Abstract
Erhebung und Verarbeitung von Vollblut-Proben in einem nicht-klinischen Umfeld bietet eine einzigartige Gelegenheit, selbstständig lebenden Personen mit und ohne Vorerkrankungen zu bewerten. Schnelle Verarbeitung dieser Proben ist wichtig, um eine Verschlechterung der zellulären Schlüsselkomponenten zu vermeiden. Dazu zählen Verfahren zur gleichzeitigen Pbmc (PBMC), DNA, RNA und Serum-Isolierung aus einer einzigen Blutprobe in den Häusern der zustimmenden Teilnehmer in einem Ballungsgebiet durchgeführt, mit der Verarbeitung innerhalb von 2 h Sammlung initiiert. Wir haben diese Techniken verwendet werden, um mehr als 1.600 Blutproben ergeben konsistente, hochwertige Materialien, die später in erfolgreiche DNA-Methylierung, Genotypisierung, Genexpression verwendet worden ist und Strömungsanalysen Zytometrie verarbeiten. Einige der verwendeten Methoden sind Standard; Wenn sie jedoch in der beschriebenen Weise kombiniert werden, eine effiziente Verarbeitung von Proben von Teilnehmern populations und / oder gemeinschafts ermöglichen siebasierte Studien, die normalerweise nicht in einer klinischen Umgebung ausgewertet würde. Daher hat dieses Protokoll die Möglichkeit, Proben (und anschließend Daten), die mehr repräsentativ für die allgemeine Bevölkerung zu erhalten.
Introduction
Mehrere Studien haben Unterschiede in der Genexpression, DNA-Methylierung und Zell-Untergruppe im Blut bei Menschen mit und ohne geistige (oder anderen) Erkrankungen 1-4 gekennzeichnet. Diese Studien haben jedoch in klinischen Settings, in denen krankheitsassoziierten Unterschiede können aufgrund des allgemein schwerer Natur der Krankheiten, für die Patienten, die Behandlung vergrößert werden erhalten. Aufgrund der Fortschritte in der "Omics" Ansätze hat die letzten zehn Jahre eine Explosion von Interesse an biologischen Proben aus Community und / oder epidemiologische Einstellungen 5-7, um populationsbasierte Schätzungen der Prävalenz der Krankheit geben und ein umfassenderes Bild des Gesehenen Umweltfaktoren dieser geistigen und / oder körperlichen Krankheiten.
Eine der größten Herausforderungen in dieser Hinsicht ist die Voraussetzung für eine schnelle Verarbeitung der gesammelten Proben. Abbau von mononuklearen Zellen, Schlüssel Immunsystem Komponenten, die frequentl sindy verwendet werden, um beurteilen die Gesundheit einer Person, beginnt unmittelbar nach Blutentnahme mit einer signifikanten Abnahme der Wiederaufnahme nach 2 Stunden der Sammlung 8-10. Um dieser Herausforderung zu begegnen, stellen wir Ihnen ein optimiertes Protokoll, bei dem mehrere Komponenten von menschlichem Vollblut gleichzeitig von Proben in den Häusern von Themen, die in einem großen Stadtgebiet erhalten wurde, isoliert. Das Protokoll ist nach unserer Zusammenstellung und Modifikation der aktuellen Techniken, einschließlich der Speicherung aller "extra" Fraktionen bei Zukunftstechniken ermöglichen eine weitere Isolierung der Basis / Analysen. Alternative Verfahren oder Kits können anstelle der hier beschriebenen einzelnen Methoden diejenigen umrissen eingesetzt werden haben sich als zuverlässige und effiziente Einrichtung zum Verarbeiten von Proben in einem Hochdurchsatz-Art sein. Hochwertige Fraktionen (PBMCs, DNA, Serum und RNA) von frischem Blut kann innerhalb von 2 Stunden der Sammlung und alle Test-ready Proben produzierten verfügbar innerhalb von 2 Tagen (Abbildung 1 sein).
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die effiziente Verarbeitung von Proben aus Community-Wohnung, erwachsenen Einwohner der Stadt von Detroit für die Prüfung in der Detroit Neighborhood Health Study gesammelt aktivieren (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), eine bevölkerungsbezogene Studie über die sozialen und biologischen Determinanten der posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD) und anderen psychischen Erkrankungen. Die Prävalenz von PTSD in Detroit mehr als zweimal der nationale Durchschnitt 11,12. Identifizierung von biologischen Determinanten von PTBS in dieser Population kann helfen, geeignete pharmakologische und / oder kognitiv-verhaltenstherapeutische Maßnahmen, um diejenigen, die an der Krankheit zu unterstützen entwickeln, sowohl in diesem städtischen Bevölkerung und in anderen Hochrisikogruppen (zB der Rückkehr Kriegsveteranen). Unser Labor, die zuvor an der Wayne State University in Detroit, Michigan, wurde für die Verarbeitung basierend auf unserem Know-how im Umgang mit frischen Gewebeproben von einer Vielzahl abgeleitet gewähltvon Quellen, um die Notwendigkeit, die Bearbeitung der Proben innerhalb von 2 Stunden der Sammlung zu beginnen, und unsere Nähe zu den Sammelstellen. Mit dieser einzigartigen Gelegenheit, bei der Hand, war es unser Ziel, um die Verarbeitung für höchste Ausbeute von DNA, RNA, Serum und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von jeder Probe (insgesamt N = 1.639 Proben über 5 Wellen der Probenentnahme) zu optimieren. Die hier beschriebenen Verfahren können gleichzeitig in einer nicht-klinischen Umfeld durchgeführt werden, wodurch Ausgangsmaterial (siehe Tabelle 1 für die Durchschnittserträge) für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich Microarray, epigenetischen, Echtzeit-RT-PCR und Durchflusszytometrie analysiert.
