Abstract
B inmunoglobulina de linfocitos de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) es un proceso en el que expresa inicialmente IgM cambia a otros isotipos de IgH, tales como IgA, IgE e IgG. Medición de la IgH CSR in vitro es un método clave para el estudio de una serie de procesos biológicos que van desde la recombinación y reparación del ADN a los aspectos de la inmunología molecular y celular. Ensayo in vitro RSE implica la superficie de medición expresión Ig de citometría de flujo en células B activadas. Si bien la medición de IgA e IgG subclases es sencillo, la medición de IgE por este método es problemático debido a la IgE soluble unión a FcεRII / CD23 expresado en la superficie de las células B activadas. Aquí se describe un procedimiento único para la medición precisa de IgE productoras de células B de ratón que han sido objeto de la RSE en la cultura. El método se basa en la escisión de tripsina-mediada de complejos IgE-CD23 en la superficie celular, lo que permite la detección de células de linaje B productoras de IgE por CYtinción toplasmic. Este procedimiento ofrece una solución conveniente para el análisis de citometría de flujo de la RSE a la IgE.
Introduction
Durante inmunoglobulina de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) en ratones y seres humanos, la IgH μ exones de la región constante (Cμ) se eliminan y sustituyen por uno de varios conjuntos de los exones de la región constante aguas abajo (C H s) (por ejemplo Cγ, Cε, y Cα), resultando en un cambio de la producción de IgM a la producción de otras clases de Ig (por ejemplo, IgG, IgE, o IgA). RSE se produce dentro de conmutación (S), que son regiones 1-10 kb secuencias localizadas 5 'a cada conjunto de C H 1 s. La activación inducida por citidina deaminasa (AID) enzima inicia la RSE a través de la actividad de citidina deamination.
La IgE es un mediador clave de la enfermedad alérgica 2 y una mayor comprensión de cómo se produce y regulada puede abrir las puertas a nuevos enfoques terapéuticos para la enfermedad atópica IgE. En los ratones y los seres humanos, IgE es el isotipo Ig más estrechamente regulado. IgE normalmente se detecta en niveles miles de times menor que otro IgH isotipos 3, pero puede ser muy elevado en estados de enfermedad 4. Sin embargo, la RSE a la IgE no se conoce bien. In vitro la activación de células B usando IL-4 en combinación con anti-CD40 o LPS, induce CSR tanto a IgG1 e IgE 5. Las células B activadas expresan el receptor de baja afinidad IgE FcεRII / CD23 2,6, que se une la IgE soluble secretada en la cultura después de la RSE. Por lo tanto, al analizar con citometría de flujo, las células B con receptor de IgE unida mancha similar a las células B que expresan endógenamente IgE 7. Aunque se sabe que el ratón B células expresan el receptor de baja afinidad IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, en nuestra experiencia, no parece interferir con la medición del cambio de clase a IgG1. Sin embargo, en la medición de conmutación IgE después de la activación de las células B en la cultura, unida a la superficie específica IgE puede oscurecer el análisis. Con los métodos de tinción comunes, las células no expresan IgE tiñen positivamente para IgE.
Esbozado aquí es una estrategia que se ha utilizado para llevar a cabo ensayos de RSE y detectar verdaderas células IgE-B que expresan de ratones 9-11. El tratamiento de células B activadas con tripsina, un reactivo de laboratorio común para digerir las proteínas, elimina unido a la superficie tanto citofílicos y la membrana IgE. Permeabilización posterior y tinción citoplasmática de IgE por lo tanto revela las verdaderas células productoras de IgE.
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Protocol
NOTA: Todos los experimentos descritos aquí estaban de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) directrices y aprobado por el Hospital de Niños de Investigación Animal (ARCH), Boston, Mass.
1. Preparación de los reactivos
- 1,000x IL-4 Stock: Diluir IL-4 de citoquinas a 20 mg / ml en H 2 O o 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA). Distribuir en 200 ml de alícuotas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C.
- 1.000 x anti-CD40: Obtener del fabricante a 1,0 mg / ml, se almacena a 4 ° C.
