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नवजात चूहों के Subventricular जोन में प्लास्मिड डीएनए के transposon मध्यस्थता एकता ग्लियोब्लास्टोमा के उपन्यास मॉडल उत्पन्न करने के लिए

Published: February 22, 2015 doi: 10.3791/52443
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,3, 1,3
1Department of Neurosurgery, University of Michigan School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, University of Michigan School of Medicine, 3Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

Introduction

शल्य चिकित्सा, विकिरण चिकित्सा, और कीमोथेरेपी एक साथ इलाज किया जब glioblastoma मल्टीफॉर्म (जीबीएम) 15-21 महीनों के एक औसत अस्तित्व के साथ, वयस्कों में सबसे आम (60%) प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर है। जीबीएम के लिए उपन्यास उपचारों अनिवार्य हैं। प्रायोगिक उपचारों पर्याप्त रूप से मानव रोग की मुख्य विशेषताएं पुन: पेश जो पशु मॉडल में परीक्षण की आवश्यकता है। कृन्तकों तंत्रिकाबंधार्बुद सेल लाइनों 2 का उपयोग रासायनिक क्षारीकरण एजेंटों के साथ उत्परिवर्तजनन, germline या दैहिक आनुवंशिक परिवर्तन, या प्रत्यारोपण शामिल में रणनीतियाँ जीबीएम प्रेरित करने के लिए। सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल मस्तिष्क में या subcutaneously समान जीनोटाइप के साथ जानवरों में syngeneic कोशिकाओं का उपयोग कर, या तो orthotopically, तंत्रिकाबंधार्बुद सेल लाइनों का आरोपण रोजगार; या xenogeneic कोशिकाओं, प्रतिरक्षा में प्रत्यारोपित सबसे आम तौर पर मानव जीबीएम सेल लाइनों, चूहे 3 के साथ छेड़छाड़ की। Xenografts intracranial ट्यूमर के अध्ययन के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं: reproducibility के सुविधा, standardized विकास दर, मृत्यु और ट्यूमर स्थानीयकरण के समय। छद्म pallisading गल जाना, परमाणु atypias, फैलाना आक्रमण, सूक्ष्म संवहनी प्रसार: implantations है और इसे सही ऊतकीय पुन: पेश करने के लिए सीमित क्षमता के लिए इस्तेमाल किया कृत्रिम, इनवेसिव शल्य दृष्टिकोण करने के लिए मानव जीबीएम (डब्ल्यूएचओ ग्रेड चतुर्थ) की विशेषता सुविधाओं की वजह से हालांकि, इन मॉडलों सीमाएं हैं और glomeruloid संवहनी के गठन 4-7 असामान्यताओं। Oncogenic डीएनए के साथ, या तो वायरल वैक्टर 8-12, या transposon की मध्यस्थता एकीकरण 13 के साथ साथ दैहिक कोशिकाओं के जीनोम बदलकर जीबीएम की प्रेरण, और अधिक बारीकी से मानव रोग के एटियलजि reproduces और मानव जीबीएम के histo के रोग सुविधाओं का स्मरण दिलाता है।

ऐतिहासिक, सीएनएस के ट्यूमर वर्गीकृत यह देखा गया है, जो मूल के कथित सेल, के आधार पर किया गया है, अस्तित्व के 14 के लिए एक भविष्य कहनेवाला कारक होगी। GBMS प्राथमिक और माध्यमिक में वर्गीकृत कर रहे हैं। उभरते सबूत टॉडप्र प्राथमिक ग्लियोब्लास्टोमा 15 की अत्यधिक विषम प्रकृति के लिए अंक। माध्यमिक जीबीएम (15%), कम ग्रेड astrocytomas (डब्ल्यूएचओ ग्रेड आई) और anaplasic astrocytomas की घातक परिवर्तन का परिणाम (डब्ल्यूएचओ ग्रेड द्वितीय), रोग के पहले शुरुआत, बेहतर रोग का निदान और जीन की अभिव्यक्ति का एक "proneural" पैटर्न के साथ जुड़े रहे हैं , प्राथमिक जीबीएम (85%), जबकि एक देर से शुरू होने, गरीब रोग का निदान और glial (शास्त्रीय), तंत्रिका या mesenchymal अभिव्यक्ति पैटर्न दिखा। जीन अभिव्यक्ति के इन नमूनों ट्यूमर की मूल के वास्तविक सेल के साथ सहसंबंधी चाहे अभी भी सक्रिय रूप से जांच की जा रही है। डेटा जमते GBMS के साथ जुड़े आनुवंशिक परिवर्तन के संयोजन के अस्तित्व के लिए भविष्य कहनेवाला हैं कि पता चलता है। उदाहरण के लिए, गुणसूत्रों 1p / 19q, IDH1 म्यूटेशन, PDGFRα amplifications के heterozygocity की हानि (LOH) EGFR overexpression, निशान और ध्वनि हाथी मार्ग सक्रियण, NF, जबकि माध्यमिक GBMS, proneural अभिव्यक्ति पैटर्न और बेहतर रोग का निदान के साथ जुड़े रहे हैंएक और PTEN हानि और p53 के म्यूटेशन तंत्रिका, शास्त्रीय संगीत, या mesenchymal प्राथमिक जीबीएम और बदतर रोग का निदान 16,17 के साथ सहसंबद्ध होते हैं। बड़े पैमाने पर अनुक्रमण परियोजनाओं के आगमन और परीक्षण के लिए उपलब्ध कई मरीज के नमूनों का संचय जीबीएम रोगजनन और प्रगति और चिकित्सा विशेष रूप से के अनुरूप किया जा सकता है, जहां व्यक्तिगत चिकित्सा, की संभावना में फंसा आनुवंशिक परिवर्तन और रास्ते के संबंध में नई जानकारी का एक धन होता है रोगी के आनुवंशिक असामान्यताएं। अंत में, एक व्यवस्थित तरीके से इन म्यूटेशन और रास्ते का भविष्य कहनेवाला मूल्य का आकलन करने के लिए, और प्रत्येक मामले में संभव उपचार परीक्षण करने के लिए, पूर्व निर्धारित आनुवंशिक परिवर्तन के साथ जीबीएम के पशु मॉडल की आवश्यकता है। जीनोमिक डीएनए के transposon मध्यस्थता एकीकरण एक व्यवहार्य तरीका प्रदान करता है।

स्लीपिंग ब्यूटी transposon प्रणाली, transposons की TC1 / मेरिनर वर्ग के सदस्य, एक बहु कदम प्रक्रिया में (निर्माण) "जागा था"निष्क्रिय से अधिक 10 लाख साल पहले 18,19 बन गया है जो एक salmonoid transposase जीन से साइट विशिष्ट mutagenesis के एस एस। संक्षेप में, विशिष्ट दृश्यों (उल्टे दोहराता / प्रत्यक्ष दोहराता: आईआर / डीआर) द्वारा flanked डीएनए transposons स्लीपिंग ब्यूटी transposase की गतिविधि के माध्यम से एक "कट और पेस्ट" तरीके से जीनोम में एकीकृत किया जा सकता है। transposase, आईआर साइटों के सिरों को पहचानता है transposon excises और कुर्सियां ​​टी और ए, स्थानांतरण (चित्रा 1 ए) के दौरान transposon के प्रत्येक के अंत में दोहराया गया है जो अड्डों के बीच एक और डीएनए साइट में बेतरतीब ढंग से यह एकीकृत करता है। स्लीपिंग ब्यूटी transposase तीन डोमेन, एक transposon बाध्यकारी डोमेन, एक परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम और एक उत्प्रेरक डोमेन के शामिल है। चार transposase अणुओं को एक साथ transposon के दोनों सिरों लाने के लिए और स्थानांतरण के लिए अनुमति देते हैं, transposase के भी कई अणुओं मौजूद हैं, हालांकि, अगर वे dimerize कर सकते हैं और मना करने के लिए tetramerize के लिए आवश्यक हैंस्थानांतरण प्रतिक्रिया 20। एक कुशल स्थानांतरण प्रतिक्रिया transposons को transposase की एक इष्टतम अनुपात की आवश्यकता है। Transposase एन्कोडिंग डीएनए (सीआईएस में) transposon के साथ एक ही प्लाज्मिड पर या (ट्रांस में) एक अलग प्लाज्मिड पर दिया जा सकता है। Transposase और transposons के बीच इष्टतम अनुपात सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त गतिविधि के साथ एक प्रमोटर के लिए (("सीआईएस" मॉडल के लिए) transposase की अभिव्यक्ति या अनुकूलित किया जा सकता इंजेक्शन समाधान में plasmids के अनुपात के लिए चुना जा सकता है "पार" मॉडल)। स्लीपिंग ब्यूटी transposon प्रणाली कार्यात्मक जीनोमिक्स, insertional उत्परिवर्तजनन, transgenesis और दैहिक जीन थेरेपी 21 के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है। एक कृत्रिम निर्माण के एक निष्क्रिय salmonoid संस्करण से एक कार्यात्मक अणु को फिर से इंजीनियर होने के नाते, स्लीपिंग ब्यूटी transposase मनुष्य या अन्य स्तनधारियों 20 में अन्य transposons करने के लिए बाध्य नहीं है। इसकी खोज के बाद से, आणविक इंजीनियरिंग बढ़ाने की हैएड आईआर दृश्यों और टाटा dinucleotides, transposon flanking pt2 transposons में जिसके परिणामस्वरूप के अलावा परिवर्तन के माध्यम से एसबी transposon प्रणाली के स्थानांतरण प्रभावकारिता। ये transposons आईआर साइट के लिए एस.बी. के बंधन अनुकूलित और छांटना की प्रभावकारिता में वृद्धि हुई है। एसबी transposase भी महत्वपूर्ण सुधार कराना पड़ा; इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रयोगों में इस्तेमाल transposase SB100X, स्तनधारी कोशिकाओं 22 में एक बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन के बाद डीएनए फेरबदल रणनीति द्वारा उत्पन्न एक अति सक्रिय transposase है।