Abbildung 1. Gesamtarbeitsablauf. Die hier dargestellte Gesamtprozess umfasst die Logistik der Gewinnung der Blutproben von der Identifizierung zustimmenden particnehmer in die Blutabnahme selbst. Hochwertige, Fraktionen (periphere mononukleäre Blutzellen; PBMCs, DNA, Serum und RNA) von frischem Vollblut kann innerhalb von 2 Stunden der Sammlung produziert werden und alle Test-ready Proben können innerhalb von 2 Tagen zur Verfügung stehen. Darüber hinaus sind die durch dieses Verfahren hergestellten Fraktionen geeignet für Langzeitspeicherung, wenn die Proben nicht sofort getestet werden. Der gesamte Zeitachse hier skizzierten konnte an einem einzigen Tag (~ 5 Stunden insgesamt) abgeschlossen sein. Allerdings würde ein solcher Tag extrem arbeitsintensiv insbesondere für einen Monteur mit umfassender Erfahrung mit den Techniken. Daher empfehlen wir, Aufteilen der Verfahren an Tag 1 zwischen mindestens zwei Techniker und Abschluss der RNA-Prozessierung am Tag 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Protocol
Die Detroit Neighborhood Health Study wurde überprüft und von der University of Michigan Institutional Review Board genehmigt. Alle Teilnehmer, sofern vor ihrer Teilnahme an der Studie informierte Zustimmung.
1. Überblick
- Richtig dokumentieren alle Phasen von der Einstellung durch die Analyse von Endpunktdaten. Führen Sie die Protokolle an Tag 1 gleichzeitig, Schaltstufen und überlappenden, wie es die Zeit erlaubt. Die Folge von Stufen wird geschrieben, um Leistungseffizienz zu optimieren. Abbildung 1 gibt einen Überblick über den gesamten Prozess.
Hinweis: Der Begriff "Teilnehmer" wird durchgehend verwendet, um die de-identifizierte Blutprobe von einem mündigen Individuum gezeichnet zu bedeuten. Die Zeiten, in Klammern unter anzuzeigen, Hands-on-Zeit. Beispiele für das Tracking-Blatt und Probenprotokoll kann im Ergänzungs Tabellen S1 und S2 zu finden sind. Die Proben werden durch phlebotomists in den Häusern gesammeltvon Einzelpersonen als Zustimmung Teilnehmer vom Studienkoordinator und zum Labor transportiert durch einen Kurier identifiziert (siehe Zusatzinformationen (SI) 1 für eine weitere Vorverarbeitung Details).
2. Tag 1 Setup-
- Vorbereitung 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Heizen Sie einen Wärmeblock bis 56 ºC.
- Bereiten Sie die Protease (siehe SI 2) durch Aliquotierung 20 & mgr; l in die entsprechende Anzahl von Mikrozentrifugenröhrchen für die Tageslieferungen (2 pro Teilnehmer).
- Stellen Sie sicher, Puffer AW1 und AW2 (Waschpuffer in der DNA-Isolation Kit, das die Reinheit der DNA zu erhöhen) sind bereit für den Einsatz, indem 100% Ethanol, wie auf dem Etikett angegeben, falls erforderlich.
- Abkühlen Kühlzentrifuge bis 4 ° C.
- Setzen Sie die Kappe auf der Flasche 1x PBS mit dem mitgelieferten Gummimembran Kappe und durchbohren die Gummimembran mit einer Überführungsnadel, Beibehaltung der Schraubverschluss auf dem Transfer spike, um Verdunstung zu verhindern. Wiederholen Sie mit der Flasche RNA Stabilisierungslösung.
- Nach der Herstellung des Puffer, Zentrifuge und Wärmeblock, dokumentieren die Zeit der Vacutainer-Lieferung auf dem Probenverfolgungsblatt (siehe Tabelle SI).
3. Tag 1: Verarbeitungsvollblut-Probe für die DNA, PBMCs und Leukozyten-RNA (2 Stunden)
- Überblick
- Allot genügend Zeit, um die Verzögerung zwischen Blutentnahme und Verarbeitungsstartzeit zu minimieren. Beginnen Verarbeitung der Ficoll enthält Vacutainern innerhalb von 2 h der Blutabnahme, um eine Erhöhung der roten Blutkörperchen Kontamination und eine Abnahme der mononuklearen Zellwiederherstellung zu vermeiden.
- Nehmen Ansammlung von 2 Vacutainern gesammelt, die Ficoll-Gradienten-Gel, 2 K 2 Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Vacutainer und 1-Serum Vacutainer pro Erwachsener Teilnehmers. Bei der Lieferung der Vacutainern an das Labor, haben ein Techniker unterzeichnen die Tracking-Blatt bedeutet die Akzeptanz der Proben. Bettelnsofort die Verarbeitung mit dem Startzeitpunkt auf einer Pro-Vacutainer-Basis auf dem Probenprotokoll dokumentiert.
- Serum Isolation Stufe 1 (1 min)
- Dokumentieren Sie die Startzeit auf der Probenprotokoll (siehe Tabelle SI 2). Zentrifuge (mit Bremse und Beschleunigung OFF) der 7,0 ml Serum (rot) Vacutainer (1 pro Teilnehmer) mit einem Schwingbecher-Rotor mit Aerosolkappen (Biosicherheitsstufe 2; BSL2-zertifiziert) für 20 min, 1.300 xg, 4 ° C.
- DNA Isolation Stufe 1 (15 min)
Hinweis: Weitere Details zu diesem Isolationsverfahren siehe Herstellerprotokoll 13.- Dokumentieren Sie die Startzeit. In einem BSL2 Zellkultur Kapuze, invertieren die Vacutainern, die das Ficoll-Gel 5 mal danach 200 ul Vollblut von der Spitze eines der Vacutainer in jeweils zwei 20 ul Aliquots Protease (400 ul Gesamt pro Teilnehmer). So dass die Protease + Blutmikrozentrifugenröhrchen in der Kapuze, fahren Sie mit dem centrifugation des Ficoll enthält Vacutainern in Schritt 3.4.1.
