Abstract
Raccolta e lavorazione di campioni di sangue intero in un contesto non clinico offre un'opportunità unica per valutare residenti in comunità gli individui con e senza condizioni preesistenti. Elaborazione rapida di questi campioni è essenziale per evitare la degradazione dei componenti cellulari chiave. Vi sono incluse le modalità di simultanea periferico delle cellule mononucleate del sangue (PBMC), DNA, RNA e l'isolamento del siero da un unico prelievo di sangue effettuato nelle case dei partecipanti consentendo all'interno delle aree metropolitane, con l'elaborazione iniziata entro 2 ore di raccolta. Abbiamo usato queste tecniche per elaborare oltre 1.600 campioni di sangue cedevole, materiale costante qualità elevata, che è stato successivamente utilizzato in metilazione del DNA, la genotipizzazione, espressione genica successo e citometria a flusso analisi. Alcuni dei metodi utilizzati sono di serie; tuttavia, se combinati nel modo descritto, consentono un'efficiente elaborazione dei campioni di partecipanti di population- e / o community-studi basati che normalmente non verrebbero valutati in un ambiente clinico. Pertanto, questo protocollo ha il potenziale per ottenere campioni (e, successivamente, dati) che sono più rappresentativi della popolazione generale.
Introduction
Molteplici studi hanno caratterizzato le differenze di espressione genica, la metilazione del DNA e sottoinsieme di cellule nel sangue tra gli individui con e senza mentale (o altro) malattie 1-4. Questi studi, tuttavia, sono stati ottenuti da situazioni cliniche in cui le differenze malattie associate possono essere amplificate a causa della natura generalmente più grave delle malattie per le quali pazienti stanno cercando di trattamento. Grazie ai progressi in tecnologie "omiche", l'ultimo decennio ha visto un'esplosione di interesse ad ottenere campioni biologici provenienti da comunità e / o le impostazioni epidemiologici 5-7, al fine di fornire stime basate sulla popolazione di prevalenza della malattia e di un quadro più ampio della determinanti ambientali di queste malattie mentali e / o fisici.
Una sfida chiave in questo senso è il requisito per una rapida elaborazione dei campioni raccolti. Degradazione delle cellule mononucleate, componenti chiave del sistema immunitario che sono frequently utilizzato per valutare la salute di un individuo, inizia subito dopo prelievo di sangue con una diminuzione significativa recupero dopo 2 ore di raccolta 8-10. Per affrontare questa sfida, vi presentiamo un protocollo ottimizzato in cui più componenti del sangue umano intero sono contemporaneamente isolati da campioni ottenuti nelle case di soggetti che vivono in una grande area metropolitana. Il protocollo si basa sulla nostra compilazione e modifica delle tecniche attuali, compreso lo stoccaggio di tutte le frazioni "extra" in caso di tecniche future permettono di ulteriore isolamento / analisi. Mentre i metodi o kit alternativi possono essere impiegati al posto dei singoli metodi qui descritti, quelli delineati hanno dimostrato di essere un mezzo affidabile ed efficiente per la lavorazione dei campioni in maniera high-throughput. Frazioni di alta qualità (PBMC, DNA, siero, e RNA) di sangue fresco possono essere prodotti in 2 ore di raccolta e di tutti i campioni del test-ready può essere disponibile entro 2 giorni (Figura 1).
Questo protocollo è stato sviluppato per consentire il trattamento efficiente dei campioni raccolti da residenti in comunità, adulti residenti della città di Detroit per la sperimentazione in Detroit Quartiere Health Study (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1) un basato sulla popolazione, studio dei determinanti sociali e biologiche del disturbo post-traumatico da stress (PTSD) e di altre malattie mentali. La prevalenza di PTSD a Detroit è più del doppio della media nazionale 11,12. Identificare determinanti biologiche di PTSD in questa popolazione può aiutare a sviluppare farmacologico adeguato e / o interventi cognitivo-comportamentali per aiutare coloro che soffrono di questo disturbo, sia in questa popolazione urbana, e in altre popolazioni ad alto rischio (ad esempio, tornando veterani militari). Il nostro laboratorio, precedentemente situato presso la Wayne State University di Detroit, Michigan, è stato selezionato per l'elaborazione sulla base della nostra esperienza nella gestione di campioni di tessuto fresche provenienti da una varietàdelle fonti, la necessità di iniziare il trattamento dei campioni in 2 ore di raccolta, e la nostra vicinanza ai siti di raccolta. Con questa opportunità unica a portata di mano, il nostro obiettivo era quello di ottimizzare il trattamento per il massimo rendimento di DNA, RNA, siero e le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da ciascun campione (per un totale di N = 1.639 campioni in 5 ondate di raccolta del campione). Le procedure descritte qui possono essere eseguite contemporaneamente in un contesto non clinico, producendo materiale (vedi Tabella 1 per rendimenti medi) di partenza per un gran numero di applicazioni a valle, tra cui microarray, epigenetica, real-time RT-PCR, e citometria a flusso analisi.
