Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma

Introduction

El glioblastoma multiforme (GBM) es el (60%) tumor cerebral primario más común en adultos, con una supervivencia media de 15-21 meses cuando fueron tratados con cirugía, radioterapia, y quimioterapia ^1. Terapias novedosas para GBM son imprescindibles. Las terapias experimentales requieren pruebas en modelos animales que reproducen adecuadamente las características más destacadas de la enfermedad humana. Estrategias para inducir GBM en roedores incluyen mutagénesis química con agentes alquilantes, línea germinal o alteraciones genéticas somáticas, o el trasplante usando líneas celulares de glioma ^2. Los modelos más utilizados emplean la implantación de líneas celulares de glioma, ya sea ortotópicamente, en el cerebro o por vía subcutánea utilizando células singénicas en animales con idéntico genotipo; o células xenogénicas, líneas más comúnmente humanos de células GBM, implantados en ratones inmunes comprometidos ^3. Los xenoinjertos ofrecen muchas ventajas para el estudio de tumores intracraneales: conveniencia de la reproducibilidad, standatasas de crecimiento rdized, momento de la muerte y el tumor de localización. Sin embargo, estos modelos tienen limitaciones debido al abordaje quirúrgico artificial, invasivo utilizado para implantaciones y capacidad limitada para reproducir con precisión histológica rasgos característicos de GBM humana (OMS grado IV): necrosis pseudo-pallisading, atipias nucleares, invasión difusa, la proliferación de micro-vascular y la formación de anomalías vascular glomeruloide ^4-7. La inducción de GBM por alterar el genoma de las células somáticas con ADN oncogénico, ya sea con vectores virales ^8-12, o con la integración mediada por transposón ^13, reproduce más estrechamente la etiología de la enfermedad humana y recapitula características histopatológicos de GBM humano.

Históricamente, los tumores del SNC han sido clasificados sobre la base de la célula de origen percibida, que se observó, sería un factor predictivo para la supervivencia ^14. GBMs se clasifican en primaria y secundaria. Emergentes tod pruebasay apunta a la naturaleza altamente heterogéneo de glioblastoma primaria ^15. GBM secundaria (15%), el resultado de la transformación maligna de los astrocitomas de grado bajo (OMS grado I) y astrocitomas anaplásicos (OMS grado II), están asociados con la aparición temprana de la enfermedad, mejor pronóstico y un patrón de "proneural" de la expresión génica , mientras que GBM primaria (85%) muestran una aparición tardía, mal pronóstico y glial (clásica), neural o patrones de expresión mesenquimales. Si estos patrones de expresión génica se correlacionan con la célula real de origen del tumor todavía se está investigando activamente. La acumulación de los datos muestra que la combinación de mutaciones genéticas asociadas con GBMs son predictivo para la supervivencia. Por ejemplo, la pérdida de heterocigosidad (LOH) de los cromosomas 1p / 19q, mutaciones IDH1, PDGFRa amplificaciones, están asociados con GBMs secundarias, patrón de expresión proneural y mejor pronóstico, mientras que la sobreexpresión de EGFR, Notch y activación de la vía hedgehog sonic, Nf1 y PTEN pérdida y las mutaciones de p53 se correlacionan con los nervios, clásica, o GBM primaria mesenquimales y peor pronóstico ^16,17. El advenimiento de los grandes proyectos de secuenciación de escala y la acumulación de numerosas muestras de pacientes disponibles para la prueba trae una gran cantidad de nueva información con respecto a las mutaciones genéticas y las vías implicadas en GBM patogenia y la progresión y la posibilidad de la medicina individualizada, donde las terapias pueden ser adaptados específicamente a las anomalías genéticas del paciente. En última instancia, para evaluar el valor predictivo de estas mutaciones y las vías de manera sistemática, y para probar posibles tratamientos en cada caso, requiere modelos animales de GBM con alteraciones genéticas predeterminados. Transposón de integración mediada de ADN genómico ofrece un enfoque viable.

El sistema transposón Bella Durmiente, miembro de la / clase mariner Tc1 de transposones, se "despierta" (construido) en un proce múltiples pasosss de mutagénesis específica de sitio de un gen de transposasa salmónidos, que se convirtió en estado latente hace más de 10 millones años ^18,19. En esencia, transposones de ADN flanqueados por secuencias específicas (repeticiones invertidas / repeticiones directas: IR / DR) se pueden integrar en el genoma de una manera de "cortar y pegar" por medio de la actividad de la transposasa Bella Durmiente. La transposasa reconoce los extremos de los sitios de IR, escinde el transposón y la integra aleatoriamente en otro sitio de ADN entre las bases T y A, bases que se duplican en cada extremo del transposón durante la transposición (Figura 1a). La transposasa Bella Durmiente se compone de tres dominios, un dominio de unión transposón, una secuencia de localización nuclear y un dominio catalítico. Se requieren cuatro moléculas de transposasa para llevar a los dos extremos del transposón juntos y permitir la transposición, sin embargo, si demasiadas moléculas de transposasa están presentes, pueden dimerizar y tetramerizarse para inhibirla reacción de transposición ^20. Una reacción de transposición eficiente requiere una relación óptima de transposasa de transposones. El ADN que codifica la transposasa puede ser entregado en el mismo plásmido con el transposón (en cis) o en un plásmido diferente (en trans). Para asegurar la relación óptima entre la transposasa y los transposones, un promotor con una actividad adecuada puede ser elegido para la expresión de la transposasa (para el modelo "cis") o la proporción de los plásmidos en la solución de inyección pueden ser optimizados (para el modelo "trans"). El sistema transposón Bella Durmiente puede ser utilizado con éxito para la genómica funcional, mutagénesis de inserción, la transgénesis y la terapia génica somática ^21. Al ser una construcción sintética re-ingeniería a una molécula funcional de una variante salmonoides latente, la transposasa Bella Durmiente no se une a otros transposones en seres humanos u otros mamíferos ^20. Desde su descubrimiento, la ingeniería molecular tiene enhanced la eficacia transposición del sistema de transposón SB a través de cambios en las secuencias de IR y adición de dinucleótidos TATA que flanquea el transposón, resultando en los transposones pT2. Estos transposones han optimizado la unión de la SB para el sitio de infrarrojos y una mayor eficacia de la escisión. La transposasa SB también se sometió a una mejora significativa; la transposasa utilizado en los experimentos presentados en el presente documento es el SB100X, una transposasa hiperactiva generado por una estrategia de barajado de ADN seguido por una pantalla genética a gran escala en células de mamíferos ^22.