इस रिपोर्ट में हम नवजात चूहों 23 की उप-निलय क्षेत्र की कोशिकाओं में प्लास्मिड डीएनए की गैर वायरल, transposon की मध्यस्थता एकीकरण के साथ चूहों में आंतरिक जीबीएम प्रेरित करने के लिए एक तेजी से, बहुमुखी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रस्तुत करते हैं। हम स्लीपिंग ब्यूटी transposase का उपयोग कर जीनोमिक एकीकरण के लिए उत्तरदायी उपन्यास जीन के साथ transposons बना सकते हैं और प्लाज्मिड तेज नजर रखने के लिए कैसे प्रदर्शित करने के लिए एक आसान तरीका मौजूद है औरbioluminescence का उपयोग कर रोग प्रगति। हम भी इस मॉडल के साथ reproduced जीबीएम के histological और इम्युनो-histochemical सुविधाओं की विशेषताएँ। इसके अलावा, हम इन ट्यूमर से प्राथमिक जीबीएम सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए एक त्वरित तरीका मौजूद है। ट्यूमर पशु करने के लिए मूल कोशिकाओं से प्रेरित कर रहे हैं, जिसमें स्लीपिंग ब्यूटी मॉडल, प्रेरण और ट्यूमर की प्रगति में उम्मीदवार जीबीएम जीन की भूमिका के कार्यात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस प्रणाली को भी अच्छी तरह से स्थानीय microenvironment बदल सकता है जो आक्रामक भड़काऊ सर्जिकल प्रक्रियाओं की जरूरत है, बिना, इम्युनो-सक्षम चूहों में प्रतिरक्षा उपचारों सहित उपन्यास जीबीएम उपचार, के परीक्षण के लिए अनुकूल है।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रोटोकॉल पशुओं के उपयोग और देखभाल के लिए मिशिगन समिति विश्वविद्यालय (UCUCA) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

नई स्लीपिंग ब्यूटी transposons में रुचि के अनुक्रम 1. क्लोनिंग

नोट: जीन या स्लीपिंग ब्यूटी transposase प्रणाली का उपयोग (shRNA के रूप में) निरोधात्मक तत्वों को सम्मिलित करने के लिए, एक PKT या pt2 प्लाज्मिड की रीढ़ की हड्डी में ब्याज के अनुक्रम क्लोन। क्लोनिंग प्रत्यक्ष नियामक तत्व है, ब्याज और मार्कर के जीन उल्टे दोहराता (आईआर / डीआर) द्वारा flanked रहते हैं कि इस तरह के। नीचे विस्तृत है एक PKT रीढ़ की हड्डी में PDGFβ क्लोनिंग का एक उदाहरण है (देखें भी चित्रा 1 बी)।

  1. प्रतिक्रिया मात्रा का 50 μl में XbaI / XhoI प्रतिबंध एंजाइमों के 5-10 इकाइयों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए प्लाज्मिड वेक्टर PKT-IRES-Katushka के 5 माइक्रोग्राम प्रति डाइजेस्ट।
  2. 5-10 यूनिट के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए pGEM-टी mPDGFβ प्लाज्मिड के 5 माइक्रोग्राम प्रति की mPDGFβ सीडीएनए डाइजेस्टNcoI / SACI प्रतिबंध एंजाइमों के एस।
  3. 100% इथेनॉल के 2.5 संस्करणों, और 3 एम ना एसीटेट, पीएच 5.8 से 1/10 मात्रा जोड़कर कुल डीएनए वेग और -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  4. 15 मिनट के लिए 13,800 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  5. , 1 मिनट के लिए 13,800 XG पर 70% इथेनॉल, सेंट्रीफ्यूज के 500 μl के साथ डीएनए गोली धोने एक बार दोहराने और बाँझ DNase मुफ्त पानी के 19 μl में फिर से निलंबित।
  6. (MPDGFβ) दोनों सदिश (PKT-IRES-Katushka) के सिरों को कुंद और सम्मिलित करने के लिए त्वरित blunting किट में निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  7. पा वेक्टर लोड और एक 1.2% ethidium ब्रोमाइड दाग agarose जेल पर डालने और 40 मिनट के लिए 80 वी पर चलाते हैं। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक जेल सफ़ाई किट का उपयोग डीएनए को शुद्ध, बैंड कल्पना एक साफ रेजर ब्लेड और जेल के साथ उन्हें आबकारी।
  8. एक दाढ़ अनुपात (डालने: वेक्टर) एक 4 पर एक ट्यूब में उन्हें जोड़कर कदम 1.7 में शुद्ध डालने और वेक्टर डीएनए ligate। इस ट्यूब, पी मेंipette टी -4 ligase की एक μl और (एटीपी युक्त) टी -4 ligase बफर के 2 μl, और बाँझ पानी के साथ 20 μl के लिए मात्रा समायोजित करें। 16 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए बंधाव प्रतिक्रिया सेते हैं।
  9. Ligated उत्पादों के साथ रासायनिक सक्षम DH5α बैक्टीरियल कोशिकाओं रूपांतरण।
    1. बर्फ पर सक्षम कोशिकाओं पिघलना।
    2. , सक्षम कोशिकाओं के 50 μl के लिए बंधाव प्रतिक्रिया की पूरी मात्रा जोड़ें धीरे ट्यूब हिला और 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं। 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड के लिए बैक्टीरिया हीट शॉक और बर्फ को तुरंत वापस; एक और दो मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    3. संस्कृति के Luria शोरबा के 950 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ सेते हैं। अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया 2400 XG पर 3 मिनट के लिए और पौंड के 200 μl में गोली फिर से निलंबित
    4. लेग-agarose और इसी एंटीबायोटिक के साथ लेपित एक पेट्री डिश पर तब्दील बैक्टीरिया बिखरा हुआ है। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात थाली सेते हैं।
    5. अंत में, 5-10 bacte इकट्ठारियाल कालोनियों और एंटीबायोटिक के साथ लेग मीडिया के 5 मिलीलीटर में रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्लास्मिड डीएनए मिनी किट का उपयोग प्लास्मिड डीएनए शुद्ध। एक नैदानिक ​​प्रतिबंध वेक्टर में डालने का उचित समावेश को सत्यापित करने और डालने के अधिकार का उन्मुखीकरण सुनिश्चित करने के लिए डीएनए अनुक्रमण के लिए सकारात्मक क्लोन प्रस्तुत करने को पचाने में प्रदर्शन करते हैं।
  10. मुक्त प्लाज्मिड तैयारी किट endotoxin, सही कालोनियों का चयन करें और एक उच्च गुणवत्ता का उपयोग डीएनए उत्पादन पैमाने।
  11. बाँझ पानी या एक मिमी Tris-एचसीएल में डीएनए elute। तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर डीएनए नवजात शिशुओं में इंजेक्षन करने के लिए।