Figura 1. flusso di lavoro complessivo. Il processo globale raffigurato qui comprende la logistica di ottenere i campioni di sangue da identificare consenzienti particparte- al sangue disegnare sé. Di alta qualità, le frazioni (cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC, DNA, siero, e RNA) di sangue intero fresco può essere prodotto in 2 ore di raccolta e di tutti i campioni del test-ready può essere disponibile entro 2 giorni. Inoltre, le frazioni preparati con questo metodo sono adatti per lo stoccaggio a lungo termine se i campioni non devono essere testati immediatamente. L'intera timeline qui delineato potrebbe essere completata in un solo giorno (~ 5 ore in totale). Tuttavia, un tale giorno sarebbe estremamente laborioso soprattutto per un singolo tecnico con esperienza sostanziale con le tecniche. Pertanto, si consiglia di dividere le procedure il giorno 1 tra almeno due tecnici e il completamento del trattamento RNA Day 2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocol
La Health Study Detroit Quartiere è stato esaminato e approvato dalla University of Institutional Review Board del Michigan. Tutti i partecipanti a condizione consenso informato prima della loro partecipazione allo studio.
1. Panoramica
- Correttamente documentare tutte le fasi di reclutamento attraverso l'analisi dei dati degli endpoint. Eseguire i protocolli contemporaneamente Giorno 1, stadi interruttori e si sovrappongono come il tempo lo permette. La sequenza di fasi è scritto per ottimizzare l'efficienza delle prestazioni. La Figura 1 fornisce una panoramica dell'intero processo.
Nota: Il termine "partecipante" viene utilizzato per indicare tutto il campione di sangue de-identificato tratto da un individuo consenziente. I tempi tra parentesi indicano di seguito hands-on tempo. Esempi del foglio tracking e log campione possono essere trovati nelle tabelle supplementari S1 e S2, rispettivamente. I campioni vengono raccolti da flebotomi nelle casedi individui identificati come consenziente partecipanti dal coordinatore dello studio e trasportati al laboratorio da un corriere (vedi Informazioni supplementari (SI) 1 per ulteriori dettagli pre-elaborazione).
2. Giorno 1 Setup
- Preparare salino 1x fosfato tamponata (PBS).
- Preriscaldare un blocco di calore a 56 ° C.
- Preparare la proteasi (vedi SI 2) aliquotandolo 20 microlitri nel numero adeguato di appositi tubi microcentrifuga per le consegne del giorno (2 per partecipante).
- Garantire Buffer AW1 e AW2 (tamponi di lavaggio fornite nel kit isolamento del DNA che aumentano la purezza del DNA) sono pronti per l'uso, l'aggiunta di etanolo al 100% come indicato in etichetta, se necessario.
- Raffreddare centrifuga refrigerata a 4 ° C.
- Riposizionare il tappo sulla bottiglia di PBS 1x con il tappo di gomma fornite e setto perforare il setto di gomma con un picco di trasferimento, mantenendo il tappo a vite in cima alla spi trasferimentoke per evitare l'evaporazione. Ripetere con il flacone di soluzione stabilizzazione dell'RNA.
- Dopo la preparazione del blocco buffer, centrifuga e calore, documentare momento della consegna vacutainer sul foglio inseguimento campione (vedi Tabella SI).
3. Giorno 1: Elaborazione di campione di sangue intero per DNA, PBMC e dei leucociti RNA (2 ore)
- Panoramica
- Assegnare il tempo sufficiente per ridurre al minimo il ritardo tra prelievo di sangue, ora di inizio lavorazione. Iniziare trasformazione delle contenenti vacutainer Ficoll in 2 ore di prelievo di sangue per evitare un aumento della contaminazione dei globuli rossi e una diminuzione nel recupero delle cellule mononucleate.
- Assumere collezione di 2 vacutainer contenenti gel gradiente Ficoll, 2 K 2 etilendiamminotetraacetico (EDTA) vacutainer e 1 siero vacutainer per partecipante adulto. Al momento della consegna dei vacutainer al laboratorio, hanno un tecnico firmare il foglio di inseguimento a significare l'accettazione dei campioni. Elemosinarenella lavorazione immediatamente con l'ora di inizio documentato su una base per vacutainer sul log provino.
- Siero di isolamento Fase 1 (1 min)
- Documento l'ora di inizio sul registro del campione (vedi Tabella 2 SI). Centrifuga (con freno e accelerazione OFF) la vacutainer siero 7.0 ml (rosso) (1 per partecipante) utilizzando un rotore oscillante secchio con tappi di aerosol (livello di biosicurezza 2; certificata BSL2) per 20 minuti, 1.300 xg, 4 ° C.
- L'isolamento del DNA Fase 1 (15 min)
Nota: Per maggiori dettagli su questa procedura di isolamento, vedi protocollo del produttore 13.- Documentare l'ora di inizio. In una cappa coltura cellulare BSL2, invertire i vacutainer contenente gel Ficoll 5 volte poi aggiungere 200 ml di sangue intero dalla parte superiore di una delle vacutainer in ciascuna delle due aliquote 20 microlitri di proteasi (400 ml totali per partecipante). Lasciando i tubi della proteasi + microcentrifuga sangue nella cappa, continuare con il Centrifugation del Ficoll contenente vacutainer al punto 3.4.1.