En este informe se presenta un método rápido, versátil y reproducible para inducir GBM intrínseca en ratones con la integración no viral, transposón mediada de ADN plásmido en células de la zona sub-ventricular de ratones recién nacidos ^23. Presentamos una manera simple de crear transposones con nuevos genes susceptibles para la integración genómico utilizando la transposasa Bella Durmiente y demostrar cómo supervisar plásmido captación yprogresión de la enfermedad utilizando bioluminiscencia. También nos caracterizamos características histológicas e inmunohistoquímicos de la MBG reproducido con este modelo. Además, se presenta un método rápido para generar líneas de células primarias de GBM de estos tumores. El modelo de la Bella Durmiente, en el que los tumores son inducidas a partir de células originales al animal, permite la evaluación funcional de la función de los genes candidatos GBM en la inducción y progresión de los tumores. Este sistema también es muy adecuado para el ensayo de nuevos tratamientos GBM, incluyendo terapias inmunes en ratones inmunocompetentes, sin la necesidad de procedimientos quirúrgicos invasivos inflamatorias, que pueden alterar el microambiente local.

Protocol

NOTA: Todos los animales protocolos fueron aprobados por la Universidad de Michigan Comité para el Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA).

1. Clonación de la secuencia de interés en New dormir transposones Belleza

NOTA: Para insertar genes o elementos inhibitorios (como shRNA) utilizando el sistema de dormir transposasa Belleza, clonar la secuencia de interés en la columna vertebral de un pKT o plásmido pT2. Dirigir la clonación de tal manera que los elementos reguladores, genes de interés y marcadores permanecen flanqueadas por las repeticiones invertidas (IR / DR). Un ejemplo de clonación PDGFβ en una columna vertebral pKT se detalla a continuación (véase también la Figura 1b).

1. Digest 5 g de plásmido vector PKT-IRES-Katushka durante 4 horas a 37 ° C con 5-10 unidades de enzimas de restricción XbaI / XhoI en 50 l de volumen de reacción.
2. Digerir el ADNc mPDGFβ de 5 ug del plásmido pGEM-T mPDGFβ durante 4 horas a 37 ° C con 5-10 unidads de las enzimas de restricción NcoI / SacI.
3. Precipitar el ADN total mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol 100%, y 1/10 de volumen de 3 M de acetato sódico, pH 5,8 y se incuba durante la noche a -20 ° C.
4. Centrifugar las muestras a 13.800 xg durante 15 min.
5. Lavar el sedimento de ADN con 500 l de etanol al 70%, se centrifuga a 13.800 xg durante 1 minuto, repetir una vez y volver a suspender en 19 l de DNasa estériles agua libre.
6. Siga las instrucciones del fabricante en el Blunting Kit rápido a despuntar los extremos de ambos vectores (PKT-IRES-Katushka) e insertar (mPDGFβ).
7. Cargue el vector embotado e insertar en un bromuro de etidio manchadas gel de agarosa al 1,2% y correr a 80 V durante 40 minutos. Visualizar las bandas, escindir con una hoja de afeitar y gel limpia purificar el ADN usando un kit de purificación de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante.
8. Se liga el ADN inserto y el vector purificado en el paso 1.7 mediante la adición de ellas en un tubo a una relación molar 4: 1 (inserto: vector). En este tubo, pipette 1 l de T4 ligasa y 2 l de tampón ligasa T4 (que contiene ATP), y ajustar el volumen a 20 l con agua estéril. Incubar la reacción de ligación durante 18 horas a 16 ° C.
9. Transformar células bacterianas competentes DH5a químicamente con los productos ligados.
   1. Descongelar las células competentes en hielo.
   2. Añadir todo el volumen de la reacción de ligación a 50 l de células competentes, agitar suavemente el tubo e incubar la mezcla en hielo durante 30 min. Heat-Shock las bacterias durante 45 segundos a 42 ° C y respondió de inmediato en hielo; incubar en hielo durante otros 2 min.
   3. Añadir 950 l de caldo Luria a la cultura e incubar con agitación a 37 ° C durante 1 hora. Bacterias centrifugar a 2400 xg durante 3 min y volver a suspender el sedimento en 200 l de LB.
   4. Extender las bacterias transformadas en una placa de Petri recubierta con LB-agarosa y el antibiótico correspondiente. Incubar la placa durante la noche a 37 ° C.
   5. Por último, recoger 5-10 Bactecolonias rial y la cultura durante la noche a 37 ° C en 5 ml de medio LB con antibiótico.
   6. Se purifica ADN de plásmido usando un kit Mini ADN plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realice una restricción de diagnóstico de digerir para verificar la incorporación correcta del inserto en el vector y presentar clones positivos para la secuenciación de ADN para asegurar la orientación correcta del inserto.
10. Seleccione las colonias correctas y ampliar la producción de ADN utilizando una alta calidad, endotoxina kit gratuito de preparación de plásmidos.
11. Eluir el ADN en agua estéril o mM Tris-HCl 1. ADN Almacenar a -20 ° C hasta el momento de inyectar en los recién nacidos.