2. इंट्रा-निलय नवजात इंजेक्शन

  1. प्रयोग करने के लिए तीन से चार सप्ताह से पहले, एक पुरुष और एक महिला माउस, और एक प्लास्टिक रंग का इग्लू के साथ एक माउस प्रजनन पिंजरे की स्थापना की। यह एक समृद्ध वातावरण प्रदान करता है और संभोग की प्रक्रिया एड्स।
  2. गर्भावस्था की पुष्टि की है, जब एम को दूरएक नए पिंजरे में शराब। अठारह दिनों संभोग के बाद, प्रसव के लिए दैनिक पिंजरे की निगरानी। प्रसव के बाद दिन 1 (P1) पर intraventricular इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं।
  3. इंजेक्शन समाधान की तैयारी
    नोट: इंजेक्शन समाधान अभिकर्मक के लिए कणों बनाने के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ प्लास्मिड डीएनए के मिश्रण से बना है। Pt2 / SB100x ल्यूक और दो transposon प्लास्मिड: पीटी / CAGGS-NRASV12 और पीटी / सीएमवी-SV40-LGT के अनुपात में, नीचे स्लीपिंग ब्यूटी transposase और luciferase एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड का उपयोग कर एक इंजेक्शन समाधान की तैयारी पर एक उदाहरण है 1: 2: 2। सभी प्लास्मिड 2 माइक्रोग्राम प्रति / μl के एक एकाग्रता है। इंजेक्शन समाधान की तैयारी पर महत्वपूर्ण जानकारी चर्चा में प्रस्तुत कर रहे हैं।
    1. / सीएमवी-SV40-LGT और 10 μl चार माइक्रोग्राम प्रति (2 μl) पीटी के pt2 / SB100x ल्यूक, पीटी / CAGGS-NRASV12 के 8 माइक्रोग्राम प्रति (4 μl) और 8 माइक्रोग्राम प्रति (4 μl) की: जोड़कर डीएनए समाधान तैयार एक माइक्रोग्राम प्रति / एमएल की एकाग्रता में 20 μl के अंतिम मात्रा 10% ग्लूकोज कीडीएनए और 5% ग्लूकोज।
    2. 5% ग्लूकोज की एक अंतिम एकाग्रता के लिए इन विवो जेट पी के 2.8 μl, बाँझ पानी की 7.2 μl, और 10% ग्लूकोज के 10 μl जोड़कर पी समाधान तैयार है।
    3. डीएनए समाधान के लिए पी समाधान जोड़ें और मिश्रण भंवर और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में बैठते हैं। समाधान अब इंजेक्शन के लिए तैयार है। आरटी पर एक घंटे के बाद, बर्फ पर समाधान रहते हैं।
    4. Micropump में 12.5 डिग्री उठाव के साथ एक 30 गेज चमड़े के नीचे सुई के साथ सुसज्जित एक 10 μl साफ सिरिंज फ़िट (चित्रा 2 # 1)।
  4. इंजेक्शन प्रणाली के समुचित कार्य को सत्यापित करने के लिए, स्वत: इंजेक्टर का उपयोग (चित्रा 2 # 1) सिरिंज में पानी की 10 μl वापस लेने और फिर पूरी तरह से सिरिंज खाली करने के लिए
  5. नवजात stereotaxic चरण कूल (चित्रा 2 # 3) 2-8 डिग्री सेल्सियस के तापमान को सूखी बर्फ और शराब की एक घोल के साथ।
  6. गीला बर्फ पर पिल्ले रखकर संज्ञाहरण प्रेरित2 मिनट के लिए। संज्ञाहरण प्रक्रिया के शेष के लिए ठंडा stereotaxic फ्रेम पर जारी रहेगा। सी थर्मल जला चोटों को रोकने जाएगा ° 2-8 के बीच, ठंड से ऊपर फ्रेम के तापमान को बनाए रखने। के रूप में विशेष एहतियात पिल्ले गीला बर्फ पर रखने से पहले धुंध में लिपटे जा सकता है।
  7. डीएनए / पी समाधान के साथ सिरिंज भरें।
  8. धुंध कवर कान सलाखों (चित्रा 2 बी) के बीच अपने सिर रखकर stereotaxic फ्रेम में पिल्ला स्थिर। खोपड़ी के पृष्ठीय पक्ष क्षैतिज सुनिश्चित करें कि, फ्रेम की सतह के समानांतर और कपाल टांके स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। 70% इथेनॉल के साथ सिर साफ कर लें।
  9. सिरिंज की सुई लोअर और सुई लैम्ब्डा (पार्श्विका और पश्चकपाल हड्डियों के midline चौराहे) (चित्रा 2 बी) को छूता तक stereotaxic फ्रेम का नंबर डायल का उपयोग कर stereotaxic निर्देशांक समायोजित करें।
  10. सुई लिफ्ट और 0.8 मिमी पार्श्व और 1.5 मीटर करने के लिए stereotaxic निर्देशांक समायोजितलैम्ब्डा (चित्रा 2 बी) एम व्याख्यान चबूतरे वाला।
  11. इसे छू और थोड़ा त्वचा डिम्पल जब तक सुई कम करें। निर्देशांक उपाय। सुई एक और 1.5 मिमी कम है। सुई त्वचा और खोपड़ी पियर्स, और पार्श्व वेंट्रिकल (चित्रा -2) में प्रवेश के लिए कोर्टेक्स से गुजरना होगा।
  12. स्वचालित इंजेक्टर का प्रयोग, / मिनट 0.5 μl की दर से डीएनए / पी समाधान के 0.75 μl इंजेक्षन
  13. समाधान निलय में फैलाने के लिए अनुमति देने के लिए एक मिनट के लिए सीमा पर पिल्ला रखें। इस बीच, अगले इंजेक्शन के लिए तैयार करने में दो मिनट के लिए बर्फ पर, एक और पिल्ला anesthetize।
  14. और धीरे धीरे सुई उठा, और एक हीटिंग दीपक के नीचे पिल्ला जगह है। साँस लेने और गतिविधि पर नजर रखने। यदि आवश्यक हो पहली सांस लेने ensues जब तक, अंगों की कोमल उत्तेजना प्रदान करते हैं।
  15. यह गरम, नियमित रूप से साँस ले रहा है, एक गुलाबी रंग तक पहुँच गया है और आम तौर पर, 5-7 मिनट सक्रिय है के बाद अपनी मां को पिल्ला लौटें। मो हैंएक पिल्ला एक समय में इंजेक्ट किया जाता है की तुलना में कर रहे हैं, सभी इंजेक्शन किया जाता है जब तक एक साथ सभी पिल्ले रहते हैं। इंजेक्शन अब से 30 मिनट लेते हैं, पहले 30 मिनट और प्रक्रिया के अंत में आराम के बाद पिल्ले के आधे से लौटने।
  16. बांध संवेदनशील और उसके पिल्ले को पोषण है कि निगरानी। यदि आवश्यक हो, पिंजरे में एक किराए की माँ जोड़ें।
  17. बर्फ पर पिल्ला रखने और वार्मिंग दीपक के नीचे रखकर बीच के अंतराल को कम से कम 10 मिनट है कि सुनिश्चित करें। अस्तित्व के बेहतर प्रक्रिया तेज। आमतौर पर, यह anesthetize और एक पिल्ला इंजेक्षन करने के लिए लगने वाले समय 4 मिनट है।

ट्यूमर गठन और प्रगति के 3. Bioluminescence निगरानी

3.1) इंजेक्शन के बाद प्लाज्मिड तेज निगरानी

  1. इंजेक्शन के बाद 24-72 घंटा, एक 6 अच्छी तरह से साफ टिशू कल्चर पकवान, एक पिल्ला में मां के पिंजरे और जगह से सभी पिल्ले को निकालने के प्रति अच्छी तरह से।
  2. सामान्य नमक या phosphat में भंग luciferin के 30 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयारई बफर। अग्रिम में इस समाधान को तैयार है और -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots में रहते हैं।
  3. एक 30 गेज चमड़े के नीचे सुई से लैस एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग पिल्ला के कंधे ब्लेड के बीच luciferin subcutaneously के 30 μl इंजेक्षन। सुई त्वचा बन्द रखो और सुई डालने से पहले थोड़ा इसे उठाने के द्वारा, किसी भी अंगों बेध नहीं है यह सुनिश्चित।
  4. छवि तुरंत, एक में vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए। स्वत: जोखिम, बड़े binning, और एपर्चर च = 1: IVIS स्पेक्ट्रम के लिए, अधिग्रहण के लिए निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें।

3.2) मॉनिटरिंग ट्यूमर गठन और प्रगति

नोट: पशु, 2 आधा-छह हफ्तों के भीतर bioluminescence और ऊतक विज्ञान द्वारा detectable स्थूल ट्यूमर के गठन इंजेक्ट oncogenic प्लास्मिड के आधार पर शुरू कर देंगे।