- B medios de estimulación de células: Para 425 ml de medio RPMI-1640, añadir 75 ml de suero de ternera fetal recién descongelado (FCS), 10 ml de 1,0 M de tampón HEPES, 5 ml de L-glutamina Stock, 5 ml de penicilina: Foto de estreptomicina, 5 ml Esenciales Medio no esenciales Aminoácidos l (MEM-NEAA), y 3,5 mínimas de 2-mercaptoetanol. Mantenga los medios a 4 ° C durante un máximo de una semana. Añadir IL-4 (20 ng / ml) y anti-CD40 (1.0 mg / ml) inmediatamente antes de su usosólo para el volumen de los medios necesarios.
- 2% FCS-FACS Buffer: Añadir 10 ml de FCS a 490 ml de PBS 1x. Mantenga a 4 ° C.
- 2x solución de tripsina-EDTA: Diluir 5 ml de 10x solución de tripsina-EDTA de stock (5,0 g de tripsina, EDTA 2,0 g por litro) en 20 ml de PBS 1x. Tienda tripsina-EDTA en 2x alícuotas de trabajo a 4 ° C. Se deja calentar hasta la temperatura ambiente antes de su uso.
- El suero fetal de ternero: Mantenga FCS descongelaron a 4 ° C durante un máximo de dos semanas. Colocar en hielo 15 min antes de que el procedimiento de tinción citoplásmica.
- -Neutral formalina tamponada: Preparar una solución de formalina al 10% (3,7% de paraformaldehído). La formalina es tóxico y, por tanto, manejar bajo una campana de extracción de laboratorio mientras usa el EPP apropiado. Formalina tienda a temperatura ambiente en un armario de almacenamiento de químicos.
- Metanol: tienda metanol absoluto (100%) a -20 ° C hasta que las células están listas para ser permeabilizadas. Tenga en cuenta que el metanol es inflamable y se debe almacenar en un congelador apropiado.
2.La purificación y activación de células B
- Desde un bazo de ratón recién cosechado-, preparar una suspensión de células individuales presionando suavemente el órgano a través de un filtro de células de 70 micras con el émbolo de una jeringa de 3 ml. En un tubo de centrífuga cónico de 15 ml, recoger las células en 10 ml de 1x PBS y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de glóbulos rojos tampón de lisis durante 5 min. Neutralizar con 13,5 ml de 1x PBS y centrifugar a 300 xg durante 5 min.
- (Opcional) separar magnéticamente las células B utilizando anti-CD45R (B220) marcado con perlas, siguiendo el protocolo de purificación MACS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Estimular las células B purificadas a 1,0 x 10 6 células / ml en medio de estimulación de células B calentado que contiene IL-4 (20 ng / ml) y anti-CD40 (1.0 g / ml) durante 5 días a 37 ° C. Empiece con 8 ml de cultivo divididos en 2 pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos (4 ml cada una).
- Compruebe culture diariamente para mantener a 1,0 x 10 6 células / ml. Ajustar la concentración dividiendo en otros pozos y diluyendo la cultura con los medios de comunicación la estimulación de células B que contiene IL-4 fresca y anti-CD40.
3. La tripsinización, Fijación y permeabilización
- La tripsinización
- Obtener hasta 1,0 x 10 7 de las células cultivadas en un tubo cónico de 15 ml, se centrifuga a 300 xg durante 5 min, y decantar el sobrenadante.
- Lavar con 10 ml de PBS para eliminar la proteína residual de los medios de recogida de células. Repita el paso de centrifugación y decantar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento celular en el volumen residual después de la decantación (aproximadamente 100 l).
- Añadir cuidadosamente 800 l de temperatura ambiente 0,1% (2x) tripsina-EDTA a las células. Dispensar lentamente en un ángulo de 45 ° hacia abajo el lado del tubo cónico.
- Cerrar el tubo y mezclar suavemente por la inclinación del tubo de manera que el líquido corre a lo largo de la longitud del tubo de tiempo de 5-6s. A, precipitado blanco fibroso puede formar en la solución. Limite el tiempo de tratamiento con tripsina a menos de un minuto.
- Interrumpir la reacción tripsinización con 1 ml de FCS fríos. Diluir el FCS inmediatamente por la adición de 10 ml de PBS frío.
- Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, a continuación, decantar el sobrenadante y volver los tubos en hielo.
- Fijación
- Resuspender las células en el volumen residual después de la decantación. Si es necesario, llevar el volumen hasta 100 l con PBS frío.
- En una campana de humos, añadir 800 l de solución de formalina tamponada neutra al 10% a las células y pipetear arriba y abajo. El tubo se calentará tras la adición de formalina. Incubar a 37 ° C durante 10 min.