2. Intra-ventriculares Neonatales Inyecciones

1. De tres a cuatro semanas antes de experimentar, crear una cría de ratón jaula con un macho y una hembra de ratón, y un iglú de plástico de colores. Esto proporciona un ambiente enriquecido y ayuda al proceso de apareamiento.
2. Cuando se confirma el embarazo, retire el male a una nueva jaula. Dieciocho días después del apareamiento, monitorear jaula todos los días para la entrega. Realizar inyecciones intraventriculares en el día postnatal 1 (P1).
3. Preparación de la solución de inyección
   NOTA: La solución de inyección se hace mezclando el ADN plasmídico con el reactivo de transfección para crear las partículas para la transfección. A continuación se muestra un ejemplo en la preparación de una solución para inyección utilizando un plásmido que codifica la transposasa Durmiente La Bella y la luciferasa: pT2 / SB100x-Luc y dos plásmidos transposón: PT / CAGGS-NRASV12 y pT / CMV-SV40-LgE, en una proporción de 1: 2: 2. Todos los plásmidos tienen una concentración de 2 g / l. Detalles importantes sobre la preparación de la solución inyectable se presentan en la Discusión.
   1. Preparar la solución de ADN mediante la adición: 4 mg (2 l) de pT2 / SB100x-Luc, 8 mg (4 mu l) de PT / CAGGS-NRASV12 y 8 mg (4 l) de PT / CMV-SV40-LgE y 10 l de 10% de glucosa a un volumen final de 20 l a una concentración de 1 mg / mlADN y 5% de glucosa.
   2. Preparar la solución de PEI mediante la adición de 2,8 l de in vivo chorro de PEI, 7,2 l de agua estéril, y 10 l de 10% de glucosa a una concentración final de 5% de glucosa.
   3. Añadir la solución de PEI a la solución de ADN, mezclar y agitar y dejar reposar a temperatura ambiente (RT) durante 20 min. La solución está ahora lista para la inyección. Después de una hora a temperatura ambiente, mantener la solución en hielo.
   4. Montar un 10 l jeringa limpia equipada con una aguja hipodérmica de calibre 30 con 12,5 ° de bisel en la microbomba (Figura 2 # 1).
4. Para verificar el correcto funcionamiento del sistema de inyección, utilice el inyector automático (Figura 2 # 1) para retirar 10 l de agua en la jeringa y luego vaciar la jeringa completamente
5. Se enfría la fase estereotáxica neonatal (Figura 2 # 3) con una suspensión de hielo seco y alcohol a una temperatura de 2-8 ° C.
6. Inducir la anestesia mediante la colocación de los cachorros en hielodurante 2 min. Anestesia continuará en el marco estereotáxico refrigerada para el resto del procedimiento. El mantenimiento de la temperatura del bastidor encima de la congelación, entre 2-8 ° C evitará lesiones por quemaduras térmicas. Como cachorros precaución especial se pueden envolver en una gasa antes de colocar en hielo.
7. Llene la jeringa con la solución de ADN / PEI.
8. Inmovilizar el cachorro en el marco estereotáxico colocando su cabeza entre los barrotes del oído de gasa cubierta (Figura 2b). Asegúrese de que el lado dorsal del cráneo es horizontal, paralela a la superficie del marco y que las suturas craneales son claramente visibles. Limpiar la cabeza con etanol al 70%.
9. Bajar la aguja de la jeringa y ajustar las coordenadas estereotáxicas utilizando diales del marco estereotáxico hasta que la aguja toque el lambda (la intersección de la línea media de los huesos parietal y occipital) (Figura 2b).
10. Levante la aguja y ajustar las coordenadas estereotáxicas a 0,8 mm lateral y 1,5 mm rostral a la lambda (Figura 2b).
11. Baje la aguja hasta que llegue y hoyuelos ligeramente la piel. Mida las coordenadas. Baje la aguja otros 1,5 mm. La aguja perforar la piel y el cráneo, y pasar a través de la corteza para entrar en el ventrículo lateral (Figura 2c).
12. Utilizando el inyector automático, inyectar 0,75 l de la solución de ADN / PEI a una velocidad de 0,5 l / min
13. Mantenga el cachorro en el bastidor para otro minuto para permitir la solución para dispersar hacia los ventrículos. Mientras tanto, anestesiar otra pup, en hielo durante 2 min en preparación para la siguiente inyección.
14. Levante con cuidado y lentamente la aguja y coloque el cachorro bajo una lámpara de calor. Controlar la respiración y la actividad. Si es necesario, proporcionar una estimulación suave de las extremidades hasta la primera respiración sobreviene.
15. Devuelva el cachorro a su madre después de que se haya calentado, ha llegado a un color rosado, respira regularmente y está activo, normalmente 5-7 min. Si more de un cachorro se inyecta a la vez, mantenga todos los cachorros juntos hasta que se realicen todas las inyecciones. Si las inyecciones tardan más de 30 min, devuelva la mitad de las crías después de la primera 30 min y el resto al final del procedimiento.
16. Supervisar que la presa es sensible y alimentar a sus crías. Si es necesario, agregue una madre sustituta a la jaula.
17. Asegúrese de que el intervalo entre la colocación de la cría en hielo y colocarlo bajo la lámpara de calentamiento es inferior a 10 min. Cuanto más rápido el procedimiento mejor es la supervivencia. Por lo general, el tiempo que toma para anestesiar e inyectar un cachorro es 4 min.

3. La bioluminiscencia Seguimiento de Formación y progresión tumoral

3.1) Monitoreo plásmido Absorción después de la inyección

1. 24-72 horas después de la inyección, retire todos los cachorros de la jaula de la madre y el lugar en un 6 bien limpia placa de cultivo de tejidos, una cría por pocillo.
2. Preparar una solución de 30 mg / ml de luciferina disuelto en solución salina normal o Phosphattampón e. Preparar esta solución por adelantado y mantener en pequeñas alícuotas a -20 ° C.
3. Con una jeringa de 1 ml equipada con una aguja hipodérmica de calibre 30 se inyectan 30 l de luciferina subcutánea entre los omoplatos del cachorro. Asegúrese de que la aguja no perforar cualquier órgano, pellizcando la piel y levantar ligeramente antes de insertar la aguja.
4. Imagen de inmediato, utilizando un sistema vivo imágenes de bioluminiscencia en. Para el espectro IVIS, utilice los siguientes ajustes para adquisiciones: exposición automática, gran hurgar en la basura, y el diafragma f = 1.

3.2) La formación de Monitoreo y progresión tumoral

NOTA: Animales empezará la formación de tumores macroscópicos detectables mediante bioluminiscencia y la histología dentro de 2½-6 semanas, en función de los plásmidos inyectados oncogénicos.