Nota: Utilizzare il vacutainer con il maggior volume di raccolta, tenendo presente la necessità di bilanciare la centrifuga (cioè, può essere necessario rimuovere 200 ml di ciascuna delle due vacutainer) quando a girare le vacutainer nel passaggio 3.4.1. Inoltre, per garantire la corretta separazione durante la lavorazione dei vacutainer blu, il livello del sangue che rimane nel vacutainer non deve essere inferiore a 2,5 pollici sopra lo strato Ficoll.
- Documentare l'ora di inizio. In una cappa coltura cellulare BSL2, invertire i vacutainer contenente gel Ficoll 5 volte poi aggiungere 200 ml di sangue intero dalla parte superiore di una delle vacutainer in ciascuna delle due aliquote 20 microlitri di proteasi (400 ml totali per partecipante). Lasciando i tubi della proteasi + microcentrifuga sangue nella cappa, continuare con il Centrifugation del Ficoll contenente vacutainer al punto 3.4.1.
- PBMC isolamento Fase 1 (1 min)
- Documentare l'ora di inizio (deve essere in 2 ore di prelievo di sangue al fine di evitare un aumento della contaminazione dei globuli rossi e una diminuzione della ripresa cellule mononucleate) .Invert il Ficoll contenente vacutainer 8-10 volte. Centrifuga (con freno e accelerazione OFF) i vacutainer (2 per ogni partecipante) utilizzando un rotore oscillante secchio con tappi di aerosol (BSL2 certificato) per 30 min, 1600 x grammi, 22 ° C.
- Ritorna alla cappa e aggiungere 200 microlitri Buffer AL a ciascuno dei tubi proteasi + sangue microcentrifuga (passo 3.3.1). Cap, togliere dal cappuccio, vortice 15 sec e flash di spin.
- Incubare 56 ºC in un blocco di calore, 10 min.
- Rimuovere i tubi dal blocco di calore. Rotazione Flash. Ritorna alla cappa BSL2. Aggiungere 200 pl di etanolo al 100%. Cap, togliere dal cappuccio, vortice 15 sec e flash di spin. I passaggi rimanenti possono essere completati esterna della cappa.
- Applicare lisato (entro 30 minuti della fase 3.5.3) per una colonna numerica denominata (in un tubo di raccolta da 2 ml). Chiudere il tappo per evitare la contaminazione incrociata tramite aerosol. Centrifuga 6000 xg, 1 min.
- Eliminare il Collection tube contenente il filtrato e posizionare la Spin Column in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml.
- Aggiungere 500 microlitri Buffer AW1 alla colonna, senza inumidire il bordo, chiudere il tappo e centrifugare 6.000 xg, 1 min.
- Eliminare il Collection tube contenente la filtrazionete e posizionare la Spin Column in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml.
- Aggiungere 500 microlitri Buffer AW2 alla colonna, senza inumidire il bordo, chiudere il tappo e centrifugare 20.000 xg, 3 min.
- Eliminare il Collection tube contenente il filtrato e posizionare la Spin Column in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 ml (non incluso nel kit), e centrifugare 20.000 xg, 1 min.
- Scartare il tubo di raccolta contenente il filtrato e posizionare la Spin Column in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 ml (non incluso nel kit).
- Aggiungere 200 microlitri tampone AE o acqua per ogni colonna e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifuga 6000 xg, 1 min.
- Ripetere il punto 3.5.11 eluizione nello stesso tubo di raccolta.
- Pool il DNA eluito dalle 2 colonne per partecipante. Totale resa ~ 800 microlitri per partecipante.
- Quantificare i campioni utilizzando uno spettrofotometro quando il tempo lo permette.
- Aliquota del DNA come desiderato in 2 ml cryovials, documentando la concentrazione di ogni sul specimelog n. Trasferimento cryovials a un cryobox e posto a -80 ° C per una conservazione a lungo termine. Documentare l'ora di inizio congelatore.
Nota: eseguire in una cappa di coltura cellulare livello di biosicurezza 2 certificata. Per ulteriori dettagli su questo isolamento vedere le istruzioni del produttore 15.
- Perforare il tappo di gomma del K 2 EDTA vacutainer con un picco di trasferimento. Conservare la guaina e tappo a vite per l'utilizzo in fase 3.6.11. A seguito di pratiche standard BSL2, fare attenzione ad evitare l'esposizione a patogeni a trasmissione ematica.
- Attaccare il connettore slittamento bianco all'inizio del picco trasferimento.
- Etichettare il filtro con il corrispondente ID partecipante quindi collegare l'ingresso (estremità svasata) del filtro al connettore intonaco bianco.
- Attaccare una guaina 25⅝ ago G alla presa (estremità rastremata) del filtro. Preparazione del gruppo del filtro prima della consegna accelera notevolmente il processo e quindi,collegare il connettore slittamento bianco al picco trasferimento, aggiungendo il filtro, quindi l'ago inguainato e impostando il gruppo in un rack provetta fino al momento dell'uso, è raccomandato.
- Dopo il montaggio del sistema di tubi K 2 EDTA, estrai sicuro l'ago (utilizzare l'estremità di una spatola metallica). Pugnalare l'ago in un tubo da 10 ml raccolta di sangue sotto vuoto vuoto (siero tubo ricevitore) e invertire il gruppo del tubo di K 2 EDTA vacutainer / filtro / ricevitore. A seguito di pratiche standard BSL2, fare attenzione ad evitare l'esposizione a patogeni a trasmissione ematica.