  1. एक 26 गेज सुई के साथ सुसज्जित एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग एक 30 मिलीग्राम / एमएल luciferin समाधान के 100 μl इंट्रा-peritoneally इंजेक्षन।
  2. संज्ञाहरण चैम्बर में पशु रखें। एक ही समय में पांच पशुओं के लिए ऊपर इंजेक्षन।
  3. फिर जानवरों anesthetize को ऑक्सीजन / isoflurane के प्रवाह (1.5-2.5 isoflurane%) शुरू 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। 3-4 मिनट के बाद, संज्ञाहरण चैम्बर से जानवरों को दूर bioluminescence कक्ष में ऑक्सीजन / isoflurane के प्रवाह शुरू करते हैं। संज्ञाहरण और प्रकाश की अबाधित पारित होने के लिए अनुमति देने के लिए गिलास नाक शंकु के साथ सुसज्जित संबंधित स्लॉट्स में पशुओं रखें।
  4. आमतौर पर, एक स्वचालित जोखिम समय, मंझला binning और च = 1 का एक खुला एपर्चर के साथ 2 मिनट के अंतराल पर छह छवियों की एक श्रृंखला, अधिग्रहण।
  5. सिर क्षेत्र से अधिक है, जो आम तौर पर एक अंडाकार imaged सभी जानवरों के लिए ब्याज के क्षेत्र सेट करें, और / एस / 2 सेमी / एस आर calibrated इकाइयों फोटॉनों का उपयोग कर luminescence तीव्रता को मापने।
  6. प्रत्येक जानवर के लिए अधिक से अधिक मूल्य के रिकार्ड। बाद में, रिकॉर्डिंग उदाहरण whe के लिए, प्रत्येक जानवर और / या जानवरों के बीच के लिए ट्यूमर की प्रगति के दौरान तुलना की जा सकतीएन अलग उपचार कार्यरत हैं।

नई GBMS 4. histological और Immunohistochemical विश्लेषण

नोट: ट्यूमर वांछित प्रयोगात्मक समय बिंदु तक पहुँच चुके हैं, जानवरों का बलिदान किया जा सकता है, दिमाग, perfused तय की और विश्लेषण किया। अस्तित्व के लिए पशु रोगसूचक दिखा बिगड़ा गतिशीलता, hunched मुद्रा और मैला-कुचैला फर हो जाता है जब नैदानिक ​​मंच द्वारा परिभाषित के रूप में पशुओं नम्रता, ट्यूमर बोझ का पहला संकेत पर बलिदान कर रहे हैं जब मरणासन्न अवस्था, प्रयोग के समापन बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है विश्लेषण करती है। इस्तेमाल मानक ऊतकीय और इम्युनो-histochemical विधियों का एक संक्षिप्त विवरण नीचे प्रस्तुत किया है।

4.1) छिड़काव और फिक्सेशन

  1. 100 ketamine का मिलीग्राम / किग्रा और xylazine के 10 मिलीग्राम / किग्रा की एक अंतर-पेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ माउस anesthetize।
  2. माउस के पैर pinching द्वारा पेडल पलटा जाँच करें। इस पलटा समाप्त कर दिया जाता है, यह दर्शाता गहरी संज्ञाहरण, immob, उदर गुहा खोलने, पिन के साथ एक विच्छेदन बोर्ड पर माउस ilize डायाफ्राम काटना और दिल कल्पना करने के वक्ष गुहा खोलें।
  3. दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक कुंद 20 गेज प्रवेशनी डालें। प्लास्टिक ट्यूबिंग, 2 CaCl 2H 2 हे ऑक्सीजन और heparinized Tyrode का समाधान (0.8% सोडियम क्लोराइड, 0.0264% के साथ एक कंटेनर के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से गुजर साथ प्रवेशनी कनेक्ट 0.005% नाह 2 पीओ 4, 0.1% ग्लूकोज, 0.1% 3 NaHCO, 0.02 % KCl)। एक धीमी और निरंतर प्रवाह, जानवरों में छोटे होते हैं, तो दूसरे या उससे कम के अनुसार लगभग एक बूंद सुनिश्चित करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की गति का समायोजन करके Tyrode के समाधान के प्रवाह को प्रारंभ करें।
  4. रक्त और Tyrode की नाली की अनुमति के लिए दिल की सही अलिंद में एक छोटा सा चीरा बनाओ।
  5. वे खून से रहित हो जाते हैं (जिगर और गुर्दे में सबसे स्पष्ट) आंतरिक अंगों की blanching देख द्वारा छिड़काव दक्षता मॉनिटर।
  6. कबदिल से खाली समाधान (3-5 मिनट) स्पष्ट है, निर्धारण (4% पीएफए, फॉस्फेट बफर खारा में पीएच 7.34) के लिए 4% paraformaldehyde के लिए Tyrode से समाधान स्विच।
  7. गर्दन और पूंछ की वृद्धि की कठोरता से ऊतकों की भलाई के निर्धारण की निगरानी।
  8. माउस सिर काटना और ध्यान से खोपड़ी से मस्तिष्क काटना।
    1. नाक की ओर, rostrally खोपड़ी को शामिल किया गया है, जो फर खींचो, और सिर, पृष्ठीय पक्ष को स्थिर करने के लिए मजबूती से इसे ले लो।
    2. कक्षीय मांसपेशियों और अंतर्निहित गाल की हड्डी का मेहराब आड़ा काट करने के लिए, कक्षा की बढ़त के साथ नीचे की ओर कटौती एक तेज स्केलपेल, का उपयोग करना।
    3. सिर उदर पक्ष मुड़ें और एक rongeur का उपयोग कर संलग्न गर्दन की मांसपेशियों को हटा दें। पहले बांस को कुचलने और brainstem से हटा दें।
    4. , कोक्लीअ कल्पना rongeur साथ overlying लौकिक हड्डी हड़पने के लिए और लौकिक और पश्चकपाल हड्डी के बीच एक खोलने पैदा करते हैं। सेरिबैलम की सतह से पश्चकपाल हड्डी बंद छील।
    5. सिर उदर पक्ष बढ़ाएं। मस्तिष्क पूरी तरह कपाल नसों के माध्यम से अब जुड़ा हुआ है, खोपड़ी के शेष से नीचे स्लाइड। का प्रयोग छोटे कैंची घ्राण, ऑप्टिक और त्रिपृष्ठी नसों में कटौती। यह मस्तिष्क जारी करेंगे।
  9. बाद के निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 4% पीएफए ​​में मस्तिष्क रखें।
  10. ऊतकीय विश्लेषण और hematoxylin-eosin धुंधला के लिए, 24 घंटा के लिए फॉस्फेट बफर करने के लिए दिमाग हस्तांतरण और फिर embedding आयल के लिए आगे बढ़ें।
  11. (दिमाग ट्यूब के नीचे डूब तक) इम्युनो-ऊतकीय विश्लेषण के लिए, 24-48 घंटे के लिए फॉस्फेट बफर खारा में एक 30% sucrose के समाधान में दिमाग का स्थानांतरण
  12. ट्यूमर क्षेत्र के बीच के माध्यम से आधे में धारा दिमाग, कट जगहनीचे एक ठंड मोल्ड में पक्ष, सूखी बर्फ इथेनॉल, सूखी बर्फ isopentane के घोल में या तरल नाइट्रोजन में क्रायो embedding मीडिया (अक्टूबर यौगिक), और फ्लैश फ्रीज में एम्बेड। सेक्शनिंग और धुंधला तक डिग्री सेल्सियस -80 पर जमे हुए ब्लॉक रखें।

4.2) आयल की Hematoxylin-eosin धुंधला आंतरिक GBMS की histo-रोग विश्लेषण के लिए दिमाग एंबेडेड

  1. धारा आयल गिलास स्लाइड पर एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में छोड़ देता है और माउंट, चार माइक्रोन मोटाई में दिमाग एम्बेडेड।
  2. Xylene से भर तीन स्लाइड कंटेनरों की एक श्रृंखला के माध्यम से 5 मिनट के अंतराल पर उन्हें स्थानांतरित तो एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में 10 मिनट के लिए उन्हें रखने और द्वारा डी-paraffinize स्लाइड।
  3. 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल एक बार फिर से, 95% इथेनॉल के 2 मिनट के लिए, एक बार फिर से, 70% इथेनॉल के 2 मिनट के लिए और फिर पानी के लिए स्लाइड स्थानांतरण: इथेनॉल स्नान की एक श्रृंखला के माध्यम से स्लाइड हाइड्रेट।
  4. 2 मिनट के लिए हैरिस Hematoxylin से भरा एक स्लाइड कंटेनर में उन्हें सूई से स्लाइड दाग।
  5. पानी साफ है जब तक नल के पानी में कुल्ला।
  6. डुबकी दो बार उदास समाधान (0.1% सोडियम बाइकार्बोनेट) में स्लाइड।
  7. स्लाइड 2 मिनट के लिए पानी के नल में खड़े हो जाओ, फिर 2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल के लिए स्थानांतरण।
  8. 5 मिनट के लिए eosin से भरा एक कंटेनर में उन्हें सूई से स्लाइड दाग।
  9. (एक बार फिर से, एक बार, 100% इथेनॉल 2 मिनट दोहराने, 80% इथेनॉल 3-4 गिरावट, 95% इथेनॉल के 2 मिनट) इथेनॉल स्नान की एक श्रृंखला में स्लाइड्स निर्जलीकरण।
  10. Xylene की लगातार 3 स्नान, 3 मिनट प्रत्येक के साथ साफ़।
  11. एक xylene आधारित बढ़ते मध्यम के साथ coverslip और इमेजिंग के लिए तैयार है जब तक कमरे के तापमान पर एक सपाट सतह पर दो सूखी। कमरे के तापमान पर रखो।