Hinweis: Verwenden Sie den Vacutainer mit der größten Sammlung Volumen, unter Berücksichtigung der Notwendigkeit, den Ausgleich der Zentrifuge (dh, kann es notwendig sein, um 200 & mgr; l von jeder der beiden Vacutainern entfernen), wenn das Drehen der Vacutainer in Schritt 3.4.1. Zusätzlich, um eine ordnungsgemäße Trennung während der Verarbeitung der blauen Vacutainer zu gewährleisten, sollte der Pegel in dem Vacutainer restliche Blut nicht weniger als 2,5 Zoll über der Ficoll-Schicht sein.
- Dokumentieren Sie die Startzeit. In einem BSL2 Zellkultur Kapuze, invertieren die Vacutainern, die das Ficoll-Gel 5 mal danach 200 ul Vollblut von der Spitze eines der Vacutainer in jeweils zwei 20 ul Aliquots Protease (400 ul Gesamt pro Teilnehmer). So dass die Protease + Blutmikrozentrifugenröhrchen in der Kapuze, fahren Sie mit dem centrifugation des Ficoll enthält Vacutainern in Schritt 3.4.1.
- PBMC Isolierung Stufe 1 (1 min)
- Dokumentieren Sie die Startzeit (innerhalb von 2 Stunden der Blutabnahme sein, um eine Erhöhung der roten Blutkörperchen Kontamination und eine Abnahme der mononuklearen Zellrückgewinnung zu vermeiden) .Invert der Ficoll enthält Vacutainern 8-10 mal. Zentrifuge (mit Bremse und Beschleunigung OFF) die Vacutainer (2 pro Teilnehmer) mit einem Schwingbecher-Rotor mit Aerosolkappen (BSL2-zertifiziert) für 30 min, 1.600 xg, 22 ° C.
- Zurück zur Seite der Motorhaube und fügen Sie 200 ul Puffer AL zu jedem der Protease + Blutmikrozentrifugenröhrchen (Schritt 3.3.1). Cap, von der Haube zu entfernen, Vortex 15 Sekunden und Flash-Spin.
- Inkubieren Sie 56 ºC in einem Wärmeblock, 10 min.
- Die Rohre aus dem Wärmeblock entfernen. Flash-Spin. Zurück zu den BSL2 Kapuze. Fügen Sie 200 ul 100% Ethanol. Cap, von der Haube zu entfernen, Vortex 15 Sekunden und Flash-Spin. Die restlichen Schritte können außerhalb der Haube abgeschlossen sein.
- Gelten Lysat (innerhalb von 30 min aus Schritt 3.5.3) wird an eine markierte Spinsäule (in einem 2 ml-Sammelröhrchen). Schließen Sie den Deckel, um eine Kreuzkontamination durch Aerosole zu vermeiden. Centrifuge 6000 · g, 1 min.
- Entsorgen Sie das Collection Tube mitsamt Filtrat und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen.
- Fügen Sie 500 ul Buffer AW1 an die Säule ohne Befeuchtung der Felge, schließen Sie den Deckel, und Zentrifuge 6000 · g, 1 min.
- Entsorgen Sie das Collection Tube mitsamt filtrate und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen.
- Fügen Sie 500 ul Puffer AW2 auf die Säule ohne Befeuchtung der Felge, schließen Sie den Deckel, und Zentrifuge 20.000 xg, 3 min.
- Entsorgen Sie das Collection Tube mitsamt Filtrat und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Collection-Tube (nicht im Lieferumfang enthalten) und Zentrifuge 20.000 · g, 1 min.
- Entsorgen Sie das Collection Tube mitsamt Filtrat und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Collection-Tube (nicht im Lieferumfang enthalten).
- Fügen Sie 200 ul Buffer AE oder Wasser auf jede Säule und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Centrifuge 6000 · g, 1 min.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5.11 Elution in die gleiche Sammelröhrchen.
- Bündeln die eluierte DNA aus den 2 Spalten pro Teilnehmer. Gesamtausbeute ~ 800 & mgr; l pro Teilnehmer.
- Quantifizierung der Proben mit einem Spektralphotometer, wenn es die Zeit erlaubt.
- Wie in 2 ml-Kryoröhrchen gewünscht, dokumentiert die Konzentration von jedem auf der specime aliquoten DNAn log. Transfer Kryoröhrchen zu einem Kryobox Ort und bei -80 ° C für die langfristige Lagerung. Dokumentieren Sie die Gefrierstartzeit.
Hinweis: Führen Sie in einem biologischen Sicherheitsstufe 2 zertifizierte Zellkultur Kapuze. Weitere Einzelheiten zu dieser Isolierung siehe Herstellerangaben 15.
- Durchbohren die Gummimembran der K 2 EDTA Vacutainer mit einer Überführungsnadel. Bewahren Sie die Hülle und Schraubkappe zur Verwendung in Schritt 3.6.11. Nach BSL2 Standardpraktiken, kümmern sich um die Exposition gegenBloodBorne Pathogens zu vermeiden.
- Bringen Sie den weißen Slip-Anschluss an die Spitze der Führungsnadel.
- Beschriften Sie die Filter mit dem entsprechenden Teilnehmer-ID verbinden Sie dann den Einlass (aufgeweiteten Ende) des Filters zu dem weißen Slip-Anschluss.
- Bringen Sie einen ummantelten 25⅝ G-Nadel mit dem Ausgang (verjüngte Ende) des Filters. Vorbereiten der Filteraufbau vor der Auslieferung beschleunigt den Prozess erheblich und damit,Anbringen des weißen Slip Verbinders an der Führungsnadel, Addieren des Filters, dann der ummantelte Nadel und Einstellung der Anordnung in einem Kulturgefäßständer bis zur Verwendung empfohlen.
- Nach der Montage des K 2 EDTA-Röhrchen-System, sicher unsheathe die Nadel (verwenden Sie das Ende einer Metallspachtel). Stechen Sie die Nadel in eine leere 10 ml evakuierten Blutentnahmeröhrchen (Serum-Empfänger Tube) und invertieren die K 2 EDTA Vacutainer / filter / Receiver Röhrenanordnung. Nach BSL2 Standardpraktiken, kümmern sich um die Exposition gegenBloodBorne Pathogens zu vermeiden.