1. Usando una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 26 se inyectan 100 l de una solución de luciferina 30 mg / ml por vía intraperitoneal.
2. Colocar el animal en la cámara de anestesia. Inyectar hasta cinco animales al mismo tiempo.
3. Espere 5 min a continuación, iniciar el flujo de oxígeno / isoflurano (1.5 a 2.5% de isoflurano) para anestesiar a los animales. Después de 3-4 minutos, retirar los animales de la cámara de anestesia, inicie el flujo de oxígeno / isoflurano en la cámara de bioluminiscencia. Colocar los animales en las respectivas ranuras equipadas con conos de ojiva de vidrio para permitir la anestesia y el paso sin obstrucciones de la luz.
4. Típicamente, adquirir una serie de imágenes 6, a intervalos de 2 min con un tiempo de exposición automático, binning mediana y una abertura abierta de f = 1.
5. Establecer la región de interés para todos los animales fotografiados, típicamente un óvalo sobre la región de la cabeza, y medir la intensidad de la luminiscencia usando las unidades de fotones calibrados / s / ^cm2 / sr.
6. Registre el valor máximo para cada animal. Posteriormente, las grabaciones pueden ser comparados durante la progresión del tumor para cada animal y / o entre los animales, por ejemplo when se emplean diferentes tratamientos.

4. histológico e inmunohistoquímico Análisis de Nueva GBMs

NOTA: Cuando los tumores han alcanzado el punto de tiempo deseado experimental, los animales pueden ser sacrificados, los cerebros perfundidos, fijos y analizados. Para la supervivencia se analiza la fase moribunda representa el punto final del experimento, cuando los animales son sacrificados humanitariamente a los primeros signos de la carga tumoral, según la definición de la etapa clínica cuando el animal se convierte en problemas de movilidad que muestra sintomática, postura encorvada y pelaje desaliñado. Una breve descripción de los métodos histológicos y inmuno-histoquímica estándar utilizados se presenta a continuación.

4.1) Perfusión y Fijación

1. Anestesiar al ratón con una inyección intra-peritoneal de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina.
2. Compruebe el reflejo pedal pellizcando los pies del ratón. Cuando se abolió este reflejo, lo que indica una anestesia profunda, immobilize el ratón sobre una tabla de disección con alfileres, abrir la cavidad abdominal, diseccionar el diafragma y abrir la cavidad torácica para visualizar el corazón.
3. Inserte una cánula roma de calibre 20 en el ventrículo izquierdo del corazón. Conectar la cánula con un tubo de plástico que pasa a través de una bomba peristáltica a un recipiente con solución oxigenada y heparinizada de Tyrode (NaCl al 0,8%, 0,0264% CaCl ₂ 2H ₂ O, 0,005% de NaH ₂ PO _4, 0,1% de glucosa, 0,1% de _NaHCO3, 0,02 % KCl). Iniciar el flujo de la solución de Tyrode mediante el ajuste de la velocidad de la bomba peristáltica para asegurar un flujo lento y constante, aproximadamente una gota por segundo o menos si los animales son más pequeños.
4. Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón para permitir el drenaje de la sangre y de Tyrode.
5. Controlar la eficiencia de perfusión mediante la observación de escaldado de los órganos internos (más evidentes en el hígado y el riñón) a medida que estén desprovistos de sangre.
6. Cuando elsolución de drenaje desde el corazón es evidente (3-5 min), cambiar las soluciones de Tyrode de al 4% de paraformaldehído para la fijación (4% PFA, pH 7,34 en tampón fosfato salino).
7. Monitorear buena fijación de los tejidos por el aumento de la rigidez del cuello y la cola.
8. Decapitar al ratón y diseccionar cuidadosamente el cerebro del cráneo.
   1. Tire de la piel que cubre el cráneo rostral, hacia la nariz, y agarrarlo firmemente para estabilizar la cabeza, dorsal hacia arriba.
   2. Con un bisturí afilado, corte hacia abajo a lo largo del borde de la órbita, a seccionar los músculos orbitales y los arcos cigomáticos subyacentes.
   3. Gire la cabeza cara ventral hacia arriba y retire los músculos del cuello conectados usando una gubia. Aplastar la primera vértebra y retírela del tronco cerebral.
   4. Visualice la cóclea, agarrar el hueso temporal suprayacente con la gubia y crear una abertura entre el hueso temporal y occipital. Despegar el hueso occipital de la superficie del cerebelo.
   5. Gire la cabeza ventral hacia arriba. El cerebro se deslizará hacia abajo desde el resto del cráneo, conectado ahora únicamente a través de los nervios craneales. Usando pequeñas tijeras cortan el olfativo, óptico y los nervios trigémino. Esto liberará el cerebro.
9. Coloque cerebro en el 4% PFA durante la noche a 4 ° C para la post-fijación.
10. Para el análisis histológico y la tinción de hematoxilina-eosina, transferir los cerebros de tampón fosfato durante 24 horas y luego proceder a la incrustación de parafina.
11. Para el análisis de inmuno-histológico, transferir cerebros en una solución de sacarosa al 30% en solución salina tamponada con fosfato durante 24-48 h (hasta que los cerebros se hunden hasta el fondo del tubo)
12. Sección cerebros en un medio a través del centro de la región del tumor, coloque el cortedesventaja en un molde de congelación, incrustar en medios crio-incrustación (OCT compuesto), y el flash-congelación en una suspensión de etanol en hielo seco, isopentano hielo seco o en nitrógeno líquido. Mantenga bloques congelados a -80 ° C hasta el corte y tinción.