- Lasciare il sangue filtrare attraverso fino sezioni cuneiformi del filtro hanno chiarito di sangue. Filtrazione richiede circa 2 minuti e può essere collocato in un rack provetta durante la filtrazione.
- Rimuovere il filtro dal gruppo. Lasciare l'ago nel tubo contenente il filtrato e scartare l'intero gruppo in un apposito contenitore.
- Attaccare una siringa da 5 ml per il picco di trasferimento sulla bottiglia di 1x PBS, invert la bottiglia, e prelevare 3 ml.
- Attaccare la siringa con PBS all'ingresso del filtro e lavare il filtro (3-5 gocce al secondo). Raccogliere il flusso continuo in un contenitore per rifiuti biologici. Togliere la siringa dal filtro senza ritrarre lo stantuffo.
- Dopo filtrazione e lavaggio PBS, prelevare 3 ml di agente di stabilizzazione RNA usando una nuova siringa da 5 ml e il metodo descritto al punto 3.6.8. Lavare il filtro come al punto 3.6.9. L'agente di stabilizzazione RNA deve rimanere sul filtro. Togliere la siringa dal filtro senza ritrarre lo stantuffo.
- Sigillare del filtro e di uscita con la guaina e la vite trattenuta dal picco di trasferimento lasciando il filtro saturo con l'agente stabilizzazione RNA. Il filtro può essere conservato a questo punto. Conservare il filtro a -80 ° C fino a quando il tempo lo permette (~ 2 ore) per completare i punti da 5.3 a 5.4.7.
Nota: I filtri conservati a -80 ° C per un massimo di un anno dopo la raccolta sono stati elaborati senza decrease in qualità di RNA.
- Rimuovere i contenenti vacutainer Ficoll dalla centrifuga (fase 3.4.1) e proseguire in un cappuccio BSL2. Vacutainer dovrebbero visualizzare separazione come in Figura 2. In caso contrario, vedere la Tabella 2.
- Una volta che il vacutainer viene restituito al cofano BSL2, rimuovere il tappo e prelevare 1,5 ml di top, giallastro, strato di plasma (figura 2) usando una pipetta sierologica, senza avvicinarsi alla mononucleare (bianco / trasparente) livello. Trasferire il plasma a 5 ml esageratamente - (Pool da 2 vacutainer - 1 partecipante). Accedere il volume raccolto. Vedere il punto 3.7.6 per istruzioni sulla conservazione.
Nota: Il migliore separazione e maggiori rendimenti PBMC vengono da partecipanti che hanno a digiuno, almeno 12 ore prima della raccolta del sangue. - Trasferire il plasma rimanente e biancastro, strato mononucleare (tutto sopra lo strato di gel - Figura 2) ucantare una pipetta sierologica, ad un tubo 15 ml conica, riunendo lo strato mononucleari da ciascuno dei due Ficoll contenente vacutainer per partecipante in una provetta conica.
- Aggiungere 1x PBS per portare il volume totale del tubo conico a 15 ml. Provetta con tappo e capovolgere 5 volte. Centrifuga (con freno e accelerazione OFF) 15 min, 300 grammi, 22 ° C.
- Ritorno alle contenenti vacutainer Ficoll nella cappa e raccogliere i globuli rossi (RBC) utilizzando un "Pasteur pipetta 5¾ a turbinare intorno e allentare la parte esterna dello strato di gel di Ficoll e rimuoverlo se possibile. Utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere e trasferire il globuli rossi (~ 4,5 ml) a 5 ml esageratamente. Accedere il volume raccolto.
- Trasferire entrambi i 5 ml cryovials (plasma nel passaggio 3.7.2 e globuli rossi nel passaggio 3.7.5) per un tasso di container congelamento controllato e messo a -80 ° C per almeno 24 ore dopo di che possono essere trasferiti ad un cryobox e restituiti -80 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Restituire il cotubo nica alla cappa, quando la centrifugazione al punto 3.7.4 è completo, e aspirare tutto ma ~ 500 microlitri di PBS senza disturbare il pellet. PBMC resa è maggiore se ~ 200 ml di PBS è lasciato sopra il pellet in questa fase.
- Aggiungere fresco 1x PBS per portare il volume a 10 ml. Risospendere il pellet delicatamente. Provetta con tappo e capovolgere 5 volte. Centrifuga (con freno e accelerazione OFF) 10 min, 300 grammi, 22 ° C.
Nota: eseguire in un cappuccio BSL2.
- Aliquota lo strato superiore siero dal vacutainer siero, dopo centrifugazione (fase 3.2.1), in 2 ml cryovials, se lo desideri. Resa tipica è di 2,5 ml (Tabella 1). Log volume. Ad esempio, utilizzare 4 cryovials aliquotandolo 200 ml in esageratamente 1, 1.000 ml in esageratamente 2 e poi dividere il restante in cryovials 3 e 4.
- Trasferire i cryovials ad un cryobox e posto a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. Documentare l'inizio congelatoreorario.
