Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

Summary

El análisis in vitro de la recombinación de interruptores de clase en ratones es un desafío debido a las moléculas citofílicas de IgE unidas a los receptores Fc en la superficie de las células B. Describimos un método para la detección de IgE utilizando la escisión mediada por tripsina de IgE unida a la superficie antes de la fijación y permeabilización para la tinción con fluorescencia citoplasmática.

Abstract

B inmunoglobulina de linfocitos de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) es un proceso en el que expresa inicialmente IgM cambia a otros isotipos de IgH, tales como IgA, IgE e IgG. Medición de la IgH CSR in vitro es un método clave para el estudio de una serie de procesos biológicos que van desde la recombinación y reparación del ADN a los aspectos de la inmunología molecular y celular. Ensayo in vitro RSE implica la superficie de medición expresión Ig de citometría de flujo en células B activadas. Si bien la medición de IgA e IgG subclases es sencillo, la medición de IgE por este método es problemático debido a la IgE soluble unión a FcεRII / CD23 expresado en la superficie de las células B activadas. Aquí se describe un procedimiento único para la medición precisa de IgE productoras de células B de ratón que han sido objeto de la RSE en la cultura. El método se basa en la escisión de tripsina-mediada de complejos IgE-CD23 en la superficie celular, lo que permite la detección de células de linaje B productoras de IgE por CYtinción toplasmic. Este procedimiento ofrece una solución conveniente para el análisis de citometría de flujo de la RSE a la IgE.

Introduction

Durante inmunoglobulina de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) en ratones y seres humanos, la IgH μ exones de la región constante (Cμ) se eliminan y sustituyen por uno de varios conjuntos de los exones de la región constante aguas abajo (C _H s) (por ejemplo Cγ, Cε, y Cα), resultando en un cambio de la producción de IgM a la producción de otras clases de Ig (por ejemplo, IgG, IgE, o IgA). RSE se produce dentro de conmutación (S), que son regiones 1-10 kb secuencias localizadas 5 'a cada conjunto de C _H ¹ s. La activación inducida por citidina deaminasa (AID) enzima inicia la RSE a t....

Protocol

NOTA: Todos los experimentos descritos aquí estaban de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) directrices y aprobado por el Hospital de Niños de Investigación Animal (ARCH), Boston, Mass.

1. Preparación de los reactivos

1. 1,000x IL-4 Stock: Diluir IL-4 de citoquinas a 20 mg / ml en H ₂ O o 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA). Distribuir en 200 ml de alícuotas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C.
2. 1.000 x anti-CD40: Obtener del fabricante a 1,0 mg / ml, se almacena a 4 ° C.
3. B medios de estimulación de células: Para 425 ml de medio RPMI-1640, añadir 75 ml de suero d....

Results

Este procedimiento se ha aplicado con éxito para estudiar la RSE a la IgE en las células B de ratón. Para demostrar la eficacia en la medición de la RSE, estimulamos las células B esplénicas de ratón con anti-CD40 y IL-4 como se describió previamente ^11. Después de cinco días de estimulación, se recogieron las células y se procesaron usando el protocolo descrito anteriormente y se tiñeron con B220 (CD45R) anticuerpos IgM marcado con fluorescencia, IgG1, IgE, y. Cerrado en los linfocitos de voladura (F.......

Discussion

La estimulación de células B de ratón esplénica en cultivo con anti-CD40 y IL-4 simulará T helper de tipo 2 (T _H 2) las interacciones, el cambio de clase alentador IgG1 e IgE ^5. Las células B pueden ser activados para la RSE en el contexto de esplenocitos totales ¹² o células B esplénicas purificadas ^11. Como se ha indicado en el protocolo (etapa 2.3), el enriquecimiento de células B es opcional, y es a discreción del experimentador para determinar si sería beneficioso. Separa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Ratón IgE FITC	BD Pharmingen		553415 clon R35-72
Rata Anti-Ratón IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	clon A85-1
Metanol	BDH	BDH1135-4LP	Mantener en -20 ° C
Colador de celdas Falcon 40 y micro; m Nylon	Corning	352340
Falcon Cell Strainer 70 µ m Nylon	Corning	352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	clon RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40	eBioscience	16-0402-85	clon HM40-3
RPMI Medio 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Solución salina tamponada con fosfato (10x)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) microperlas	Miltenyi Biotec	130-049-501
Columna de purificación MACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	Reconstituir en agua o 0,1% BSA
Solución de formalina, tamponado neutro, 10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Solución de tripsina-EDTA (10x)	Sigma Aldrich	T4174-100 ml	5,0 g de tripsina, 2,0 g de EDTA• 4 Na por litro de NaCl al 0,9%
Penicilina-Estreptomicina	Sigma Aldrich	P0781-100 ml	10.000 U Penicilina; 10 mg/ml Estreptomicina (100x)
L-Glutamina 200 mM	Sigma Aldrich	G7513
2-mercaptoetanol (99%)	Sigma Aldrich	M6250-100 ml
Tampón de lisis de glóbulos rojos	Sigma Aldrich	R7757
Rata Anti-Ratón IgM RPE/Cy7	SouthernBiotech	1140-17	clon 1B4B1
HyClone Suero de ternera fetal	Thermo	SH30910.03
Medios de estimulación de células B			de células B consisten en RPMI con suero de ternero fetal (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamina,   1x Penicilina-Estreptomicina (Penicilina: 100 U/ml, Estreptomicina: 100 y micro; g/ml), beta-mercaptoetanol (7 y micro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) y anti-CD40 (1 y micro; g/ml)