डी नोवो प्रेरित GBMS की आणविक और सेलुलर विशेषता के लिए क्रायो-संरक्षित एंबेडेड दिमाग के 4.3) इम्यूनो-ऊतकरसायनविज्ञान

  1. , -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से जमे हुए ब्लॉक निकालते हैं cryostat में डाल दिया है और तापमान 30 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति देते हैं।
  2. धारा 12-14 माइक्रोन मोटी वर्गों और सकारात्मक आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर 2-3 वर्गों माउंट। अलग स्लाइड्स पर आसन्न वर्गों को इकट्ठा करके, क्रमानुसार वर्गों में कटौती। यह ट्यूमर के भीतर आसन्न ऊतक वर्गों पर अलग एंटीबॉडी के साथ धुंधला अनुमति देता है।
  3. ऊतक के अच्छे पालन के लिए अनुमति देने के लिए सेक्शनिंग के बाद कम से कम एक घंटा के लिए एक desiccator में सूखी स्लाइड।
  4. वर्गों को कवर करने के लिए और washes के दौरान स्लाइड पर रहने के लिए तरल के लिए अनुमति देने के लिए स्लाइड के प्रत्येक के अंत में (एक हाइड्रोफोबिक मार्कर के साथ) एक हाइड्रोफोबिक बाधा पैदा करते हैं। 0.1% ट्राइटन-एक्स के साथ फॉस्फेट बफर खारा की एक समाधान के साथ वर्गों (पीबीएस 0.1% टीएक्स) को कवर किया और धीरे ऊतक permeabilize के लिए एक क्षैतिज प्रकार के बरतन पर 5 मिनट के लिए हिला। दो बार दोहराएँ।
  5. कोमल झटकों के साथ 30 मिनट के लिए अविशिष्ट (माध्यमिक एंटीबॉडी उठाया गया था, जिसमें पशु से या सीरम) 10% सामान्य बकरी सीरम का एक समाधान के साथ बंधन को अवरुद्ध करें
  6. पीबीएस में 0.1% 2% सामान्य बकरी सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयारटीएक्स और वर्गों पर समाधान विंदुक। अंधेरे में एक कवर नम कक्ष में स्लाइड्स प्लेस और रात भर कमरे के तापमान पर रखने के लिए।
  7. अगले दिन, पीबीएस 0.1% टीएक्स के साथ 5 मिनट के लिए वर्गों में तीन बार धो लें और एक घंटे के लिए 2% सामान्य बकरी सीरम पीबीएस 0.1% टीएक्स में पतला फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी में सेते हैं।
  8. प्रतिदीप्ति की रक्षा करेंगे कि बढ़ते मध्यम आधारित एक पानी से धो लें एक बार फिर, साफ पानी और coverslip में, 2 मिनट के लिए एक परमाणु दाग (जैसे, DAPI) के साथ counterstain पीबीएस 0.1% टीएक्स के साथ 5 मिनट के लिए वर्गों तीन बार धोएं। एक सपाट सतह पर स्लाइड प्लेस और उन्हें इमेजिंग के लिए तैयार है जब तक अंधेरे में, कम से कम 24 घंटे के लिए इलाज करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर उसके बाद रखें।

विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन के साथ प्राथमिक ट्यूमर सेल लाइनों के 5. जनरेशन।

  1. सौंदर्य ट्यूमर असर चूहों नींद से सेल लाइनों उत्पन्न करने की पुष्टि की बड़े ट्यूमर (bioluminescence 10 7 -10 8 फोटॉनों / एस / सेमी के साथ एक माउस का चयन2 / आर)।
  2. (धारा 4 में वर्णित) खोपड़ी से मस्तिष्क काटना ध्यान से, isoflurane संवेदनाहारी की अधिक मात्रा के साथ माउस Euthanize पशु सिर काटना और। एक साफ पेट्री डिश में मस्तिष्क रखें।
  3. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, ट्यूमर के राज्याभिषेक कटौती पूर्वकाल और कूल्हों बनाते हैं। ट्यूमर के स्थान की वजह से मस्तिष्क की पारदर्शिता के लिए आम तौर पर स्वीकार करने योग्य है।
  4. ठीक संदंश के साथ व्यास में ट्यूमर है, आम तौर पर 5-7 मिमी काटना और 300 μl तंत्रिका स्टेम सेल मीडिया के साथ भरा एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जगह (एनएससी मीडिया: बी-27 के पूरक, एन 2 के पूरक हैं, और Normocin साथ DMEM / F12, साथ पूरक 20 एनजी की एकाग्रता में मानव पुनः संयोजक EGF और bFGF / मिलीलीटर प्रत्येक)।
  5. धीरे ट्यूब की दीवारों के लिए फिट बैठता है जो एक प्लास्टिक मूसल, साथ ट्यूमर homogenize।
  6. एंजाइम मुक्त ऊतक हदबंदी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन पास के 10 एमएल के साथ झरनी धोनेएनएससी मीडिया, 4 मिनट, निथारना सतह पर तैरनेवाला और के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र एनएससी मीडिया के 7 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित।
  8. 95% हवा और 5% सीओ 2 के एक टिशू कल्चर के साथ इनक्यूबेटर और वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक T25 संस्कृति फ्लास्क और संस्कृति पर प्लेट। तीन दिनों के बाद, कुछ कोशिकाओं कुछ संस्कृति डिश के नीचे का पालन किया, मृत्यु हो गई है, और कुछ स्वतंत्र रूप से मीडिया में तैर, बनाने neurospheres हैं।
  9. एक T75 टिशू कल्चर कुप्पी पर इन निलंबित कोशिकाओं और फिर से थाली निकालें।
  10. संस्कृति का एक और तीन दिनों के बाद, neurospheres जमा है, कदम 5.6 में वर्णित के रूप में सेल झरनी के माध्यम से, तनाव को अलग कर देना और कोशिकाओं की गिनती। एक T75 कुप्पी के लिए EGF और FGF के साथ पूरक एनएससी के 14 मिलीलीटर में एक लाख की कोशिकाओं के घनत्व पर भ्रूण गोजातीय सीरम 10% DMSO में कोशिकाओं और पारित होने कोशिकाओं के aliquots फ्रीज। विकास दर ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया ओंकोजीन पर निर्भर करेगा। अतिवृद्धि रोकने के लिए और अपेक्षाकृत उच्च घनत्व में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए सेल संस्कृति शर्तों को अपनाना।

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Representative Results

एसबी प्रेरित glioblastomas की histo के रोग सुविधाओं को चिह्नित करने के लिए, C57 / BL6 नवजात चूहों प्लास्मिड oncogenic डीएनए, यानी, NRAS (पीटी / CAGGS साथ transposons एन्कोडिंग के साथ संयोजन में एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग luciferase (pt2 / SB100x ल्यूक) के साथ P1 पर इंजेक्ट किया गया -NRASV12) और SV40 LGT (पीटी / CMVSV40-LGT) (चित्रा -3 सी) या PDGFβ के साथ एक छोटी बाल के लिये कांटा p53 और NRAS (चित्रा 3 डी के साथ संयोजन में एक GFP रिपोर्टर (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड)। पशु इंजेक्शन (चित्रा 2A) के बाद दिन bioluminescence के लिए निगरानी और समय-समय पर वे euthanized थे जब मरणासन्न अवस्था तक पहुँचने तक कर रहे थे। मरणासन्न अवस्था पशु रोगसूचक दिखा बिगड़ा गतिशीलता, hunched मुद्रा, मैला-कुचैला फर और वजन घटाने हो जाता है जब नैदानिक ​​मंच के रूप में परिभाषित किया गया है। कभी कभी, जानवरों हलकों और अचानक कूद में चलने की तरह, दौरे या आंदोलन के असामान्य पैटर्न का विकास। प्रयोग जानवर के अंत मेंएस anesthetized थे। दिमाग, perfused पैराफिन में एम्बेडेड, और hematoxylin और eosin धुंधला के लिए प्रोसेस किया गया। मस्तिष्क पैरेन्काइमा में हेमोरेज (चित्रा -3 सी), छद्म pallisading परिगलन (चित्रा 3E) और परिवाहकीय और फैलाना आक्रमण के साथ मानव जीबीएम (डब्ल्यूएचओ ग्रेड चतुर्थ) की पहचान को प्रदर्शित करने के डेटा दिखाने के ट्यूमर (चित्रा 3 जी, एफ)। pseudopallisades के गठन मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर घुसपैठ (चित्रा 3h) के साथ नकसीर के क्षेत्रों में जो परिणाम टपकाया endothelia (चित्रा 3 आई) के साथ बड़े glomeruloid वाहिकाओं के फटने से पहले है। अनियमित mitoses (चित्रा 3J) और विशाल multinucleated ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 3K) भी मानव जीबीएम के pathognomonic हैं।

