Summary

Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

Published: December 01, 2014
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Summary

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Abstract

B inmunoglobulina de linfocitos de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) es un proceso en el que expresa inicialmente IgM cambia a otros isotipos de IgH, tales como IgA, IgE e IgG. Medición de la IgH CSR in vitro es un método clave para el estudio de una serie de procesos biológicos que van desde la recombinación y reparación del ADN a los aspectos de la inmunología molecular y celular. Ensayo in vitro RSE implica la superficie de medición expresión Ig de citometría de flujo en células B activadas. Si bien la medición de IgA e IgG subclases es sencillo, la medición de IgE por este método es problemático debido a la IgE soluble unión a FcεRII / CD23 expresado en la superficie de las células B activadas. Aquí se describe un procedimiento único para la medición precisa de IgE productoras de células B de ratón que han sido objeto de la RSE en la cultura. El método se basa en la escisión de tripsina-mediada de complejos IgE-CD23 en la superficie celular, lo que permite la detección de células de linaje B productoras de IgE por CYtinción toplasmic. Este procedimiento ofrece una solución conveniente para el análisis de citometría de flujo de la RSE a la IgE.

Introduction

Durante inmunoglobulina de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) en ratones y seres humanos, la IgH μ exones de la región constante (Cμ) se eliminan y sustituyen por uno de varios conjuntos de los exones de la región constante aguas abajo (C H s) (por ejemplo Cγ, Cε, y Cα), resultando en un cambio de la producción de IgM a la producción de otras clases de Ig (por ejemplo, IgG, IgE, o IgA). RSE se produce dentro de conmutación (S), que son regiones 1-10 kb secuencias localizadas 5 'a cada conjunto de C H 1 s. La activación inducida por citidina deaminasa (AID) enzima inicia la RSE a través de la actividad de citidina deamination.

La IgE es un mediador clave de la enfermedad alérgica 2 y una mayor comprensión de cómo se produce y regulada puede abrir las puertas a nuevos enfoques terapéuticos para la enfermedad atópica IgE. En los ratones y los seres humanos, IgE es el isotipo Ig más estrechamente regulado. IgE normalmente se detecta en niveles miles de times menor que otro IgH isotipos 3, pero puede ser muy elevado en estados de enfermedad 4. Sin embargo, la RSE a la IgE no se conoce bien. In vitro la activación de células B usando IL-4 en combinación con anti-CD40 o LPS, induce CSR tanto a IgG1 e IgE 5. Las células B activadas expresan el receptor de baja afinidad IgE FcεRII / CD23 2,6, que se une la IgE soluble secretada en la cultura después de la RSE. Por lo tanto, al analizar con citometría de flujo, las células B con receptor de IgE unida mancha similar a las células B que expresan endógenamente IgE 7. Aunque se sabe que el ratón B células expresan el receptor de baja afinidad IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, en nuestra experiencia, no parece interferir con la medición del cambio de clase a IgG1. Sin embargo, en la medición de conmutación IgE después de la activación de las células B en la cultura, unida a la superficie específica IgE puede oscurecer el análisis. Con los métodos de tinción comunes, las células no expresan IgE tiñen positivamente para IgE.

Esbozado aquí es una estrategia que se ha utilizado para llevar a cabo ensayos de RSE y detectar verdaderas células IgE-B que expresan de ratones 9-11. El tratamiento de células B activadas con tripsina, un reactivo de laboratorio común para digerir las proteínas, elimina unido a la superficie tanto citofílicos y la membrana IgE. Permeabilización posterior y tinción citoplasmática de IgE por lo tanto revela las verdaderas células productoras de IgE.

Protocol

NOTA: Todos los experimentos descritos aquí estaban de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) directrices y aprobado por el Hospital de Niños de Investigación Animal (ARCH), Boston, Mass. 1. Preparación de los reactivos 1,000x IL-4 Stock: Diluir IL-4 de citoquinas a 20 mg / ml en H 2 O o 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA). Distribuir en 200 ml de alícuotas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C. 1.000 x anti-CD40: Ob…

Representative Results

Este procedimiento se ha aplicado con éxito para estudiar la RSE a la IgE en las células B de ratón. Para demostrar la eficacia en la medición de la RSE, estimulamos las células B esplénicas de ratón con anti-CD40 y IL-4 como se describió previamente 11. Después de cinco días de estimulación, se recogieron las células y se procesaron usando el protocolo descrito anteriormente y se tiñeron con B220 (CD45R) anticuerpos IgM marcado con fluorescencia, IgG1, IgE, y. Cerrado en los linfocitos de voladu…

Discussion

La estimulación de células B de ratón esplénica en cultivo con anti-CD40 y IL-4 simulará T helper de tipo 2 (T H 2) las interacciones, el cambio de clase alentador IgG1 e IgE 5. Las células B pueden ser activados para la RSE en el contexto de esplenocitos totales 12 o células B esplénicas purificadas 11. Como se ha indicado en el protocolo (etapa 2.3), el enriquecimiento de células B es opcional, y es a discreción del experimentador para determinar si sería benefici…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DRW es apoyado por subvenciones del NIH AI089972 y AI113217, y por el de la mucosa Estudios de Inmunología del equipo, y tiene una concesión de carrera para los científicos médicos del Fondo Burroughs Wellcome.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse IgE FITC BD Pharmingen 553415 clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PE BD Pharmingen 550083 clone A85-1
Methanol BDH BDH1135-4LP Keep at -20 °C
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon Corning 352340
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon Corning 352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-4052-82 clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40 eBioscience 16-0402-85 clone HM40-3
RPMI Medium 1640 Gibco 11875-093
HEPES (1M) Gibco 15630-080
MEM-NEAA (100X) Gibco 11140-050
Phosphate Buffered Saline (10X) Lifetechnologies (Corning) 46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbeads  Miltenyi Biotec 130-049-501
MACS purification column Miltenyi Biotec 130-042-401
IL-4 PeproTech 214-14 Reconstitute in water or 0.1% BSA
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128-4L
Trypsin-EDTA Solution (10X) Sigma Aldrich T4174-100mL 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P0781-100mL 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)
L-Glutamine 200mM Sigma Aldrich G7513
2-mercaptoethanol (99%) Sigma Aldrich M6250-100mL
Red cell lysis buffer Sigma Aldrich R7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 SouthernBiotech 1140-17 clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum Thermo SH30910.03
B cell Stimulation media B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,  1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL)

References

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Cite This Article
Gallagher, M. P., Shrestha, A., Magee, J. M., Wesemann, D. R. Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells. J. Vis. Exp. (94), e52264, doi:10.3791/52264 (2014).

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