- Lassen Sie das Blut durch filtern, bis die keilförmigen Abschnitte des Filters haben Blut gelöscht. Filtration dauert ca. 2 min und in einem Reagenzglasgestell während der Filtration platziert werden.
- Entfernen Sie den Filter von der Baugruppe. Lassen Sie das Nadel im Gefäß mitsamt Filtrat und entsorgen Sie die gesamte Baugruppe in einem Scharfbehälter.
- Bringen Sie ein 5-ml-Spritze in die Überführungsnadel auf der Flasche 1x PBS, invert die Flasche, und ziehen Sie 3 ml.
- Befestigen Sie die Spritze mit PBS zu dem Einlass des Filters und spülen Sie den Filter (3-5 Tropfen pro Sekunde). Sammeln Sie die Durchströmung in einer biologischen Abfallbehälter. Nehmen Sie die Spritze aus dem Filter ohne Zurückziehen des Kolbens.
- Nach der Filtration und einer PBS waschen, zurückzutreten 3 ml der RNA-Stabilisierungsmittel mit einem neuen 5-ml-Spritze und die in Schritt 3.6.8 beschriebenen Verfahren. Spülen Sie den Filter wie in Schritt 3.6.9. Die RNA-Stabilisierung Mittel sollte auf dem Filter verbleiben. Nehmen Sie die Spritze aus dem Filter ohne Zurückziehen des Kolbens.
- Verschließen Sie die Filter Einlass und Auslass mit dem Mantel und Schraubverschluss aus der Überführungsnadel Verlassen des Filters mit RNA-Stabilisierungsmittel gesättigt beibehalten. Der Filter kann an diesem Punkt gelagert werden. Lagern Sie den Filter bei -80 ºC, bis die Zeit erlaubt (~ 2 Stunden) in Anspruch nehmen Sie die Schritte 5.3 bis 5.4.7.
Hinweis: Filter bei -80 ºC für bis zu einem Jahr nach der Sammlung gespeichert haben ohne decrea verarbeitetense in der RNA-Qualität.
- Entfernen Sie die Ficoll enthält Vacutainern aus der Zentrifuge (Schritt 3.4.1) und weiter in einem BSL2 Kapuze. Vacutainern sollten Trennung wie in Abbildung 2 angezeigt. Wenn nicht, siehe Tabelle 2.
- Sobald der Vacutainer ist mit der BSL2 Haube zurückgegeben, entfernen Sie den Stopfen und zurückzutreten 1,5 ml der oberen, gelblich, Plasmaschicht (Abbildung 2) unter Verwendung einer serologischen Pipette, ohne sich in der Nähe des einkernigen (clear / white) Schicht. Übertragen Sie das Plasma in einen 5 ml Kryoröhrchen - (Pool 2 Vacutainer - 1 Teilnehmer). Melden Sie sich das gesammelte Volumen. Siehe Schritt 3.7.6 für die Lagerung.
Hinweis: Die beste Trennung und größten PBMC Erträge stammen aus Teilnehmern, die mindestens 12 Stunden vor der Blutentnahme gefastet haben. - Übertragen Sie die restlichen Plasma und die weißliche, mononukleare Schicht (alles, was über der Gelschicht - Abbildung 2) usingen ein serologischer Pipette in ein 15 ml konischen Röhrchen, die Bündelung der einkernigen Schicht von jeder der beiden Ficoll enthält Vacutainern pro Teilnehmer zu einem konischen Rohr.
- Hinzufügen 1x PBS, um das Gesamtvolumen in dem konischen Rohr auf 15 ml zu bringen. Cap Rohr und Invert-5-mal. Zentrifuge (mit Bremse und der Beschleunigung OFF) 15 min, 300 × g, 22 ° C.
- Zurück zur Ficoll enthält Vacutainern in der Haube und sammeln Sie die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) durch die Verwendung eines 5 ¾ "Pasteur-Pipette, um wirbeln und lösen Sie die Außenseite des Ficoll Gelschicht und entfernen Sie sie, wenn möglich. Verwenden Sie eine serologische Pipette zu sammeln und zu überweisen Sie den roten Blutkörperchen (~ 4,5 ml) zu einer 5 ml Kryoröhrchen. Melden Sie sich das gesammelte Volumen.
- Übertragen Sie die 5 ml Kryoröhrchen (Plasma in Schritt 3.7.2 und RBCs in Schritt 3.7.5) zu einer gesteuerten Rate Gefrierbehälter und bei -80 ºC für mindestens 24 Stunden, wonach sie zu einer Kryobox übertragen werden und kehrte zu setzen -80 ºC für die langfristige Lagerung.
- Bringen Sie den Conische Rohr an der Haube, wenn die Zentrifugation in Schritt 3.7.4 abgeschlossen ist, und saugen alles, aber ~ 500 ul des PBS, ohne das Pellet zu stören. PBMC Ausbeute ist größer, wenn ~ 200 ul PBS ist über dem Pellet zu diesem Zeitpunkt verlassen.
- In frischem 1x PBS, um das Volumen auf 10 ml zu bringen. Das Pellet vorsichtig. Cap Rohr und Invert-5-mal. Zentrifuge (mit Bremse und der Beschleunigung OFF) 10 min, 300 × g, 22 ° C.
Hinweis: Führen Sie in einem BSL2 Kapuze.
- Aliquot der oberen Serumschicht aus dem Serum Vacutainer, nach der Zentrifugation (Schritt 3.2.1), in 2 ml-Kryoröhrchen nach Wunsch. Typische Ausbeute beträgt 2,5 ml (Tabelle 1). Melden Sie die Lautstärke. Verwenden Sie beispielsweise 4 Kryoröhrchen Aliquotierung 200 ul in Kryoröhrchen 1, 1000 ul in Kryoröhrchen 2 und teilen den übrigen in Kryoröhrchen 3 und 4.