- Tornare al cofano, dopo centrifugazione (fase 3.7.8), e aspirare tanto surnatante / PBS possibile senza disturbare il pellet. Risospendere pellet pipettando in 2,5 ml PBMC congelamento Medio 1 (vedi SI 2).
- Aggiungere 2,5 ml PBMC Congelamento Media 2 (vedere SI 2) al / soluzione a medio cella al punto 3.9.1. Vortex delicatamente.
- Aliquota 10 ml di soluzione di cellule in una provetta 0,65 ml (ulteriore diluizione può essere necessario). Aggiungere 10 ml di 0,4% trypan macchia blu nella provetta 0,65 ml e mescolare pipettando più volte. Per ulteriori dettagli vedere il manuale del produttore 16.
- Dispensare 10 ml di miscela in una cella di conteggio vetrino da camera e posto scivolare nel contatore di cellule nel raggio di 3 minuti di miscelazione. Zoom in e mettere a fuoco le cellule. Premere il tasto "Contare le celle" per ottenere il conteggio PBMC.
- Aliquotare, se la vitaleNumero PBMC è superiore a 3 milioni di cellule per millilitro (mc / ml), se lo desideri in cryovials e continuare al passo 3.9.9. Conservare PBMC in un massimo di 5 cryovials ad una concentrazione di almeno 3 mc / ml ciascuno.
- Se il numero PBMC vitali è inferiore al 3 mc / ml, calcolare il numero totale di cellule moltiplicando la praticabile mc / ml da 5 ml. Dividere questo numero per 4, 3, 2 o 1 ml in modo che ci sia almeno un tubo con 3 mc / ml.
- Centrifugare il tubo conico contenente il / soluzione a medio congelamento cellule per 5 min a 300 xg (freno e accelerazione OFF). Dopo la centrifugazione, aspirare il volume appropriato di congelamento medium (supernatante) lasciando il volume calcolato sopra (4, 3, 2 o 1 ml).
- Risospendere il pellet nel surnatante rimanente e un'aliquota almeno 3 mc / ml nel numero appropriato di cryovials (1-4) a 1 ml / esageratamente. Medio di congelamento finale è del 10% dimetilsolfossido (DMSO) / 20% siero fetale bovino (FBS) / 70% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
- Document il conteggio delle cellule per esageratamente. Trasferire i cryovials ad un tasso contenitore congelamento controllato e messo a -80 ° C per almeno 24 ore dopo di che i cryovials possono essere trasferiti ad un cryobox e messi in un serbatoio di azoto liquido (fase vapore) per la conservazione a lungo termine. Documento congelatore ora di inizio.
4. Giorno 2 Setup
- Scaldare una aliquota (220 microlitri per filtro) di libera mM EDTA nucleasi 0,1 in un tubo privo di nucleasi a 80 ° C in un blocco di calore.
- Preparare le soluzioni di lavaggio 1 e 2 (vedere SI 2).
5. Giorno 2: a lungo termine conservazione e il filtro dei leucociti Processing (3 ore)
- Panoramica.
- Eseguire questa procedura entro 6 mesi dell'applicazione dei leucociti al filtro.
Nota: In generale, 2ª giornata trattamento dura circa 3 ore e mentre è etichettato "Day 2", il requisito fondamentale è che la parte di elaborazione del filtro deve essere eseguita in un giorno in cuinon c'è giorno 1 elaborazione avviene in laboratorio.
- Eseguire questa procedura entro 6 mesi dell'applicazione dei leucociti al filtro.
- Conservazione dei campioni lungo termine (15 min)
- Eseguire questa procedura ogni giorno, prima della consegna delle nuove vacutainer al laboratorio per il giorno 1 trattamento. Trasferire i cryovials che sono stati memorizzati O / N in contenitori tasso congelamento controllato il giorno 1 in cryoboxes opportunamente etichettati e restituirli a -80 ° C o azoto liquido (fase vapore) per la conservazione a lungo termine. Organizzare i cryovials base al tipo di campione (ad esempio, il DNA, PBMC, globuli rossi, ecc) per accelerare posizione campione di monitoraggio per le prove endpoint.
- Leucociti Filtri RNA Processing (45 min).
Nota: per ulteriori informazioni su questa procedura, consultare le istruzioni del produttore 17.- Portare il filtro di RT (scongelamento circa 5 min).
- Rimuovere la guaina e tappo a vite dal filtro. Ritrarre lo stantuffo di una siringa da 5 ml e collegarlo all'ingresso (estremità svasata) del filtro, premere lo stantuffoper espellere l'agente di stabilizzazione dell'RNA dai porti filtro in un contenitore per rifiuti biologici.
- Caricare una nuova siringa da 5 ml con 4 ml di una soluzione di isotiocianato di fenolo e guanidina per l'isolamento di RNA e collegarlo all'ingresso del filtro, premere lo stantuffo per svuotare la soluzione attraverso il filtro, raccogliendo il lisato in una provetta da 15 ml conica etichettati (2 per partecipante).
- Scollegare la siringa dal filtro, retrarre lo stantuffo, ricollegarlo al filtro, e premere il pistone per espellere campione residua rimasta intrappolata nel disco filtro nelle stesse tubo da 15 ml. Gettare il filtro e la siringa.