- Permeabilización
- Configurar un vórtex de sobremesa a una velocidad de agitación suave.
- Dibuje 9 ml de frío (-20 ° C) de metanol en un 10 ml pipeta serológica.
- Sostenga el tubo que contiene las células sobre el mezclador de vórtice y empezar suavemente shaking las células.
- Añadir metanol frío para el tubo de manera que cae gota a gota sobre las células mientras que el tubo todavía está sacudiendo de modo que el metanol se mezcla continuamente. Después de los primeros 2 ml de metanol la velocidad de dispensación se puede aumentar a una corriente lenta.
- Deje que el tubo de sentarse en hielo durante 30 minutos para completar la permeabilización. Alternativamente, las células pueden almacenarse a -20 ° C hasta por un mes.
4. La fluorescencia de tinción para IgG1 e IgE Class Switching
- Muestra Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos y decantar la solución de metanol. Un precipitado blanco puede sedimentar con las células.
- Añadir 10 ml de la temperatura ambiente 1x PBS y centrifugar a 300 xg durante 5 min para lavar las células. Repetir una vez. Nota: Lavar el pellet con temperatura ambiente PBS disuelve precipitado adicional que puede formar después del paso 4.1.
- Realizar un lavado adicional con 10 ml de 2% de tampón FCS-FACS.
- Distribuir las muestras a un redondo de 96 pocillos placa inferiory centrifugar a 300 xg durante 5 min. Decantar el sobrenadante y poner la placa en el hielo.
- Las manchas en 60 l de 2% de tampón FCS-FACS por pocillo con las siguientes diluciones de anticuerpos: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Después de 5 min de la tinción, se lava la placa con 150 l de 2% de tampón FACS-FCS y se centrifuga durante 5 min a 300 x g.
- Resuspender en 400 l de 2% de tampón FACS-FCS y pipeta a través de un filtro de células de 40 m de nylon en un tubo de FACS 5 ml.
5. Utilice la estrategia de apertura de puerta a seguir:
- Aislar CD45R (B220) células positivas de la población de linfocitos voladura situado en la / parcela SSC FSC (Figura 1).
- De las células positivas B220, usar el diagrama de IgE y IgG1 para revelar las poblaciones correspondientes.
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Representative Results
Este procedimiento se ha aplicado con éxito para estudiar la RSE a la IgE en las células B de ratón. Para demostrar la eficacia en la medición de la RSE, estimulamos las células B esplénicas de ratón con anti-CD40 y IL-4 como se describió previamente 11. Después de cinco días de estimulación, se recogieron las células y se procesaron usando el protocolo descrito anteriormente y se tiñeron con B220 (CD45R) anticuerpos IgM marcado con fluorescencia, IgG1, IgE, y. Cerrado en los linfocitos de voladura (Figura 1), una población de células claras de IgE + no pueden ser discriminados limpiamente sin tratamiento con tripsina (Figura 2a). Sin embargo, la tripsinización de las células antes de la fijación y permeabilización permite la separación de las células productoras de IgE (Figura 2b) debido a la eliminación de la IgE unida a la superficie.
Figura 1: Adelanteard vs. dispersión lateral FACS parcela de células de bazo de ratón B después de 5 días de estimulación en cultivo con IL-4 y anti-CD40. Voladura linfocitos constituyen el 63% del total adquirido los acontecimientos.
Figura 2:. Efecto de la tripsina en la tinción citoplásmica de IgE e IgG1 en células B activadas (a, b) parcelas FACS (arriba) y los histogramas (a continuación) cerrada en chorro de células B esplénicas de 129 / B6 ratones fondo mixto después de la activación en la cultura durante 5 días con anti-CD40 y IL-4. La fijación y permeabilización de metanol solo (a) y con adición de tripsina (b) se muestran.
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Discussion
La estimulación de células B de ratón esplénica en cultivo con anti-CD40 y IL-4 simulará T helper de tipo 2 (T H 2) las interacciones, el cambio de clase alentador IgG1 e IgE 5. Las células B pueden ser activados para la RSE en el contexto de esplenocitos totales 12 o células B esplénicas purificadas 11. Como se ha indicado en el protocolo (etapa 2.3), el enriquecimiento de células B es opcional, y es a discreción del experimentador para determinar si sería beneficioso. Separación magnética positiva de las células B utilizando CD45R (B220) marcado con perlas se utilizan aquí. Después de la separación, se recomienda comprobar la pureza celular por FACS de manera que la concentración de células B se puede ajustar a 1,0 x 10 6 células / ml para la estimulación de citoquinas adecuada y anticuerpo. También cabe señalar que la IL-4 de proteína que ha sufrido ciclos de congelación y descongelación / podría haber disminuido la actividad.