4.2) Los cerebros para el análisis histopatológico de la intrínseca GBMs hematoxilina-eosina tinción de parafina Embedded

1. Sección parafina embebido cerebros a las 4 micras de espesor, deje caer en un baño de agua de 42 ° C y montar en portaobjetos de vidrio.
2. Diapositivas De-paraffinize colocándolos durante 10 min en un horno de 60 ° C y luego transferirlos a intervalos de 5 min a través de una serie de tres recipientes de diapositivas llenas de xileno.
3. Hidratar los portaobjetos a través de una serie de baños de etanol: etanol al 100% durante 2 min, repetir una vez, etanol al 95% durante 2 min, repetir una vez, etanol al 70% durante 2 min y luego transferir diapositivas al agua.
4. Manchar los portaobjetos sumergiéndolos en un recipiente lleno de diapositiva Harris hematoxilina durante 2 min.
5. Enjuague con agua del grifo hasta que el agua salga limpia.
6. Dip desliza dos veces en la solución de azulado (0,1% Bicarbonato de Sodio).
7. Deje diapositivas están en agua del grifo durante 2 min, luego transferir a etanol al 80% durante 2 min.
8. Manchar los portaobjetos sumergiéndolos en un recipiente lleno con eosina para 5 min.
9. Deshidratar diapositivas en una serie de baños de etanol (80% de etanol 3-4 salsas, 95% de etanol 2 min, repetir una vez, 100% de etanol 2 min, repita una vez).
10. Claro con 3 baños consecutivos de xileno, 3 minutos cada uno.
11. Cubreobjetos con un medio de montaje a base de xileno y dejar secar en una superficie plana a temperatura ambiente hasta que esté listo para la imagen. Guarde a temperatura ambiente.

4.3) inmunohistoquímica de cerebros Embedded conservados Cryo para Molecular y Celular Caracterización de de novo inducida GBMs

1. Recuperar bloques congelados de la C de almacenamiento -80 °, coloque en criostato y permiten temperaturas equilibrar durante 30 min.
2. Sección 12-14 Micras de espesor secciones y montaje 2-3 secciones en portaobjetos de vidrio con carga positiva. Los cortes de secciones en serie, mediante la recopilación de las secciones adyacentes en diferentes diapositivas. Esto permite que la tinción con anticuerpos diferentes sobre secciones de tejido adyacentes dentro del tumor.
3. Diapositivas seca en un desecador durante al menos 1 hr después de la sección para permitir una buena adherencia del tejido.
4. Crea una barrera hidrófoba (con un marcador hidrófobo) en cada extremo de la corredera para permitir líquido para cubrir las secciones y para permanecer en la diapositiva durante los lavados. Cubrir las secciones con una solución de PBS con 0,1% Triton-X (PBS 0,1% Tx) y agitar suavemente durante 5 min en un agitador horizontal para permeabilizar el tejido. Repetir dos veces.
5. Bloquear la unión no específica con una solución de 10% de suero de cabra normal (o suero de animal en el que se elevó el anticuerpo secundario) durante 30 min con agitación suave
6. Preparar la solución de anticuerpo primario en 2% de suero normal de cabra en PBS 0,1%Tx y pipeta de la solución sobre las secciones. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda cubierta en la oscuridad y mantener a temperatura ambiente durante la noche.
7. El día siguiente, lavar secciones tres veces durante 5 minutos con PBS 0,1% Tx y se incuban en anticuerpo secundario fluorescente diluido en 2% de suero normal de cabra PBS 0,1% Tx durante una hora.
8. Lavar las secciones tres veces durante 5 minutos con PBS 0,1% Tx, contrateñir con una tinción nuclear (por ejemplo, DAPI) durante 2 min, se lava una vez más, claro en agua y cubreobjetos con un medio de montaje de agua que preserve la fluorescencia basada. Coloque las diapositivas en una superficie plana y dejar que ellos curan durante al menos 24 horas, en la oscuridad, hasta que esté listo para la imagen. Mantenga a 4 ° C a partir de entonces.

5. Generación de tumor primario líneas celulares con alteraciones genéticas específicas.

1. Para generar líneas celulares de dormir ratones portadores de tumores de belleza seleccionar un ratón con tumor grande confirmado (bioluminiscencia 10 ⁷ -10 ⁸ fotones / s / cm2 / sr).
2. La eutanasia del ratón con una sobredosis de anestésico isoflurano, decapitar al animal y cuidadosamente diseccionar el cerebro del cráneo (como se describe en la sección 4). Coloque el cerebro en una placa de Petri limpia.
3. Utilizando una hoja de afeitar, hacer cortes coronales anterior y posterior al tumor. La ubicación del tumor es generalmente reconocible debido a la transparencia del cerebro.
4. Disecar el tumor, por lo general 5-7 mm de diámetro con pinzas finas y colocar en un tubo de 1,5 ml lleno con 300 l Neural Stem Cell Media (NSC medios: DMEM / F12 con B-27 suplemento, N2, y Normocin, complementado con EGF humano recombinante y bFGF a una concentración de 20 ng / ml cada uno).
5. Homogeneizar suavemente tumor con una mano de mortero de plástico, que se ajusta a las paredes del tubo.
6. Añadir 1 ml de solución de disociación de tejido libre de enzimas y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
7. Pase suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micras, lavar el filtro con 10 ml deMedios NSC, centrifugar a 300 g durante 4 min, el sobrenadante decante y volver a suspender pellet en 7 ml de medio NSC.
8. Placa en un matraz de cultivo T25 y de cultivo a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos con y la atmósfera de 95% de aire y 5% de CO _2. Después de 3 días, algunas células han muerto, algunos adherido a la parte inferior de la placa de cultivo, y algunos están formando neuroesferas, flotando libremente en los medios de comunicación.
9. Retire estas células en suspensión y re-placa en un frasco de cultivo de tejido T75.
10. Después de otros tres días de cultivo, recoger neuroesferas, disociar como se describe en el paso 5.6, la tensión a través de filtro de células y contar las células. Congelar alícuotas de células en suero bovino fetal 10% de DMSO y células de paso a una densidad de un millón de células en 14 ml de NSC suplementado con EGF y FGF para un matraz T75. La tasa de crecimiento dependerá de los oncogenes utilizados para generar tumores. Adaptar las condiciones de cultivo celular para prevenir el crecimiento excesivo y mantener las células en una densidad relativamente alta.