- Aggiungere 800 microlitri BCP al tubo conico, chiudere il tubo ermeticamente e agitare vigorosamente la preparazione per 30 sec.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare per 10 min a 2000 x g.
- Trasferire la fase acquosa (alto) per un appena etichettato tubo da 15 ml (~ 2,5 ml).
- Aggiungere 0,5 volte il volume della fase acquosa di acqua priva di nucleasi und mescolare bene. Quindi aggiungere 1,25x il volume acquosa di etanolo al 100% e mescolare ancora.
Nota: Per un volume acquosa 2,5 ml, aggiungere 1,25 ml di acqua priva di nucleasi, mescolare, quindi aggiungere 4.7 ml di etanolo al 100% (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml di acqua priva di nucleasi ALLORA 2,5 ml + 1,25 ml = 3.75 ml nuovo volume acquoso ALLORA 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml 100% di etanolo). Questa fase consente l'isolamento di RNA totale che comprende la piccola frazione RNA. Un metodo per omettere i piccoli RNA dall'isolamento possono essere trovate nel manuale 17. - Rimuovere lo stantuffo da una siringa da 5 ml e inserire una cartuccia rotazione al suo posto. Fissare il gruppo della cartuccia / siringa a una depressione del collettore. Per una connessione più sicura al collettore del vuoto, posizionare il gruppo della cartuccia / siringa all'interno di una provetta da 1,5 ml con il fondo tagliato.
- Applicare il campione dal punto 5.3.8 alla cartuccia rotazione lentamente con il vuoto su, aggiungendo più accuratamente campione viene tirato attraverso la cartuccia.
Nota: se non vuoto èpresente, vedere metodo centrifugazione a http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf. - Trasferire la cartuccia di selezione per una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 750 ml di Wash 1. Centrifugare la cartuccia di spin / gruppo del tubo 5 - 10 sec a 12.000 x g.
- Eliminare filtrato dal tubo e restituire la cartuccia di selezione per la stessa provetta.
- Aggiungere 750 ml di Wash 2 e centrifugare la cartuccia di spin / provetta per 5 - 10 sec a 12.000 x g. Eliminare filtrato come al punto 5.3.12. Restituire la cartuccia di selezione per la stessa provetta.
- Ripetere con altri 750 ml di Wash 2 e centrifugazione come al punto 5.3.13. Filtrato scarto. Restituire la cartuccia di selezione per la stessa provetta. Centrifugare la cartuccia di spin / tubo alla massima velocità per 1 minuto per asciugare il filtro.
- Trasferire la cartuccia di selezione per un nuovo, marcato 1,5 provetta ml.
- Aggiungere 200 ml di 0,1 mM EDTA priva di nucleasi (preriscaldato a 80 & #176; C) al centro del filtro a cartuccia centrifuga (2 per partecipante). Incubare a temperatura ambiente per 1 min.
- Centrifugare per 1 minuto a 12.000 xg per eluire l'RNA. Conservare il filtrato. Gettare la cartuccia di spin.
- Dividere ogni filtrato 200 ml in due, 100 microlitri aliquote in nuove provette da 1,5 ml microcentrifuga, etichetta e tenere in ghiaccio. A questo punto, a partire da 2 filtri per partecipante produrrà quattro 100 microlitri aliquote di RNA per partecipante.
- Trattamento DNasi (1 ora)
Nota: Per ulteriori dettagli su questo trattamento vede protocollo del produttore 18.- Creare un master mix combinando 10 ml di DNasi I buffer e 2 microlitri rDNase I per aliquota + 1 (per tenere conto di pipettaggio errore).
Nota: per quattro campioni, aliquote di 100 microlitri utilizzano 50 microlitri DNasi I buffer + 10 microlitri rDNase I. - Aliquota 12 microlitri della master mix al punto 5.4.1 in ciascuna delle aliquote di RNA dal punto 5.3.18 e mescolare delicatamente. Incubare a 37° C per 30 minuti in un blocco di calore.
- Vortex la DNasi inattivazione del reagente e aggiungere 11,2 ml a ciascuna aliquota, mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti su vortex 2-3 volte durante l'incubazione.
- Centrifugare a 10.000 g per 1,5 minuti.
- Trasferire il surnatante (RNA) per una nuova provetta da 1,5 ml. Aliquote dallo stesso partecipante possono essere raggruppati qui.
- Eseguire ogni campione su uno spettrofotometro per ottenere la concentrazione. Una analisi della qualità dell'RNA è raccomandato con un Bioanalyzer (vedi punto 5.5).
- Aliquota della RNA in cryovials, se lo desideri. Se un'analisi Bioanalyzer non verrà eseguita immediatamente, un'aliquota di 1,5 ml di campione in una provetta per analisi successive. Documentare le concentrazioni e l'ora di inizio congelatore. Conservare i campioni a -80 ° C.
- Creare un master mix combinando 10 ml di DNasi I buffer e 2 microlitri rDNase I per aliquota + 1 (per tenere conto di pipettaggio errore).
- Bioanalyzer analisi (1 ora)
- Seguire il protocollo del produttore 19. Quando la corsa è completa, i dati vengono memorizzati automaticamente, ma salvarlo di nuovo won una, il nome del file più riconoscibile piccolo. Risultati attesi (Figura 3): la scaletta dovrebbe avere 6 vette, i campioni devono avere 3 picchi (2 picchi ribosomiale a 44 sec e 50 sec, rispettivamente, e 1 di picco marker precoce a 25 sec).