- Übertragen Sie die Tieftemperaturampullen zu einem Kryobox Ort und bei -80 ºC für die langfristige Lagerung. Dokumentieren Sie die GefrierstartZeit.
- Zurück zu der Haube, nach der Zentrifugation (Schritt 3.7.8), und saugen so viel Überstand / PBS wie möglich, ohne das Pellet aufzurühren. Pellet mit einer Pipette in 2,5 ml PBMC Freezing Medium 1 (siehe SI 2).
- Hinzufügen von 2,5 ml PBMC Einfriermedium 2 (siehe SI 2) an der Zelle / Mittellösung in Schritt 3.9.1. Vortex vorsichtig.
- Aliquot 10 ul der Zell-Lösung in eine 0,65 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (weitere Verdünnung kann notwendig sein). In 10 ul 0,4% Trypanblau-Färbung in den 0,65 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mischen durch Pipettieren mehrmals. Für weitere Details siehe Handbuch des Herstellers 16.
- Pipettieren Sie 10 ul der Mischung in eine Zelle Zählkammer Rutsche und Platz Rutsche in den Zellzähler innerhalb von 3 Minuten der Vermischung. Zoom und Fokus in die Zellen. Drücken Sie die "Count Cells" zu erhalten PBMC zählen.
- Aliquot, wenn die lebensfähigenPBMC Zahl über 3 Millionen Zellen pro Milliliter (mc / ml), wie in Kryoröhrchen gewünschten und weiter zu dem Schritt 3.9.9. Speicher PBMCs in bis zu 5 Kryoröhrchen in einer Konzentration von mindestens 3 mc / ml.
- Wenn der lebensfähigen PBMC Zahl unter 3 mc / ml, die Berechnung der Gesamtzahl der Zellen durch Multiplizieren der lebensfähigen mc / ml bis 5 ml. Teilen diese Zahl durch 4, 3, 2 oder 1 ml, so dass es zumindest ein Rohr mit 3 mc / ml betragen.
- Zentrifuge das konische Röhrchen, die Zellen / Einfriermedium Lösung für 5 min bei 300 g (Brems- und Beschleunigungs OFF). Nach Zentrifugation absaugen geeigneten Volumen Gefriermedium (Überstand) Verlassen der oben unter (4, 3, 2 oder 1 ml) berechnete Volumen.
- Das Pellet in dem verbleibenden Überstand und Aliquots mindestens 3 mc / ml in die entsprechende Anzahl von Kryoröhrchen (1-4) bei 1 ml / Kryovial. Abschluss Einfriermedium 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) / 20% fötales Rinderserum (FBS) / 70% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
- DocumENT Der Zellzahl pro Kryoröhrchen. Übertragen die Kryoröhrchen mit einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierbehälter und bei -80 ºC für mindestens 24 Stunden, wonach die Kryoröhrchen kann einer Kryobox führt und in einem Flüssigstickstofftank (Dampfphase) zur Langzeitlagerung gebracht werden gesetzt. Document Gefrierstartzeit.
4. Tag 2 Setup
- Wärme ein Aliquot (220 ul pro Filter) nucleasefreiem 0,1 mM EDTA in einer Nuklease-freies Röhrchen auf 80 ° C in einem Heizblock.
- Bereiten Waschlösungen 1 und 2 (siehe SI 2).
5. Tag 2: Langzeit-Probenlagerung und Leukozytenfilter Processing (3 Stunden)
- Überblick.
- Führen Sie dieses Verfahren innerhalb von 6 Monaten nach der Antragstellung der Leukozyten an den Filter.
Hinweis: Insgesamt dauert Tag 2 Verarbeitungs etwa 3 h und während es ist mit "Tag 2", die wichtigste Voraussetzung ist, dass die Filterverarbeitungsabschnitt sollte an einem Tag durchgeführt werden, wennes gibt keinen Tag 1 Verarbeitung im Labor stattfindet.
- Führen Sie dieses Verfahren innerhalb von 6 Monaten nach der Antragstellung der Leukozyten an den Filter.
- Langzeitprobenlagerung (15 min)
- Führen Sie dieses Verfahren jeden Tag, vor der Lieferung neuer Vacutainern zum Labor für Tag 1 Verarbeitung. Übertragen Sie die Kryoröhrchen, die O / N in kontrollierter Geschwindigkeit Gefrierbehälter an Tag 1 gespeichert wurden in entsprechend gekennzeichneten Cryoboxen und wieder auf -80 ºC oder flüssiger Stickstoff (Dampfphase) für langfristige Lagerung. Organisieren Sie die Kryoröhrchen auf Basis von Probentyp (zB DNA, PBMC, RBCs, etc.), um Probenort zu beschleunigen Verfolgung für Endpunkt-Assays.
- Leukozyten RNA-Filter-Verarbeitung (45 min).
Hinweis: Weitere Informationen zu diesem Verfahren finden Sie die Anweisungen des Herstellers 17.- Bringen Sie den Filter auf RT (Auftauen ca. 5 min).
- Entfernen Sie den Mantel und Schraubkappe aus dem Filter. Fahren Sie den Kolben einer 5 ml Spritze und verbinden Sie es mit dem Einlass (aufgeweiteten Ende) des Filters, drücken Sie den Kolben, um die RNA-Stabilisierung Mittel zu vertreiben von den Filteröffnungen in einer biologischen Abfallbehälter.
- Laden eines neuen 5-ml-Spritze mit 4 ml einer Phenol und Guanidinisothiocyanat-Lösung für die RNA-Isolierung und sie an dem Einlass des Filters ist, drücken den Kolben, um die Lösung durch den Filter zu spülen, das Sammeln des Lysates in ein beschriftetes 15 ml konischen Röhrchen (2 pro Teilnehmer).
- Trennen Sie die Spritze aus dem Filter, den Kolben zurückzuziehen, wieder verbinden Sie es mit dem Filter, und drücken Sie den Kolben, um Restproben in der Filterscheibe eingefangen in die gleichen 15 ml konischen Röhrchen zu vertreiben. Entsorgen Sie Filter und Spritze.