Representative Results

Para caracterizar rasgos histopatológicos de glioblastomas inducidos-SB, los ratones neonatales C57 / BL6 fueron inyectados en P1 con un plásmido que codifica la luciferasa (pT2 / SB100x-Luc) en combinación con plásmidos que codifican transposones con ADN oncogénico, es decir, las ANR (pT / CAGGS -NRASV12) y SV40 LgE (pT / CMVSV40-LgE) (Figura 3c) o un plásmido que codifica un p53 de horquilla corta con PDGFβ y un reportero GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) en combinación con las ANR (Figura 3d). Los animales fueron controlados por bioluminiscencia el día después de la inyección (Figura 2a) y periódicamente hasta llegar a la fase moribunda cuando fueron sacrificados. Fase moribunda se define como el estadio clínico cuando el animal se convierte en la movilidad que muestra sintomática deteriorado, postura encorvada, piel sucia y pérdida de peso. A veces, los animales desarrollan convulsiones o patrones anormales de movimiento, como caminar en círculos y salto repentino. Al final del experimento el animals fueron anestesiados. Los cerebros fueron perfundidos, embebidos en parafina, y se procesaron para tinción con hematoxilina y eosina. Los datos muestran tumores que muestran las características distintivas del GBM humana (OMS grado IV) con hemorragias (Figura 3c), necrosis pseudo-pallisading (Figura 3e) y la invasión perivascular y difusa en el parénquima cerebral (Figura 3g, f). La formación de pseudopallisades está precedida por la ruptura de los grandes vasos glomeruloides con endotelios con fugas (Figura 3i) que dan lugar a regiones de hemorragia con infiltración masiva de células mononucleares (Figura 3h). Mitosis atípicas (Figura 3J) y gigantescas células tumorales multinucleadas (figura 3k) también son patognomónicos de GBM humano.

Los glioblastomas genera utilizando el sistema Dormir transposasa de belleza pueden ser monitoreados a lo largo de la progresión del crecimiento tumoral con bioluminiscencia, si los plásmidos inyectadosluciferasa codificar. Un ejemplo experimento se muestra en la Figura 4a. Animales normalmente sucumben de la carga tumoral cuando se alcanza una intensidad de luminiscencia de 10 ⁷ -10 ⁹ fotones / s / cm ² / sr. La mediana de supervivencia de los animales es dependiente de esperar en las combinaciones de transposones oncogénicos inyectados en el cerebro neonatal, como se ilustra en las curvas de supervivencia se presentan en la Figura 4b. Tenga en cuenta que los tumores más agresivos se inducen con ANR y SV40 LgE antígeno (mediana de supervivencia de 30 días), mientras que la mediana de supervivencia de los animales con GBM inducidas con NRAS shp53 y PDGF es 62,5 días y de los animales inyectados con shp53 y las ANR 83 días.

De novo tumores formados pueden caracterizarse inmuno-histoquímica por su expresión de moléculas características de los tumores gliales. Figura 5 muestra un tumor incipiente (22 dpi, bioluminiscencia 2x10 ⁵ fotones / s / cm ² / sr), inducida con shp53y las ANR. El plásmido shp53 inyectado codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) para permitir la identificación de células transfectadas y su progenie (pT2 / shp53 / GFP). Células GFP + tumorales expresan la nestina marcador de células madre neurales y algunos GFP + células también expresar la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). La Figura 6 ilustra un tumor de un animal moribundo a 56 dpi, tumor que también fue inducida con shp53 / GFP y las ANR. Numerosos GFAP + astrocitos están rodeando el tumor. Células GFP + tumorales expresan nestina, pero no GFAP.

Una gran ventaja al usar esta técnica para inducir GBMs es la capacidad de generar nuevas líneas de células GBM con alteraciones genéticas únicas por medio de los transposones inyectados. Además, las líneas celulares personalizados se pueden generar utilizando animales transgénicos con maquillaje genético específico. Estas líneas celulares son fundamentales para hacer muchas preguntas mecanicista utilizando ensayos bioquímicos. Son ideales para los estudios de citotoxicidad con novela chemotherapeutic agentes. La Figura 7 ilustra una neurosphere de un tumor bella durmiente inducido con shp53, PDGF y las ANR, que muestra la expresión de GFP, que está codificada en uno de los plásmidos inyectados. Tenga en cuenta que la expresión no es igualmente intensa en todas las células, lo que indica la naturaleza heterogénea de estas células primarias de GBM.

Figura 1: (a) Representación esquemática que ilustra el mecanismo de "cortar y pegar" utilizado por la transposasa Bella Durmiente para integrar transposones en el ADN cromosómico del huésped un plásmido transposón donante se representa con el gen de interés flanqueado por las repeticiones invertidas / repeticiones directas. (IR / DR; cajas de flechas rojas) secuencias. La transposasa SB (verde) se une al IR / DR, impuestos especiales el transposón y reintegra en entre pares aleatorios de base dinucleótido TA en el ADN cromosómico del huésped. (B) Ejemplo de clonaciónun gen de interés (mPDGFβ) en la columna vertebral de un vector SB (PKT-IRES-Katushka). El vector SB contiene dos secuencias IR / DR de repetición (rojo) y un casete de expresión génica que incluye secuencias promotoras y potenciadoras, un sitio de clonación múltiple (MCS; azul), sitios de entrada ribosomales internos (IRES), un marcador fluorescente reportero (Katushka: amarillo), y un sitio de poliadenilación (poliA). El oncogén de interés (mPDGFβ; naranja) está contenida en un pGEMT vector de clonación. El oncogén, flanqueado por sitios específicos de restricción (NcoI / SacI) se libera por digestión enzimática, y mitigado por la enzima embotamiento. El vector se linealiza y embota también. Por último, el oncogén mPDGFβ se inserta en el vector de donantes por medio de una reacción de ligación de extremo romo para generar el nuevo vector plásmido transposón:. PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande of esta cifra.

Figura 2: Configuración Experimental y guías para las inyecciones intra ventricular en ratones neonatales (a) Un marco estereotáxico (2) con los diales micrométricos está equipado con un inyector automático celebración de una jeringa de 10 l (4). Dentro del marco de U, un marco adaptador neonatal esté bien sujeta (3). El panel de control del inyector automático (1) permite la selección precisa de la jeringa, el volumen y la velocidad de flujo (b) Fotografía de un ratón neonatal (P1) con una aguja insertada en las coordenadas necesarias para inyecciones en el ventrículo lateral:. 1.5 mm ventral y 0,8 mm lateral a la lambda. (c) Ilustración de una sección coronal a través del cerebro de un ratón neonatal (P1) poner de relieve las dimensiones relativas y la posición de los ventrículos.