La tripsinización de las células antes de la fijación y permeabilización permite la accurcomió medición de cambio de clase a través de citometría de flujo (Figura 2). Tripsinación adecuado de las células es vital para la aplicación con éxito de este procedimiento. Como FCS puede inhibir la tripsina, un lavado de PBS 1x se realiza antes de la etapa de tripsinización. Encontramos una incubación de 30 segundos a temperatura ambiente es suficiente para la digestión completa. Duraciones más largas pueden afectar notablemente la viabilidad celular.
Antes del análisis, es esencial para lavar las células varias veces con PBS para eliminar las trazas de metanol. Arrastre de metanol puede alterar la unión del anticuerpo 13 y puede precipitar proteínas a partir de FCS utiliza en el flujo aguas abajo análisis de citometría de 14. En este sentido, otros métodos de permeabilización (es decir, saponina) puede ser una alternativa al uso de metanol. El metanol es un disolvente orgánico que disuelve los lípidos de membrana, mientras que los detergentes alteran la integridad de membrana 15. Un beneficio para la permeabilización de metanol es la capacidad de almacenamiento prolongadode células fijadas a -20 ° C 14.
Existen algunas limitaciones a tener en cuenta a la hora de utilizar este procedimiento. Debido a la tripsina escinde residuos de proteínas, algunas manchas FACS pueden parecer diferentes después del tratamiento, o pueden perder la capacidad de unirse para atacar epítopos completo. Además, se puede producir una pérdida en el número de células después del tratamiento con tripsina. Sin embargo, esto no parece afectar a la precisión de las mediciones de IgE RSE ya que hemos encontrado que este método es claramente comparables con los datos de conmutación de clase recogidos de la medición de las secreciones de anticuerpos de clones de hibridoma individuales 11.
Otros métodos se han reportado para detectar IgE que producen células B de ratón. Un método utiliza un procedimiento de lavado ácido para eliminar la IgE unida al receptor antes de la tinción para IgE unida a la membrana en las células que expresan IgE 16-18. Otro método utiliza un anticuerpo anti-IgE monoclonal para bloquear toda la superficie antes de IgE permeabiliz celularación y tinción intracelular para IgE de las células que expresan IgE-19. Además, un estudio reciente perfila un panel de FACS de ocho colores para identificar las poblaciones de células B de conmutación de IgE en los seres humanos mediante la exclusión de IgM +, IgD +, IgG + y subconjuntos de células B IgA + 20. En comparación con estos otros métodos, el método aquí descrito evita el uso de desnaturalización lavados con ácido, y el exceso de anticuerpos no son necesarios.
Una ventaja de este procedimiento es que no prescribe anticuerpos monoclonales específicos para la medición de la RSE a la IgE. Anticuerpos monoclonales anti-IgE alternativas se han mostrado para detectar sólo las moléculas de IgE endógenos. El clon de hibridoma R1E4 produce un anticuerpo monoclonal IgE-ratón de rata anti específica sólo para moléculas de superficie endógenas, no cytophilic IgE unido a CD23 21,22, pero no está disponible comercialmente. El protocolo descrito anteriormente es conveniente y económico, ya que utiliza reage laboratorio comúnnts. El anticuerpo anti-IgE utilizado aquí probable que se une al receptor de IgE unida en un sitio sensible a la escisión mediada por la tripsina, debido a que la señal de IgE debido a cytophilic IgE se reduce después del tratamiento (Figura 2). Sin embargo los investigadores que ejecutan este protocolo tienen la libertad de elegir entre una gama de clones disponibles en el mercado para los experimentos. Además, el concepto de la utilización de tripsina para eliminar las proteínas de la superficie celular se puede extender a la detección de otros marcadores de células por análisis FACS.
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Acknowledgments
DRW es apoyado por subvenciones del NIH AI089972 y AI113217, y por el de la mucosa Estudios de Inmunología del equipo, y tiene una concesión de carrera para los científicos médicos del Fondo Burroughs Wellcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
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