- Fügen Sie 800 ul BCP zu dem konischen Rohr, schließen Sie das Rohr dicht und kräftig schütteln prep für 30 Sekunden.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge für 10 min bei 2.000 x g.
- Übertragen Sie die wässrige (obere) Phase zu einer frisch markierte 15 ml konischen Röhrchen (~ 2,5 ml).
- Mit 0,5-fache des Volumens der wäßrigen Phase des Nuclease-freiem Wasser eind gut mischen. Dann fügen Sie 1.25x der wässrigen Volumen von 100% Ethanol und nochmals mischen.
Hinweis: Für eine 2,5 ml wässrige Volumen, fügen 1,25 ml Nuclease freies Wasser, mischen, dann fügen Sie 4,7 ml 100% Ethanol (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml Nuclease freies Wasser DANN 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml neuen wässrigen Volumen THEN 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml 100% Ethanol). Dieser Schritt ermöglicht die Isolierung von Gesamt-RNA, die die kleinen RNA-Fraktion umfasst. Ein Verfahren, um die kleinen RNAs aus der Isolation weglassen finden Sie im Handbuch 17 gefunden werden. - Entfernen Sie den Kolben aus einer 5-ml-Spritze und legen Sie eine Spin Patrone an seinem Platz. Bringen Sie die Kartusche / Spritzenanordnung zu einer Vakuumkammer. Für eine sichere Verbindung mit dem Vakuumverteiler, legen Sie die Kassette / Spritzenanordnung innerhalb einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Boden abgeschnitten.
- Gelten die Probe aus Schritt 5.3.8 zur Spin Patrone langsam mit dem Vakuum, vorsichtige Zugabe weitere Probe, während sie durch die Kartusche gezogen.
Hinweis: Wenn kein UnterdruckDerzeit sehen Zentrifugationsverfahren bei http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf. - Übertragen Sie die Spin-Kartusche in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 750 ul Wasch 1. Zentrifugenschleuderpatrone / Rohrbaugruppe 5-10 sec bei 12.000 x g.
- Entsorgen Filtrat aus der Tube und gibt den Spin Patrone zum selben Reaktionsgefäß.
- Fügen Sie 750 ul Wasch 2 und Zentrifugenschleuderpatrone / Rohr für 5-10 sec bei 12.000 x g. Entsorgen Filtrat wie in Schritt 5.3.12. Bringen Sie den Spin Patrone zum selben Reaktionsgefäß.
- Wiederholen Sie mit einem anderen 750 & mgr; l Wasch 2 und Zentrifugation wie in Schritt 5.3.13. Verwerfen Filtrat. Bringen Sie den Spin Patrone zum selben Reaktionsgefäß. Zentrifugieren Sie die Spin-Kartusche / Rohr mit maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute, um den Filter trocknen.
- Übertragen Sie die Spin-Kartusche in ein frisches, beschriftet 1,5 ul-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 200 ul Nuklease-freies 0,1 mM EDTA (bis 80 & # vorgewärmt176; C) in die Mitte des Spinnfilterpatrone (2 pro Teilnehmer). Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min.
- Zentrifugieren für 1 min bei 12.000 × g, um die RNA zu eluieren. Bewahren Sie die Filtrat. Entsorgen Spin Patrone.
- Split jeder 200 ul Filtrat in zwei 100 ul Aliquots an die frische 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Etikett und auf Eis halten. An dieser Stelle wird ausgehend von 2 Filter pro Teilnehmer vier 100 ul Aliquots von RNA pro Teilnehmer ergeben.
- DNase-Behandlung (1 h)
Hinweis: Für weitere Informationen zu dieser Behandlung siehe Protokoll des Herstellers 18.- Erstellen Sie einen Master-Mix durch die Kombination von 10 ul DNase I-Puffer und 2 ul rDNase I pro Aliquot + 1 (zur Berücksichtigung von Pipettieren Fehler).
Hinweis: Bei vier Proben, 100 ul Aliquots verwenden 50 ul DNase I Puffer + 10 ul rDNase I. - Aliquot 12 ul des Master-Mix in Schritt 5.4.1 in jedes der RNA-Aliquots von Schritt 5.3.18 und vorsichtig mischen. Bei 37° C für 30 Minuten in einen Heizblock.
- Mischen Sie den DNase-Inaktivierung Reagenz und fügen 11,2 & mgr; l zu jedem Aliquot, gut mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 min verwirbelt 2-3mal während der Inkubation.
- Zentrifuge bei 10.000 × g für 1,5 min.
- Den Überstand (RNA) in ein frisches 1,5 ml-Tube. Aliquots aus dem gleichen Teilnehmer kann hier gebündelt.
- Führen Sie jede Probe auf einem Spektrophotometer, um die Konzentration zu erhalten. Ein Qualitäts-Analyse der RNA wird unter Verwendung eines Bioanalyzer (siehe Schritt 5.5) empfohlen.
- Aliquot der RNA in Kryoröhrchen nach Wunsch. Wenn ein Bioanalyzer Analyse nicht sofort aliquote 1,5 ul der Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen für eine spätere Analyse durchgeführt werden. Dokumentieren Sie die Konzentrationen und die Gefrierstartzeit. Proben bei -80 ° C.
- Erstellen Sie einen Master-Mix durch die Kombination von 10 ul DNase I-Puffer und 2 ul rDNase I pro Aliquot + 1 (zur Berücksichtigung von Pipettieren Fehler).
- Bioanalyzer Analyse (1 Stunde)
- Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers 19. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, werden die Daten automatisch gespeichert, sondern speichern Sie es erneut wit einem kleineren, erkennbare Dateinamen. Erwartete Ergebnisse (Abbildung 3): Der Leiter sollte 6 Peaks, Proben 3 Peaks (2 ribosomalen Peaks bei 44 sec und 50 sec bzw. 1 und früher Marker Peak bei 25 sec) zu haben.