प्लास्मिड इंजेक्ट अगर Glioblastomas, bioluminescence के साथ ट्यूमर के विकास की प्रगति के दौरान नजर रखी जा सकती स्लीपिंग ब्यूटी transposase प्रणाली का उपयोग कर उत्पन्नसांकेतिक शब्दों में बदलना luciferase। एक उदाहरण प्रयोग चित्रा -4 ए में दिखाया गया है। Luminescence / एस / 2 सेमी / एस आर 10 7 -10 9 फोटॉनों की एक तीव्रता पहुंचता है जब पशु आमतौर पर ट्यूमर बोझ के आगे झुकने। चित्रा 4 बी में प्रस्तुत अस्तित्व घटता में सचित्र के रूप में पशुओं की औसत अस्तित्व, नवजात मस्तिष्क में इंजेक्शन oncogenic transposons के संयोजन पर जाहिर निर्भर है। Shp53 NRAS और PDGF साथ प्रेरित जीबीएम के साथ जानवरों की औसत अस्तित्व 62.5 दिन और shp53 और NRAS 83 दिनों के इंजेक्शन के साथ जानवरों की है, जबकि सबसे आक्रामक ट्यूमर NRAS और SV40 LGT प्रतिजन (30 दिनों के औसत उत्तरजीविता) के साथ प्रेरित कर रहे हैं कि ध्यान दें।

डी नोवो का गठन ट्यूमर glial ट्यूमर के लक्षण अणुओं की उनकी अभिव्यक्ति से इम्युनो-histochemically होती जा सकता है। 5 एक नवजात ट्यूमर (22 डीपीआई, bioluminescence 2x10 5 फोटॉनों / एस / 2 सेमी / एस आर) से पता चलता है, shp53 साथ प्रेरितऔर NRAS। इंजेक्शन के shp53 प्लाज्मिड ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान और उनकी संतान (pt2 / shp53 / GFP) के अनुमति देने के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए encodes। + GFP ट्यूमर कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर nestin और भी glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन व्यक्त कुछ GFP + कोशिकाओं (GFAP) व्यक्त करते हैं। 6 56 डीपीआई, भी shp53 / GFP और NRAS साथ प्रेरित किया गया था, जो ट्यूमर में एक मरणासन्न जानवर से एक ट्यूमर को दिखाता है चित्रा। कई GFAP + astrocytes ट्यूमर के आस कर रहे हैं। + GFP ट्यूमर कोशिकाओं GFAP nestin व्यक्त की, लेकिन नहीं।

GBMS प्रेरित करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करते समय एक बड़ा फायदा इंजेक्ट transposons के माध्यम से अद्वितीय आनुवंशिक परिवर्तन के साथ उपन्यास जीबीएम सेल लाइनों उत्पन्न करने की क्षमता है। इसके अलावा, कस्टम सेल लाइनों विशिष्ट आनुवंशिक मेकअप के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है। इन सेल लाइनों जैव रासायनिक assays का उपयोग कई यंत्रवत सवाल पूछ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। वे आदर्श उपन्यास चर्चा के साथ cytotoxicity पढ़ाई के लिए उपयुक्त हैंemotherapeutic एजेंटों। चित्रा 7 इंजेक्ट प्लास्मिड में से एक पर इनकोडिंग है जो GFP की अभिव्यक्ति दिखा shp53, PDGF और NRAS, साथ प्रेरित एक स्लीपिंग ब्यूटी ट्यूमर से एक neurosphere दिखाता है। इन प्राथमिक जीबीएम कोशिकाओं की विषम प्रकृति का संकेत है कि अभिव्यक्ति सभी कोशिकाओं में समान रूप से तीव्र नहीं है ध्यान दें।

चित्र 1
चित्रा 1: (क) मेजबान गुणसूत्र डीएनए में transposons एकीकृत करने के लिए स्लीपिंग ब्यूटी transposase द्वारा इस्तेमाल के लिए एक दाता transposon प्लाज्मिड उल्टे दोहराता / प्रत्यक्ष दोहराता द्वारा flanked ब्याज की जीन के साथ दिखाया गया है "कट और पेस्ट" तंत्र illustrating योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (आईआर / डॉ; लाल तीर बक्से) दृश्यों। एसबी transposase (हरा) transposon Excises, आईआर / डॉ को बांधता है और मेजबान गुणसूत्र डीएनए पर यादृच्छिक टीए डाईन्यूक्लियोटाइड आधार जोड़े के बीच में यह reintegrates। क्लोनिंग (बी) उदाहरणएक एस.बी. वेक्टर (PKT-IRES-Katushka) की रीढ़ की हड्डी में ब्याज की एक जीन (mPDGFβ)। एसबी वेक्टर दो आईआर / डॉ दोहराने दृश्यों (लाल) और प्रमोटर और बढ़ाने दृश्यों, एक कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस, नीला) भी शामिल है जो एक जीन की अभिव्यक्ति कैसेट होता है, आंतरिक राइबोसोमल प्रविष्टि साइटों (IRES), एक फ्लोरोसेंट संवाददाता मार्कर (Katushka: पीला), और एक polyadenilation साइट (Pólya)। ब्याज की ओंकोजीन (mPDGFβ, नारंगी) एक क्लोनिंग वेक्टर pGEMT में निहित है। विशिष्ट प्रतिबंध साइटों (NcoI / SACI) द्वारा flanked ओंकोजीन, blunting एंजाइम द्वारा एंजाइमी पाचन द्वारा जारी की है, और पा रहा है। वेक्टर linearized और के रूप में अच्छी तरह से पा लिया है। अंत में, mPDGFβ ओंकोजीन नई प्लाज्मिड transposon वेक्टर उत्पन्न करने के लिए एक कुंद अंत बंधाव प्रतिक्रिया के माध्यम से दाता वेक्टर में डाला जाता है। PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka एक बड़ा संस्करण ओ देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा एफ।

चित्र 2
चित्रा 2: नवजात चूहों में इंट्रा निलय इंजेक्शन के लिए प्रयोगात्मक सेटअप और गाइड (क) माइक्रोमीटर नंबर डायल करता है के साथ एक stereotaxic फ्रेम (2) एक स्वचालित सुई लगानेवाला एक 10 μl सिरिंज (4) के साथ पकड़े फिट है। यू फ्रेम के अंदर, एक नवजात एडाप्टर फ्रेम सुरक्षित रूप से बांधा जाता है (3)। स्वचालित इंजेक्टर (1) के नियंत्रण कक्ष सिरिंज, मात्रा और प्रवाह की दर के सटीक चयन के लिए अनुमति देता है (ख) पार्श्व निलय में इंजेक्शन के लिए आवश्यक निर्देशांक पर डाला एक सुई के साथ एक नवजात माउस (P1) की तस्वीर:। 1.5 मिमी उदर और लैम्ब्डा 0.8 मिमी पार्श्व। सापेक्ष आयामों और निलय की स्थिति पर प्रकाश डाला एक नवजात माउस (P1) के मस्तिष्क के माध्यम से एक राज्याभिषेक खंड (ग) चित्रण।


चित्रा 3: स्लीपिंग ब्यूटी transposon प्रणाली के साथ प्रेरित ट्यूमर NRAS, SV40 LGT एन्कोडिंग plasmids के साथ intraventricular इंजेक्शन के बाद एक नवजात पिल्ला 24 घंटा के मानव जीबीएम (क) Bioluminescence छवि के histological पहचान दिखाने के लिए एक वयस्क जानवर की (ख) Bioluminescence छवि (। 50 shp53 NRAS और PDGF साथ प्रेरित एक बड़े ट्यूमर के साथ डीपीआई)। (ग) Hematoxilin और NRAS और LGT (28 डीपीआई) के साथ प्रेरित एक ट्यूमर के साथ एक मरणासन्न माउस की एक मस्तिष्क से एक राज्याभिषेक अनुभाग के eosin दाग। (घ) राज्याभिषेक अनुभाग एक ट्यूमर के साथ एक मरणासन्न माउस की एक मस्तिष्क से shp53 NRAS और PDGF। (ई) Pseudopalisading गल जाना, डी नोवो उत्पन्न ट्यूमर में मनाया जाता है मानव जीबीएम के histological बानगी साथ लाती है। (परिगलन (एन) के मध्य क्षेत्र से दूर पलायन Palisades में व्यवस्था की कोशिकाओं को अंक तीर (च) औरडी नोवो G) उत्पन्न ट्यूमर सामान्य मस्तिष्क पैरेन्काइमा में रक्त वाहिकाओं (G) और फैलाना (च) के साथ आक्रमण दिखा, अत्यधिक आक्रामक रहे हैं। (ज) मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (तीर), pseudopalisading नेक्रोसिस के एक क्षेत्र के प्रारंभिक चरण के बड़े पैमाने पर आक्रमण के साथ रक्तस्राव के क्षेत्र। (मैं) टपकाया अन्तःचूचुक (तीर) के साथ बड़े glomeruloid पोत NRAS साथ प्रेरित एक ट्यूमर के अंदर diffusing नकसीर के मूल में और SV40 -LgT। (जे) एक ट्यूमर कोशिकाओं में असामान्य पिंजरे का बँटवारा (नोक)। (कश्मीर) से अधिक बड़े नाभिक (नोक) के साथ विशाल ट्यूमर सेल।