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Representative Results
È essenziale che la procedura generale produrre materiale di alta qualità per l'analisi in una moltitudine di applicazioni a valle compresa l'espressione genica tramite microarray e l'analisi RT-PCR, rilevazione di modificazioni epigenetiche, e variazioni subset cellulare. Tabella 1 indica la resa media e qualità dei materiali da ciascuno dei processi. La figura 3 fornisce un esempio dell'output qualità dell'isolamento leucociti RNA e filtri metodi di lavorazione. L'immagine in alto a sinistra della figura 3 è l'immagine gel risultante dalla elettroforesi capillare. Ogni corsia dovrebbe produrre due fasce distinte con ombre minimo che indicherebbe la degradazione. I cromatogrammi sotto il gel forniscono un aspetto aggiuntivo al livello e tipo di degradazione che può essere determinato sulla base della posizione e le dimensioni dei picchi. L'RNA Integrity Number (RIN) è un'altra misura di qualità che va da 1 (basso, degradato) a10 (alto, puro, l'RNA di buona qualità).
Tale metodologia un alto rendimento si presta ad un errore occasionale, ma ci sono diversi controlli durante le varie fasi di lavorazione per garantire il controllo della qualità. La Figura 2 mostra la separazione corretta centrifugazione del vacutainer contenente Ficoll. Ci sono diversi motivi un vacutainer non può visualizzare questa separazione tra cui un errore di velocità di centrifugazione, basso volume di raccolta, o la mancanza di un partecipante digiuno come indicato nella tabella 2.
Sottoinsiemi (n = 100) dei campioni isolati con questa procedura sono stati analizzati con successo da HumanMethylation27 (HM27) DNA Analysis BeadChips compresa la convalida di tali risultati da pirosequenziamento 11. La genotipizzazione, mirati pyrosequencing bisolfito, e real-time RT-PCR è stata eseguita con successo nel Wildman e Uddin laboratori 20,21,22,23. Siero, isolati nel parallel con l'isolamento del DNA sia per la genotipizzazione Beadchip e analisi, è stato analizzato con successo per IL-6 e C-reattiva proteina attività 24. Sottoinsiemi di cellule T dai PBMC isolate sono stati analizzati con successo mediante citometria di flusso 25-28. Inoltre, la procedura di RNA da leucociti modificato è stato sottoposto a Genoma espressione genica larga profiling 29.
Figura 2. separazione Strato dopo centrifugazione Ficoll contenente vacutainer. Una visualizzazione della separazione dei diversi componenti del sangue dopo centrifugazione. Lo strato di cellule mononucleate è ulteriormente purificato, mentre gli altri livelli vengono conservati a -80 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Risultati attesi dalla lavorazione leucociti RNA. Bioanalyzer risultati che mostrano due bande distinte che rappresentano 18S e 28S RNA ribosomiale con i numeri di integrità dell'RNA (RIN) di cui sopra 8 isolati con i metodi descritti leucociti isolamento di RNA e filtro di elaborazione (vedi protocollo di 3.6 e 5.3). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Totale Rendimento Medio (N≈500) | Qualità media | |
| Siero | 2.30 ml | N / A |
| DNA da sangue intero | 39.97 ug | Assorbanza a 260/280 = 1.74 |
| PBMC | 22.25 milioni di cellule vitali | Almeno il 95% di vitalità isolamento complessiva |
| RNA da leucociti | 44.09 ug | Assorbanza a 260/280 = 2.01 RNA Integrity Number (RIN) = 6,48 |
I rendimenti Tabella 1. previsto. Quantità media e la qualità dei campioni trattati con le modalità descritte.
| Problema | Potenziale Soluzione |
| Nessuna separazione dopo Ficoll contenente vacutainer centrifugazione | Vacutainer non è compilato alla capacità - il volume minimo di raccolta per il trattamento adeguato è di 6 ml. |
| Controllare le impostazioni centrifuga, assicurarsi che la velocità sia in forza g. Se non è corretto, impostato su G-Force e respin. | |
| Basso PBMC count | Volume di sangue disegnare troppo basso. |
| Aspirato troppo vicino al pellet al punto 3.7.8 | |
| Partecipante non a digiuno. | |
| Nessuna separazione dopo vacutainer siero centrifugazione | Controllare le impostazioni centrifuga, assicurarsi che la velocità sia in forza g. Se non è corretto, impostato su G-Force e respin. |
| Concentrazione imprevisto utilizzando il NanoDrop 1000 | Assicurarsi che la misura è per il tipo di campione appropriato (ad esempio, il DNA o RNA). |
Tabella 2. Risoluzione dei problemi. I problemi più comuni riscontrati con i metodi descritti e le possibili soluzioni.
Supplementari Tabella 1. scheda di monitoraggio. Un esempio di tracciare i vacutainer from di raccolta del sangue alla consegna di laboratorio. Cliccate qui per vedere questa tabella.
Supplementari Tabella 2. registro dei campioni. Un esempio di documento utilizzato per documentare il trattamento dei vacutainer al momento della consegna al laboratorio. Cliccate qui per vedere questa tabella.