(B) Imagen bioluminiscencia de un animal adulto (tumores inducidos con el sistema de transposón Sleeping Beauty Show las características histológicas GBM (a) imagen bioluminiscencia humano de un cachorro neonatal 24 horas de después de la inyección intraventricular con plásmidos que codifican NRAS, SV40 LgE: Figura 3. 50 dpi) con un gran tumor inducido con NRAS shp53 y PDGF. (c) Hematoxilina y eosina de una sección coronal de un cerebro de un ratón moribundo con un tumor inducido con NRAS y LgE (28 ppp). (d) Corte coronal de un cerebro de un ratón moribundo con un tumor induce con shp53 NRAS y PDGF. (e) necrosis pseudoempalizada, característica histológica de GBM humana que se observa en los tumores de novo generados. La flecha apunta a células dispuestas en empalizadas que migran fuera de la zona central de necrosis (N) (f) y (g) generada de novo tumores son altamente invasiva, mostrando invasión a lo largo de los vasos sanguíneos (g) y difusa (f) en el parénquima cerebral normal. (H) Región de hemorragia con la invasión masiva de células mononucleares (flecha), la etapa inicial de un área de necrosis pseudoempalizada. (I) glomeruloide recipiente grande con endotelio permeable (flecha) en el origen de la hemorragia de difusión dentro de un tumor inducido con NRAS y SV40 -LgT. (j) mitosis atípica en unos células tumorales (punta de flecha). (k) de las células tumorales Gigantic con múltiples núcleos grandes (punta de flecha).

Figura 4: portadores de tumores animales pueden ser monitoreados con bioluminiscencia durante toda la duración de la progresión de la enfermedad. La mediana de supervivencia de los animales se predice por la combinación deADN oncogénico inyecta. (A) Ejemplo de trazas bioluminiscentes de una cohorte de 7 ratones C57 / BL6. Tenga en cuenta que los ratones sucumben alrededor de una semana después de la bioluminiscencia alcanza 10 ⁸ fotones / s / cm2 / sr. (B) las curvas de supervivencia de la muestra que comparan la supervivencia media de los animales con tumores Sleeping Beauty generados con diferentes combinaciones de plásmidos. La mediana de supervivencia de los tumores inducidos con NRAS y SV40 LgE es de 30 dpi, mientras que de los animales con tumores inducidos con NRAS shp53 y PDGF o shp53 y NRAS es 62.5 ppp o dpi 83 respectivamente. dpi: días después de la inyección.

Figura 5: Naciente macroscópica GBM (22 dpi) inducida con shp53 y NRAS muestran expresión de nestina y GFAP en GFP + células tumorales (fotografías en microscopio confocal) panel (a) muestra un tumor incipiente expresando GFP.. El panel (b) representa el mismo campo que muestra la expresión de nestina. Panel (a) y (b) que ilustra co-localización de nestin y GFP. (D) la expresión de GFP en las células tumorales. (E) la expresión de GFAP en algunas células tumorales y en las células que rodean el tumor naciente. (F) de proyección de superposición de (d) y (e) ilustra algunas células tumorales (blanco) co-expresión de GFAP y GFP. Las barras de escala en (a) y (d) representan 75 micras.

Figura 6: GBM inducida con shp53, ANR y PDGF de un animal moribundo (56 dpi) que muestra GFP y la expresión de nestina en las células tumorales y abundante tinción para el marcador glial GFAP madura que rodea el tumor Panel (a) representa Nissl mancha de la sección acoronal. a través del cerebro de un animal moribundo con un tumor (intensa tinción con azul de from aumento de celularidad) inducida con el durmiente sistema transposón Belleza usando shp53, PDGFΒ y NRAS. Panel (b), una sección coronal adyacente a la ilustrada en el panel (a) se tiñeron con la tinción nuclear DAPI, que muestra la expresión de GFP en las células tumorales. Panel (c) representa una micrografía confocal de la frontera tumor que muestra la expresión de GFP en el tumor, identificado por la densidad nuclear con DAPI alta. Panel (d) ilustra el mismo campo de visión como en (a), que muestra intensa expresión de GFAP en las células adyacentes al tumor. Panel (e) representa la superposición de los paneles (c) y (d). Panel (f) es una micrografía confocal de la frontera tumor, que muestra la expresión de GFP en las células tumorales. Panel (g) representa el mismo campo de visión como en (f), que muestra la expresión de nestina en las células tumorales. Panel (h) es la proyección de superposición de los paneles (f) y (g)

Figura 7:. Neuroesferas de un tumor Bella Durmiente inducida con shp53, PDGF y NRAS después de 5 días en la cultura, el paso 2. Las células están expresando GFP codificada en el plásmido PDGF shp53 (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) Panel (a) es una micrografía de campo claro de un neurosphere. El panel (b) representa una micrografía-epi fluorescente de la misma vista que en (a) que muestra la expresión de GFP en las células neuroesferas. Panel (c) representa la superposición de los paneles (a) y (b).

Discussion

En este artículo, te detallamos un método versátil y reproducible para la generación de nuevos modelos de GBM mediante la integración SB transposase- mediada de ADN plásmido oncogénica en células que rodean la zona subventricular de ratones recién nacidos. Se presenta un protocolo para generar plásmidos transposón con nuevos genes de interés, ilustramos cómo monitorizar la progresión de los tumores en los animales vivos, y cómo caracterizar rasgos histopatológicos y inmunohistoquímicos de estos tumores.

Como nuestro laboratorio (Figura 3) y otros ¹³ han demostrado, este modelo crea de forma fiable los tumores con las características más destacadas de GBM humana, incluyendo (1) necrosis pseudo-empalizada, (2) la proliferación vascular, (3) atipia nuclear, (4) mitosis anormales y ( 5) perivascular y la invasión difusa. El uso de ratones recién nacidos es óptima desde el punto de vista logístico, proporcionando un procedimiento técnico relativamente fácil con un equipo mínimo y sedación tiempo / recuperación, lo que permite la rápida generación de muestras de gran tamaño de los tumores con alteraciones genéticas específicas. Estos tumores causan animales sucumben a la carga tumoral con un dependiente de las alteraciones genéticas inducidas predecible mediana de supervivencia. Finalmente, el modelo SB se ha utilizado como una pantalla de intervención terapéutica para la respuesta al tratamiento ^24.

