
Supplerende Tabell 3. kryoampulle Numbering System. Et eksempel på nummersystem som brukes for hver deltaker. Klikk her for å vise denne tabellen.
Tilleggsopplysninger 1. preprosessering detaljer. Detaljer plikter studieveileder, Courier og Phlebotomist. Klikk her for å vise tilleggsinformasjon 1.
Tilleggsopplysninger 2. oppskrifter. En liste over oppskrifter for de nødvendige reagenser. Klikk her for å vise tilleggsinformasjon 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en strømlinjeformet protokoll som har blitt brukt til å behandle mer enn 1600 fullblodprøver i Detroit Neighborhood Health Study. Selv om mange av disse teknikker er tilgjengelig i eksisterende litteratur, den trinnvise oppbygging, herunder nøyaktig tidsbestemte endringer mellom hvert trinn, reflekterer en optimalisert, effektiv protokoll som vellykket produserer en rekke biologiske prøver med et bredt spekter av nedstrøms applikasjoner inkludert DNA metylering, mRNA uttrykk og immunologisk analyse. Disse prøvene har allerede blitt testet i en rekke eksperimenter, resultater som har blitt publisert i peer-reviewed litteratur og / eller presentert på nasjonale møter 11,20,21,23,24,29. Denne protokollen bør derfor være av interesse for andre forskere som ønsker å samle inn biologiske prøver i populasjonsbaserte studier som ligner på DNHS.
Ved behandling av prøver i en slik høy-throughpUT måte, er det av største betydning for å opprettholde nøyaktig oversikt i alle ledd. Vi anbefaler å utvikle en database til å lagre all kryoampulle informasjon i utgangspunktet. Denne databasen bør omfatte alle aspekter av prøven innenfor hver kryoampulle inkludert volum, konsentrasjon, kvalitet, strekkode, og lagringssted (oppbevaringsboks antall og plassering innenfor boksen). Vi anbefaler forbereder pre-merket cryovials og oppbevaringsbokser som inneholder en strekkode. Videre har vi funnet det hensiktsmessig å ha en "master" dokument som inneholder strekkoder for hvert rør, som er spesifikke for hver deltaker (tabell S3). Dette muliggjør rask input av de kryoampulle data i databasen uten overdreven håndtering av prøvene, innføre unødvendige fryse / tine sykluser til prøvene og eliminerer muligheten for menneskelige feil ved inntasting av de strekkoder manuelt. Det er også viktig at etikettene holder seg på ekstrem (f.eks dampfasen av flytende nitrogen -178 til -150ºC) temperaturer. Dokumentasjonen kan være tidkrevende, og med nødvendigheten av effektiv behandling ved levering, er det funnet at med minst to teknikere dele prosessene produserer den største effektivitet.
En begrensning ved denne metode er nærhet av laboratoriet til oppsamlingsstedet. For PBMC isolasjon i særdeleshet, må prøvene behandles innen 2 timer av samlingen for å unngå betydelige økninger i antall røde blodceller forurensning og reduksjon i levedyktige mononukleære celler. Som sådan bør laboratoriet ikke være mer enn 30 min fra en samling området for å ta høyde for eventuelle trafikkrelaterte problemer som kan oppstå. I tillegg til noen laboratorie foreslår å gjennomføre protokollen skissert her vil kreve to teknikere på hånden for å sikre optimal utvalgets behandling. Videre må hver enkelt laboratorium ha tilgang til det nødvendige utstyr for hvert trinn som er beskrevet ovenfor. Dermed laboratorier med færre ansatte og / eller begrenset utstyr wOuld sannsynlig være ute av stand til å gjennomføre denne protokollen.
En fordel med denne protokollen er evnen til å samle inn prøver direkte i hjemmene til samtykkende individer. Dette gjør at studiet å nå personer med psykiske eller andre helseproblemer som ikke ville vanligvis søker medisinsk hjelp, kanskje på grunn av manglende forsikring eller transport. Det også gjør sammenligning av berørte og upåvirket individer som lever i samme samfunn som har opplevd lignende triggere, men varierer i forhold til deres psykiske symptomer. Innhenting av prøver på denne måte krever presis timing og koordinering av phlebotomists på feltet. Fordi vårt laboratorium var plassert i samfunnet vi studerte, kunne en phlebotomist vanligvis samle inn prøver fra to til tre boliger og levere prøvene til laboratoriet innen 2 timers vindu til den første samlingen. Effektivitet er nøkkelen til vår utvalgets behandling, og som sådan, hadde vi flere phlebotomists ifelt, øker behovet for nøyaktig koordinert. Laboratoriet mottatt flere blod leveranser med opp til åtte deltakere per levering fordelt 2 timer fra hverandre. De phlebotomists møttes på et angitt sted og kombinert sine samlinger med bare én phlebotomist levere prøvene til laboratoriet som et enkelt parti. Metodene som beskrives her, kan lett tilpasses til å studere mange andre fenotyper og de biologiske prøver samlet kan brukes i et mangfold av nedstrøms-analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25 G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5 ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5 M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1 mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1 ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15 ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2 ml and 5 ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8 ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6 ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5 ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
- Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
- Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
- Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
- Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
- Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
- Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
- Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
- Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
- Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
- Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
- Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
- Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
- Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
- Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
- Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
- Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
- Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
- Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
- Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
- Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
- Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
- Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
- Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
- Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
- Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
- Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
- Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).