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Representative Results
Es ist wichtig, dass das gesamte Verfahren zu produzieren hochwertiges Material für die Analyse in einer Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich Genexpression über Microarray und RT-PCR-Analyse, Erkennung von epigenetischen Modifikationen und Zell-Untergruppe Variationen. Tabelle 1 zeigt die durchschnittliche Ausbeute und Qualität der Materialien, von jedem der Prozesse dar. 3 stellt ein Beispiel für die Ausgabequalität der Leukozyten RNA Isolation und Filterverarbeitungsmethoden. Das Bild an der oberen linken Seite von 3 zeigt das Gelbild von der Kapillarelektrophorese ergeben. Jede Bahn sollte zwei verschiedene Bands mit minimaler Abschattung, die einen Abbau hindeuten würde zu produzieren. Die Chromatogramme unter dem Gel einen zusätzlichen Blick auf die Höhe und Art der Abbau, die auf der Grundlage der Lage und Größe der Spitzen bestimmt werden kann. Die RNA Integrity Number (RIN) ist eine weitere Maßnahme, die Qualität von 1 reicht (niedrig; abgebaut) bis10 (hoch; reine, gute Qualität RNA).
Ein solcher Hochdurchsatz-Methodik eignet sich für eine gelegentliche Fehler, aber es gibt mehrere Kontrollpunkte in den verschiedenen Verarbeitungsstufen, um die Qualitätskontrolle zu gewährleisten. Abbildung 2 zeigt die korrekte Trennung nach der Zentrifugation des Ficoll enthaltenden Vacutainer. Es gibt mehrere Gründe Vacutainer möglicherweise nicht diese Trennung einschließlich eines Fehlers in der Zentrifugiergeschwindigkeit, geringe Sammelvolumen oder Fehlen eines Fasten Teilnehmer anzuzeigen, wie in Tabelle 2 angegeben.
Untergruppen (n = 100) der Proben isoliert, wobei dieses Verfahren mit Erfolg durch HumanMethylation27 (HM27) DNA Analysis BeadChips einschließlich der Validierung dieser Ergebnisse durch Pyrosequenzierung 11 analysiert. Genotypisierung, gezielte Bisulfit Pyrosequenzierung, und Echtzeit-RT-PCR wurde erfolgreich im Wildman und Uddin Labors 20,21,22,23 durchgeführt. Serum, isoliert in ParAllel mit der DNA-Isolierung für sowohl die BeadChip und Genotypisierung analysiert wurde erfolgreich für die IL-6 und C-reaktives Protein-Aktivität von 24 analysiert. T-Zell-Untergruppen aus den isolierten PBMCs wurden erfolgreich mittels Durchflusszytometrie 25-28 analysiert. Zusätzlich RNA aus dem modifizierten Leukozyten Verfahren unterworfen worden Weitgenexpressions 29 Genoms.
Abbildung 2. Schichtentrennung nach Zentrifugation Ficoll enthaltenden Vacutainer. Eine Visualisierung der Trennung von Mehrfachblutkomponenten nach der Zentrifugation. Die mononukleare Schicht weiter gereinigt, während die anderen Schichten werden bei -80 ° C gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Erwartete Ergebnisse von Leukozyten RNA-Prozessierung. Bioanalyzer Ergebnisse anzeigt zwei verschiedene Banden, die 18S und 28S ribosomalen RNA mit RNA-Integrität Nummern (RIN) über 8 mit den beschriebenen Leukozyten RNA-Isolierung und Filterverarbeitungsmethoden (siehe Protokoll 3.6 und 5.3) getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Insgesamt Durchschnittliche Rendite (N≈500) | Durchschnittliche Qualität | |
| Serum | 2,30 ml | N / A |
| DNA aus Vollblut | 39,97 & mgr; g | Die Absorption bei 260/280 = 1,74 |
| PBMC | 22.250.000 lebensfähigen Zellen | Mindestens 95% Lebensfähigkeit der Gesamtisolierung |
| RNA, die aus Leukozyten | 44,09 & mgr; g | Die Absorption bei 260/280 = 2,01 RNA Integrity Number (RIN) = 6,48 |
Tabelle 1. Erwartete Erträge. Durchschnittliche Quantität und Qualität der Proben verarbeitet Verwendung der beschriebenen Verfahren.
| Problem | Potenzielle Lösung |
| Keine Trennung nach Ficoll enthält Vacutainer Zentrifugation | Vacutainer ist nicht vollständig gefüllt - die Mindestsammelvolumen für eine angemessene Verarbeitung 6 ml. |
| Überprüfen Zentrifugen Einstellungen, sollten Sie die Geschwindigkeit ist in g-force. Wenn falsch, zu G-Force und respin gesetzt. | |
| Low PBMC Count | Blutvolumen zu ziehen zu niedrig. |
| Saugt zu nahe an dem Pellet in Schritt 3.7.8 | |
| Nicht-Nüchtern-Teilnehmer. | |
| Keine Trennung nach Serum Vacutainer Zentrifugation | Überprüfen Zentrifugen Einstellungen, sollten Sie die Geschwindigkeit ist in g-force. Wenn falsch, zu G-Force und respin gesetzt. |
| Unerwartete Konzentration unter Verwendung des Nanodrop 1000 | Sicherstellen, dass die Messung mit der entsprechenden Probentyp (zB DNA oder RNA). |
Tabelle 2. Fehlerbehebung. Gemeinsame Probleme mit den beschriebenen Verfahren und mögliche Lösungen anzutreffen.
Ergänzende Tabelle 1 Tracking-Fenster. Ein Beispiel für die Verfolgung der Vacutainern from Blutentnahme für Labor Lieferung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle zu sehen.
Ergänzende Tabelle 2 Probenprotokoll. Ein Beispiel für das Dokument verwendet werden, um die Verarbeitung der Vacutainern bei Lieferung an das Labor zu dokumentieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle zu sehen.
Ergänzende Tabelle 3 Kryoröhrchen Numbering System. Ein Beispiel für das Nummerierungssystem für jeden Teilnehmer verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle zu sehen.