Tabella 3. complementari esageratamente sistema di numerazione. Un esempio del sistema di numerazione utilizzato per ogni partecipante. Clicca qui per visualizzare questa tabella.
Informazioni supplementari 1. Dati preelaborazione. Dettagli le funzioni di coordinatore dello studio, Corriere e flebotomo. Clicca qui per visualizzare le informazioni supplementari 1.
Informazioni supplementari 2. ricette. Un elenco di ricette per i reagenti necessari. Cliccate qui per visualizzare informazioni supplementari 2.
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Discussion
Abbiamo descritto un protocollo semplificato che è stato applicato con successo a elaborare più di 1.600 campioni di sangue intero in Health Study Detroit Quartiere. Sebbene molte di queste tecniche sono disponibili in letteratura, il nostro compilazione passo-passo, comprese le modifiche temporizzati precisamente ogni aumento, riflette una ottimizzata, protocollo efficiente che produce con successo una varietà di campioni biologici con una vasta gamma di applicazioni a valle, tra cui la metilazione del DNA, espressione di mRNA e analisi immunologiche. Questi esemplari sono già stati testati in una serie di esperimenti, i cui risultati sono stati pubblicati nella letteratura peer-reviewed e / o presentati a convegni nazionali 11,20,21,23,24,29. Questo protocollo dovrebbe quindi essere di interesse per altri investigatori che cercano di raccogliere campioni biologici in studi di popolazione simili al DNHS.
Quando trattano i campioni in un tale alto throughput modo, è della massima importanza per mantenere un registro accurato in tutte le fasi. Si consiglia di sviluppare un database per memorizzare tutte le informazioni esageratamente fin dall'inizio. Questo database dovrebbe includere tutti gli aspetti del campione all'interno di ogni esageratamente tra cui il volume, la concentrazione, la qualità, il codice a barre, e posizione di memorizzazione (stoccaggio numero della casella e posizione all'interno della scatola). Si consiglia di preparare cryovials pre-etichettati e scatole di stoccaggio che contengono un codice a barre. Inoltre, abbiamo trovato conveniente avere un documento "master" che contiene i codici a barre per ogni tubo, specifiche per ogni partecipante (Tabella S3). Questo consente un rapido inserimento dei dati nel database esageratamente senza eccessive manipolazioni dei campioni, introducendo inutili cicli di congelamento / scongelamento ai campioni ed elimina il rischio di errori umani nell'inserimento nelle barre manualmente. È anche essenziale che le etichette aderiscano alle estreme (ad esempio, in fase vapore di azoto liquido a -150 -178ºC) temperature. La documentazione può richiedere molto tempo, e con la necessità di trattamento efficace al momento della consegna, abbiamo trovato che avere almeno due tecnici dividono i processi produce la massima efficienza.
Una limitazione di questo metodo è la vicinanza del laboratorio al sito di raccolta. Per PBMC isolamento, in particolare, i campioni devono essere trattati in 2 ore di raccolta per evitare aumenti significativi della contaminazione dei globuli rossi e diminuisce nelle cellule mononucleari vitali. In quanto tale, il laboratorio deve essere non più di 30 minuti da un centro di raccolta per tenere conto di eventuali problemi relativi al traffico che potrebbero sorgere. Inoltre, ogni laboratorio propone di intraprendere il protocollo descritto qui richiederà due tecnici a disposizione per garantire un trattamento ottimale del campione. Inoltre, ogni laboratorio deve avere accesso alle apparecchiature necessarie per ogni passo descritto sopra. Così, laboratori con meno personale e / o di attrezzature limitata would probabilmente in grado di intraprendere questo protocollo.
Un vantaggio di questo protocollo è la capacità di raccogliere campioni direttamente nelle case degli individui consenzienti. Questo permette lo studio di raggiungere le persone con problemi mentali o altri sanitari che non sarebbero normalmente cercare aiuto medico, forse a causa di una mancanza di assicurazione o il trasporto. E 'anche il confronto permette di individui affetti e non vivono all'interno della stessa comunità che hanno sperimentato i trigger simili, ma differiscono in termini di sintomi di salute mentale. Ottenere campioni in questo modo richiede tempi precisi e coordinamento flebotomisti nel campo. Perché il nostro laboratorio era situato all'interno della comunità stavamo studiando, un flebotomo potrebbe tipicamente raccogliere campioni da due-tre case e fornire i campioni al laboratorio all'interno della finestra 2 ore della prima collezione. L'efficienza è la chiave per il nostro campione di trasformazione, e come tale, abbiamo avuto più flebotomi nelcampo, aumentando la necessità di un coordinamento preciso. Il laboratorio ha ricevuto consegne multiple di sangue con un massimo di otto partecipanti per la consegna distanziate 2 ore a parte. I flebotomi sono incontrati in un luogo designato e hanno unito le loro collezioni con una sola flebotomo consegna dei campioni al laboratorio come una stessa partita. I metodi qui descritti possono essere facilmente adattati per studiare molti altri fenotipi ei campioni biologici raccolti possono essere utilizzati in una moltitudine di saggi a valle.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25 G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5 ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5 M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1 mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1 ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15 ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2 ml and 5 ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8 ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6 ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5 ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
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