Hay varios factores importantes a considerar cuando se preparan las soluciones utilizadas para las inyecciones neonatales. Soluciones de ADN deben ser estéril, libre de endotoxina y concentrado (2-7 mg / l) para permitir volumen mínimo de inyecciones. La relación óptima de los residuos de nitrógeno en la polietilenimina (PEI) a los residuos de fosfato en el ADN (N / P) es de 7. Esto asegura la formación de complejos de partículas cargadas positivamente que se unirán restos aniónicos en las superficies celulares y se endocitosis. Una vez en el citoplasma, afluencia osmótica hará que las partículas se rompen y liberan el encapsulatplásmido de ADN ed. La solución in vivo jet-PEI tiene una concentración de 150 mM expresa como residuos de nitrógeno. Teniendo en cuenta que uno g de ADN tiene 3 nmol de fosfato aniónico, la cantidad de reactivo de transfección necesario se puede calcular con la fórmula:

l de vivo jet-PEI = en [(ADN mg x 3) x N / P] / 150.

Por ejemplo, para preparar 40 l de solución de ADN 0,5 g / l con una relación N / P de 7, 20 g de ADN se necesitan. El volumen de PEI necesaria será 20 * 3 * 7/150 = 2.8 l.

Hasta cinco plásmidos diferentes se pueden inyectar de forma simultánea. Los experimentos presentados aquí ofrecen la transposasa Bella Durmiente en trans en un plásmido que también codifica la luciferasa (SBLuc). Como se ha mencionado en la introducción, la proporción de moléculas de transposasa de transposones es importante asegurarse de transposición óptima. La relación óptima (establecido empíricamente) del plásmido SB100x a la transpOson ADN plásmido es 1: 4. Por lo tanto, si uno utiliza dos plásmidos transposón diferentes, T1 y T2 por ejemplo, la relación de SBLuc: T1: T2 será de 1: 2: 2; o para un total de 20 g de ADN en una solución de 40 g de 4 l SBLuc se mezclará con 8 g de T1 y 8 g de T2. Para tres diferentes plásmidos transposón la relación será SBLuc: T1: T2: T3 = 1: 1,33: 1,33: 1,33 y durante cuatro transposones: 1: 1: 1: 1: 1.

Es útil para verificar la absorción del ADN del plásmido por bioluminiscencia 24-72 hr después de la inyección. A medida que crecen los animales, el aumento de la densidad óptica de la piel, la piel, el cráneo y el cerebro, previene el seguimiento de la progresión del tumor hasta que el tumor ha alcanzado un tamaño de umbral, aproximadamente 1-2 mm ³ para los ratones C57BL6 oscuramente pigmentados. Una mejor transmisión de la luz es posible en estos ratones si su piel se afeita, o cuando se utilizan ratones con blanco o ninguna piel.

Varias limitaciones deben tenerse en cuenta cuando se utiliza este modelo. En primer lugar, el genmaterial de tic introducido con los plásmidos inyectados se puede integrar al azar en el genoma del huésped en diferentes ubicaciones y número de copias. Esto puede conducir a la variabilidad entre las células tumorales y entre los tumores. En segundo lugar, el ADN introducido se inserta en primer lugar en secuencias intrónicas TA de repetición de ADN ^25, sin embargo, la posibilidad de interferencia con la codificación del ADN genómico anfitrión permanece. En tercer lugar, las inyecciones intraventriculares pueden causar un pequeño pero persistente tasa de hidrocefalia en ratones jóvenes, que se vuelve clínicamente visible y sintomática en la tercera-cuarta semana de vida. Algunas cepas de ratones son más propensos a la hidrocefalia que otros (es decir, C57 / BL6 más de FVB). Para minimizar el riesgo de inducir la hidrocefalia, se recomienda para inyectar un volumen tan pequeño como sea posible (menos de 1 l en ratones C57 / BL6), para asegurar que las agujas son nítidas, las soluciones tienen baja salinidad y para proporcionar crecimiento cachorros con alimenticio enriquecido, con el fin de permitir la osificación oportuna del Bon cráneoes. Por último, los tumores en etapa tardía a menudo desarrollan necrosis, que tiene que ser considerado en el seguimiento de los ratones por bioluminiscencia. Una lectura más baja puede indicar un tumor avanzado con grandes áreas de necrosis y no necesariamente una resolución del tumor como consecuencia del tratamiento. En última instancia, el análisis histológico sigue siendo el estándar de oro para evaluar la progresión del tumor.

El advenimiento de toda la secuenciación del genoma del tumor en los últimos años ha abierto la puerta a la exploración de la función de los genes mutados en forma recurrente GBM. El modelo de la Bella Durmiente es óptimo para la validación de los oncogenes potenciales o supresores tumorales. Como en el ejemplo dado en el presente documento con PDGFβ ligando, la clonación de la secuencia de ADNc de ratón de un oncogén candidato en un plásmido columna vertebral SB establecido dará lugar a la expresión constitutiva dentro de las células transfectadas. Evaluación de la función de los supresores de tumores puede llevar a cabo eficazmente por la clonación en la columna vertebral del plásmido SB con secuencias de candidatos, (unavailable por ejemplo, en la base de datos del Codex RNAi ^26), para crear sólida expresión de segunda generación de miR-horquillas cortas.

Un debate actual en el campo de la investigación GBM está relacionada con la identidad del origen de las células de pagos. Se ha demostrado recientemente que en los ratones, los tumores inducidos por p53 abajo de la regulación y NF1 en las células madre neurales, se originan a partir de células precursoras de oligodendrocitos ^27. Usando el modelo de Dormir transposón de belleza, estudios similares pueden ser diseñados para probar si otras alteraciones genéticas se dirigen preferentemente otras poblaciones de células madre / células precursoras para generar GBMs. El conocimiento de este tipo de estudios mejorará en gran medida nuestra comprensión de GBM etiología y proporcionar vías para nuevos enfoques terapéuticos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20 oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	For the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	Serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	Serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	For the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	For the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um	Fisher Scientific	08-771-2	For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified)	Fisher Scientific	314-631