चित्रा 4
चित्रा 4: ट्यूमर असर जानवरों रोग प्रगति की अवधि के दौरान bioluminescence के साथ नजर रखी जा सकती है। जानवरों की औसत उत्तरजीविता के संयोजन ने भविष्यवाणी की हैoncogenic डीएनए इंजेक्शन। 7 C57 / BL6 चूहों की एक पलटन से bioluminescent निशान (क) उदाहरण। Bioluminescence 10 8 फोटॉनों पर पहुँचने के बाद चूहों में एक सप्ताह के बारे में आगे झुकने दें कि / एस / 2 सेमी / एस आर। (ख) विभिन्न प्लाज्मिड संयोजन के साथ उत्पन्न सौंदर्य ट्यूमर सोने के साथ जानवरों की औसत अस्तित्व की तुलना नमूना अस्तित्व घटता। NRAS और SV40 LGT साथ प्रेरित ट्यूमर के माध्य अस्तित्व जबकि shp53 NRAS और PDGF या shp53 और NRAS साथ प्रेरित ट्यूमर के साथ जानवरों के 30 डीपीआई है क्रमशः 62.5 डीपीआई या 83 डीपीआई है। डीपीआई: दिन के बाद इंजेक्शन।

चित्रा 5
चित्रा 5: नवजात स्थूल जीबीएम (22 डीपीआई) shp53 और NRAS साथ प्रेरित + GFP ट्यूमर कोशिकाओं (confocal micrographs) में nestin और GFAP की अभिव्यक्ति को दिखाने के पैनल (क) GFP व्यक्त एक नवजात ट्यूमर से पता चलता है।। पैनल (ख) nestin अभिव्यक्ति दिखा ही क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल (एक) और nestin और GFP के सह स्थानीयकरण illustrating (ख)। (घ) ट्यूमर कोशिकाओं में GFP अभिव्यक्ति। कुछ ट्यूमर कोशिकाओं में और नवजात ट्यूमर कोशिकाओं के आसपास में (ई) GFAP अभिव्यक्ति। (च) (डी) के ओवरले प्रक्षेपण और (ई) कुछ ट्यूमर कोशिकाओं (सफेद) के सह व्यक्त GFAP illustrating और GFP। (क) और (घ) में स्केल सलाखों 75 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 6
चित्रा 6: जीबीएम GFP और ट्यूमर के आसपास के परिपक्व glial मार्कर GFAP के लिए ट्यूमर कोशिकाओं में nestin अभिव्यक्ति और प्रचुर मात्रा में धुंधला दिखा एक मरणासन्न जानवर (56 डीपीआई) से shp53, NRAS और PDGF साथ प्रेरित पैनल (क) acoronal खंड के Nissl दाग का प्रतिनिधित्व करता है। एक ट्यूमर के साथ एक मरणासन्न जानवर के मस्तिष्क के माध्यम से (तीव्र नीले रंग धुंधला चshp53, PDGFΒ और NRAS का उपयोग कर स्लीपिंग ब्यूटी transposon प्रणाली के साथ प्रेरित ROM वृद्धि हुई cellularity)। पैनल (ख), पैनल में सचित्र एक करने के लिए एक राज्याभिषेक आसन्न खंड (क) ट्यूमर कोशिकाओं में GFP की अभिव्यक्ति दिखा, परमाणु दाग DAPI के साथ दाग। पैनल (ग) DAPI के साथ उच्च परमाणु घनत्व द्वारा की पहचान ट्यूमर में GFP अभिव्यक्ति दिखा ट्यूमर सीमा के एक confocal माइक्रोग्राफ, का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल (डी) ट्यूमर से सटे कोशिकाओं में तीव्र GFAP अभिव्यक्ति दिखा रहा है, (क) के रूप में देखने का एक ही क्षेत्र दिखाता है। पैनल (ई) के पैनल के ओवरले (ग) और (घ) का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल (च) ट्यूमर कोशिकाओं में GFP अभिव्यक्ति दिखा, ट्यूमर सीमा के एक confocal माइक्रोग्राफ है। पैनल (G) ट्यूमर कोशिकाओं में nestin की अभिव्यक्ति दिखा रहा है, (च) के रूप में देखने का एक ही क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल (ज) ओवरले पैनल के प्रक्षेपण (च) और (छ) है

चित्रा 7
चित्रा 7:। Neurospheres संस्कृति में 5 दिनों के बाद shp53, PDGF और NRAS साथ प्रेरित एक स्लीपिंग ब्यूटी ट्यूमर से पारित होने 2. कोशिकाओं shp53 PDGF प्लाज्मिड (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) पर इनकोडिंग GFP व्यक्त कर रहे पैनल (एक) है एक neurosphere की एक brightfield माइक्रोग्राफ। पैनल (ख) (क) neurosphere कोशिकाओं में GFP की अभिव्यक्ति दिखा के रूप में ही देखने का एक महामारी फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल (ग) पैनल के ओवरले का प्रतिनिधित्व करता है (क) और (ख)।

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Discussion

इस अनुच्छेद में, हम विस्तार से नवजात चूहों के subventricular क्षेत्र के आसपास के कोशिकाओं में oncogenic प्लास्मिड डीएनए की एस.बी. transposase- मध्यस्थता एकीकरण का उपयोग कर जीबीएम के नए मॉडल के उत्पादन के लिए एक बहुमुखी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि। हम ब्याज के नए जीन के साथ transposon प्लास्मिड उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, जीवित पशुओं में ट्यूमर की प्रगति की निगरानी करने के लिए कैसे, और इन ट्यूमर के histo के रोग और इम्युनो-histochemical सुविधाओं चिह्नित करने के लिए वर्णन कैसे।

हमारी प्रयोगशाला के रूप में (चित्रा 3) और अन्य 13 से पता चला है, इस मॉडल को मज़बूती से (1) छद्म palisading गल जाना, (2) संवहनी प्रसार, (3) परमाणु atypia, (4) असामान्य mitoses और सहित मानव जीबीएम की मुख्य विशेषताओं के साथ ट्यूमर (बनाता है 5) परिवाहकीय और फैलाना आक्रमण। नवजात चूहों के उपयोग के न्यूनतम उपकरणों और एसई के साथ एक अपेक्षाकृत आसान तकनीकी प्रक्रिया को उपलब्ध कराने, एक सैन्य दृष्टि से इष्टतम हैविशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन के साथ ट्यूमर के बड़े नमूना आकार के तेजी से पीढ़ी के लिए अनुमति / वसूली समय फाउंडेशन,। ये ट्यूमर जानवरों प्रेरित आनुवंशिक परिवर्तन पर निर्भर एक उम्मीद के मुताबिक मंझला अस्तित्व के साथ ट्यूमर बोझ को परास्त करने के लिए कारण। अंत में, एस.बी. मॉडल उपचार प्रतिक्रिया 24 के लिए एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया गया है।

नवजात इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया समाधान की तैयारी पर विचार जब कई महत्वपूर्ण कारक हैं। डीएनए समाधान, अन्तर्जीवविष मुक्त और केंद्रित (2-7 माइक्रोग्राम प्रति / μl) इंजेक्शन की न्यूनतम मात्रा के लिए अनुमति देने के लिए बाँझ होने की जरूरत है। डीएनए (एन / पी अनुपात) में फॉस्फेट अवशेषों को polyethyleneimine (पी) में नाइट्रोजन अवशेषों का इष्टतम अनुपात यह सेल सतहों पर ऋणात्मक moieties बाध्य होगा और endocytosed किया जाएगा जो सकारात्मक आरोप लगाया कण परिसरों के गठन सुनिश्चित करता है 7. है। कोशिका द्रव्य में एक बार, आसमाटिक तांता कणों फट और encapsulat जारी करने के लिए कारण होगाएड प्लास्मिड डीएनए। इन विवो जेट-पी समाधान मिमी नाइट्रोजन के अवशेष के रूप में व्यक्त 150 के एक एकाग्रता है। एक माइक्रोग्राम प्रति डीएनए ऋणात्मक फॉस्फेट के 3 nmol, फार्मूले के साथ गणना की जा सकती आवश्यक अभिकर्मक अभिकर्मक की राशि है यह देखते हुए कि:

इन विवो जेट-पी = की μl / 150 [(g डीएनए एक्स 3) एन / पी अनुपात x]।

उदाहरण के लिए, डीएनए के 20 माइक्रोग्राम प्रति की आवश्यकता है, 7 की एक एन / पी अनुपात के साथ 0.5 माइक्रोग्राम प्रति / μl डीएनए समाधान के 40 μl तैयार करने के लिए। पी आवश्यक की मात्रा 20 * 3 * 7/150 = 2.8 μl किया जाएगा।

अप करने के लिए पाँच अलग अलग प्लास्मिड एक साथ इंजेक्शन जा सकता है। इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रयोगों भी luciferase encodes कि एक प्लाज्मिड (SBLuc) पर ट्रांस में स्लीपिंग ब्यूटी transposase उद्धार। शुरूआत में उल्लेख किया है, transposons को transposase अणुओं के अनुपात इष्टतम स्थानांतरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। परिवहन के लिए SB100x प्लाज्मिड का इष्टतम अनुपात (अनुभव से स्थापित)oson डीएनए प्लाज्मिड एक है: 4। T1 है: एक दो अलग अलग transposon प्लास्मिड, उदाहरण के लिए T1 और टी 2, SBLuc के अनुपात का उपयोग करता है अत: 2: टी 2 1 हो जाएगा 2; या एक 40 μl समाधान में 20 माइक्रोग्राम प्रति डीएनए की कुल के लिए SBLuc के चार माइक्रोग्राम प्रति टी 2 के 8 T1 की माइक्रोग्राम प्रति और 8 माइक्रोग्राम प्रति के साथ मिलाया जाएगा। T1 है: टी 2: T3 के = 1: 1.33: तीन अलग अलग transposon लिए अनुपात SBLuc हो जाएगा plasmids 1.33: 1.33 और चार transposons के लिए: 1: 1: 1: 1: 1।

यह इंजेक्शन के बाद bioluminescence 24-72 घंटा से प्लास्मिड डीएनए के तेज सत्यापित करने के लिए उपयोगी है। जानवरों के रूप में विकसित ट्यूमर एक सीमा आकार, अंधेरे में pigmented C57BL6 चूहों के लिए मोटे तौर पर 1-2 मिमी 3 तक पहुँच गया है जब तक, फर, त्वचा, खोपड़ी और मस्तिष्क की वृद्धि की ऑप्टिकल घनत्व, ट्यूमर प्रगति की निगरानी से बचाता है। सफेद या कोई फर के साथ चूहों का उपयोग करते समय उनकी खाल मुंडा, या अगर प्रकाश की बेहतर संचरण इन चूहों में संभव है।

कई सीमाएं इस मॉडल का उपयोग करते समय विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, जीनइंजेक्शन के plasmids के साथ शुरू की टिक सामग्री विभिन्न स्थानों और प्रतियों की संख्या में मेजबान जीनोम में बेतरतीब ढंग से एकीकृत किया जा सकता है। यह ट्यूमर कोशिकाओं के बीच और ट्यूमर के बीच परिवर्तनशीलता को जन्म दे सकती। दूसरा, शुरू की डीएनए डीएनए 25 मुख्यतः intronic टीए दोहराने दृश्यों में डाला जाता है, हालांकि, मेजबान जीनोमिक डीएनए कोडिंग के साथ हस्तक्षेप करने की संभावना बनी हुई है। तीसरा, intraventricular इंजेक्शन जीवन के 3-4 सप्ताह में चिकित्सकीय दिखाई और प्रतीक बन जाता है, जो युवा चूहों में जलशीर्ष की एक छोटी लेकिन लगातार दर का कारण बन सकता है। चूहों के कुछ उपभेदों दूसरों की तुलना में जलशीर्ष से ग्रस्त हैं (यानी, C57 / BL6 FVB से अधिक)। जलशीर्ष उत्प्रेरण के जोखिम को कम करने के लिए, यह सुई तेज कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए, संभव है (C57 / BL6 चूहों में कम से कम 1 μl) के रूप में छोटे रूप में एक मात्रा इंजेक्षन करने के लिए सिफारिश की है, समाधान और के साथ बढ़ रहा पिल्ले प्रदान करने के लिए कम लवणता है खोपड़ी बॉन की समय पर हड्डी बन जाना के लिए अनुमति देने के लिए, खाद्य समृद्धतों। अंत में, देर चरण ट्यूमर अक्सर bioluminescence द्वारा चूहों की निगरानी जब विचार किया जाना है, जो गल जाना, विकास। एक कम पढ़ने बड़े नेक्रोसिस के क्षेत्रों और जरूरी नहीं कि उपचार का एक परिणाम के रूप में ट्यूमर का एक संकल्प के साथ एक उन्नत ट्यूमर का संकेत हो सकता। अंत में, histological विश्लेषण ट्यूमर प्रगति का आकलन करने के लिए सोने के मानक बनी हुई है।

हाल के वर्षों में ट्यूमर पूरे जीनोम अनुक्रमण के आगमन जीबीएम में खरीदे उत्परिवर्तित जीन की भूमिका का अन्वेषण करने के लिए दरवाजा खोल दिया है। स्लीपिंग ब्यूटी मॉडल संभावित ओंकोजीन या ट्यूमर शामक मान्य करने के लिए हो सकता है। एक स्थापित एस.बी. प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी में एक उम्मीदवार ओंकोजीन के माउस सीडीएनए अनुक्रम क्लोनिंग, PDGFβ ligand के साथ इस पत्र में दिए गए उदाहरण में के रूप में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के भीतर विधान अभिव्यक्ति को बढ़ावा मिलेगा। ट्यूमर शामक की भूमिका का मूल्यांकन को प्रभावी ढंग से उम्मीदवार दृश्यों, साथ एस.बी. प्लाज्मिड की रीढ़ की हड्डी में क्लोनिंग के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है (एकvailable आरएनएआई कोडेक्स डेटाबेस 26) में, उदाहरण के लिए, दूसरी पीढ़ी के मीर शॉर्ट hairpins के मजबूत अभिव्यक्ति बनाने के लिए।

जीबीएम अनुसंधान के क्षेत्र में एक मौजूदा बहस सेल के- मूल की पहचान करने के लिए संबंधित है। यह हाल ही में चूहों में, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में नीचे विनियमन p53 और NF1 द्वारा प्रेरित ट्यूमर, oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं 27 से उत्पन्न कि दिखाया गया है। स्लीपिंग ब्यूटी transposon मॉडल का उपयोग करना, इसी तरह के अध्ययन अन्य आनुवंशिक परिवर्तन को प्राथमिकता GBMS उत्पन्न करने के लिए स्टेम कोशिकाओं / अग्रदूत कोशिकाओं के अन्य आबादी को लक्षित है कि क्या परीक्षण करने के लिए तैयार किया जा सकता है। इस तरह के अध्ययन से ज्ञान बहुत जीबीएम एटियलजि के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने और उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण के लिए अवसर प्रदान करेगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors Stoelting 51670 Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable 
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) Stoelting 53311 Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe Hamilton Model 701 This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge hypodermic needle
(1.25", 15o bevel) 		 Hamilton S/O# 197462 This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI Polyplus Transfection 201-10G Aliquot in small volumes and keep at -20 oC 
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio.com LuckK-1g Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma Aldrich HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound Electron Microscopy Sciences 62550-01 For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine Life Technologies 12634-010 For the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free  Life Technologies 17504-044 Serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x) Life Technologies 17502-048 Serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn InvivoGen ant-nr-1 Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF PEPROTECH AF-100-15 Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic PEPROTECH 100-18B Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Name Company Catalog Number Comments
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent  Thermo Scientific SV3003001 For the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749510-0590 For the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um Fisher Scientific 08-771-2 For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade Fisher Scientific C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified) Fisher Scientific 245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified) Fisher Scientific 314-631

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References

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चिकित्सा अंक 96 ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल स्लीपिंग ब्यूटी transposase subventricular क्षेत्र नवजात चूहों उपन्यास transposons जीनोमिक एकीकरण जीबीएम ऊतक विज्ञान जीबीएम neurospheres की क्लोनिंग।
नवजात चूहों के Subventricular जोन में प्लास्मिड डीएनए के transposon मध्यस्थता एकता ग्लियोब्लास्टोमा के उपन्यास मॉडल उत्पन्न करने के लिए
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Calinescu, A. A., Núñez,… More

Calinescu, A. A., Núñez, F. J., Koschmann, C., Kolb, B. L., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma. J. Vis. Exp. (96), e52443, doi:10.3791/52443 (2015).

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