Zusatzinformationen 1. Vorverarbeitung Details. Profil die Aufgaben des Studienkoordinator, Courier und Phlebotomist. Bitte klicken Sie hier, um zusätzliche Informationen an: 1.
Ergänzende Informationen 2. Rezepte. Eine Liste der Rezepte für die notwendigen Reagenzien. Bitte klicken Sie hier, um zusätzliche Informationen zu sehen 2.
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Discussion
Wir haben eine schlanke Protokoll, das bereits erfolgreich angewendet wurde, um mehr als 1.600 Vollblut-Proben in der Detroit Neighborhood Health Study bearbeiten beschrieben. Obwohl viele dieser Verfahren sind in der vorhandenen Literatur zur Verfügung, unsere Schritt-für-Schritt-Zusammenstellung, einschließlich der genauen zeitlichen Änderungen zwischen jedem Schritt, spiegelt eine optimierte effizientes Protokoll erfolgreich produziert eine Vielzahl von biologischen Proben mit einer Vielzahl von Downstream-Anwendungen, einschließlich DNA-Methylierung, mRNA-Expression und immunologische Analyse. Diese Proben wurden bereits in einer Vielzahl von Experimenten, deren Ergebnisse wurden in peer-reviewed Literatur veröffentlicht und / oder auf nationaler Sitzungen 11,20,21,23,24,29 vorgestellt getestet. Dieses Protokoll sollte daher von Interesse für andere Forscher versuchen, biologische Proben in populationsbasierten Studien ähnlich der DNHS sammeln.
Bei der Verarbeitung von Proben in solchen Hoch throughput Weise ist es von größter Bedeutung, genaue Aufzeichnungen auf allen Stufen zu erhalten. Wir empfehlen die Entwicklung einer Datenbank, um alle Kryoröhrchen Informationen zu Beginn zu speichern. Diese Datenbank sollte alle Aspekte der Probe innerhalb jedes Kryoröhrchen einschließlich des Volumens, Konzentration, Qualität, Barcode und Speicherort (Aufbewahrungsbox Anzahl und Lage innerhalb der Box) enthalten. Wir empfehlen die Vorbereitung vormarkiert Kryoröhrchen und Aufbewahrungsboxen, die einen Barcode enthalten. Ferner haben wir gefunden, daß es bequemer, ein "Master" Dokument, das die Barcodes für jede Röhre, die spezifisch für jeden Teilnehmer (Tabelle S3) haben. Dies ermöglicht eine schnelle Eingabe der Kryoröhrchen Daten in die Datenbank ohne übermäßige Handhabung der Proben, die Einführung unnötiger Einfrieren / Auftauen der Proben und beseitigt das Potenzial für menschliche Fehler bei der Eingabe in den Barcodes manuell. Es ist auch wichtig, dass die Etiketten bei extremen haften (zB Dampfphase von flüssigem Stickstoff -178 bis -150ºC) Temperaturen. Die Dokumentation kann zeitaufwendig sein und mit der Notwendigkeit, eine effiziente Verarbeitung der Lieferung haben wir festgestellt, dass mit mindestens zwei Technikern unterteilen die Prozesse erzeugt die größte Effizienz.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist die Nähe des Labors zu der Sammelstelle. Für PBMC Isolierung insbesondere müssen die Proben innerhalb von 2 Stunden der Sammlung verarbeitet zu einem signifikanten Anstieg der roten Blutkörperchen eine Kontamination zu vermeiden werden und nimmt in lebensfähigen mononuklearen Zellen. Als solches sollte das Labor nicht mehr als 30 Minuten aus einer Sammlung Ort sein, um für alle Verkehrsprobleme, die auftreten können, Rechnung zu tragen. Außerdem kann jedes Labor schlägt das Protokoll hier skizziert werden zwei Techniker zur Hand erforderlich, um eine optimale Probenverarbeitung gewährleisten zu verpflichten. Darüber hinaus muss jedes Labor Zugang zu den erforderlichen Geräten für jeden Schritt oben beschrieben. So Labore mit weniger Personal und / oder begrenzte Anlagen wOuld wahrscheinlich nicht in der Lage, dieses Protokoll zu unternehmen.
Ein Vorteil dieses Protokolls ist die Möglichkeit, Proben direkt in den Häusern der mündigen Individuen zu sammeln. Dies ermöglicht die Studie, um Menschen mit geistigen oder andere gesundheitliche Probleme, die in der Regel nicht versuchen würde, medizinische Hilfe, vielleicht wegen eines Mangels von Versicherungs- oder Verkehrsmitteln zu erreichen. Es ermöglicht auch den Vergleich der betroffenen und nicht betroffenen Individuen lebt innerhalb der gleichen Gemeinde, die ähnliche Auslöser erlebt haben, unterscheiden sich aber in Bezug auf ihre psychische Gesundheit Symptome. Erhalten von Proben auf diese Weise erfordert eine genaue Zeitsteuerung und Koordination phlebotomists im Feld. Wegen unserem Labor wurde innerhalb der Gemeinschaft, die wir studierten befindet, könnte ein phlebotomist in der Regel sammeln Proben 2-3 Häuser und liefern die Proben an das Labor innerhalb der 2 Stunden-Fenster der ersten Kollektion. Effizienz ist der Schlüssel zu unserem Probenverarbeitung, und als solche, wir hatten mehrere phlebotomists in derFeld, wodurch die Notwendigkeit für eine präzise Koordination. Das Labor erhielt mehrere Blutlieferungen mit bis zu acht Teilnehmern pro Lieferung Abstand voneinander 2 h. Die phlebotomists trafen an einem bestimmten Ort und in Verbindung ihre Sammlungen mit nur einem phlebotomist Abgabe der Proben an das Labor als eine einzige Partie. Die hier beschriebenen Verfahren können leicht angepaßt werden, um viele andere Phänotypen und die biologischen Proben gesammelt können in einer Vielzahl von Downstream-Assays verwendet werden zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25 G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5 ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5 M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1 mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1 ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15 ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2 ml and 5 ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8 ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6 ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5 ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
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