Transposon medieret Integration af plasmid DNA i subventrikulære zone neonatale mus Generer Nye modeller af Glioblastoma

Introduction

Glioblastoma multiforme (GBM) er den mest almindelige (60%) primær hjernetumor hos voksne, med en median overlevelse på 15-21 måneder, når de behandles med kirurgi, strålebehandling og kemoterapi ^1. Nye behandlinger for GBM er bydende nødvendigt. Eksperimentelle behandlinger kræver afprøvning i dyremodeller, som i tilstrækkelig grad gengive de vigtigste træk ved den menneskelige sygdom. Strategier til at inducere GBM i gnavere omfatter kemisk mutagenese med alkylerende midler, germline eller somatiske genetiske ændringer, eller transplantation hjælp gliom cellelinjer ^2. De mest almindeligt anvendte modeller anvender implantation af gliomcellelinier enten orthotopisk, i hjernen eller subkutant anvendelse syngene celler i dyr med samme genotype; eller xenogene celler, mest almindeligt humane GBM cellelinjer, implanteret i immunsvækkede mus ^3. Xenotransplantater giver mange fordele for studiet af intrakranielle tumorer: bekvemmelighed reproducerbarhed, stanrdized vækstrater, dødstidspunkt og tumorlokalisering. Men disse modeller har begrænsninger på grund af den kunstige, invasive kirurgiske metode, der anvendes til implantationer og begrænset evne til præcist at gengive histologiske træk karakteristisk for human GBM (WHO grad IV): pseudo-pallisading nekrose, nukleare atypias, diffus invasion, mikro-vaskulær proliferation og dannelsen af glomeruloid karabnormaliteter ^4-7. Induktion af GBM ved at ændre genomet af somatiske celler med onkogent DNA, enten med virale vektorer ^8-12, eller med transposon-medieret integration ^13, gengiver tættere ætiologien af sygdom hos mennesker og rekapitulerer histo-patologiske træk ved human GBM.

Historisk set tumorer i CNS er klassificeret baseret på den opfattede celle oprindelse, som det blev observeret, ville være en prædiktiv faktor for overlevelse ^14. GBMS inddeles i primære og sekundære. Nye beviser today peger på den meget heterogene karakter af primær glioblastom ^15. Sekundær GBM (15%), resultatet af malign transformation af lav kvalitet astrocytomer (WHO grad I) og anaplasic astrocytomer (WHO grad II), er forbundet med tidligere udbrud af sygdommen, bedre prognose og en "proneural" mønster af genekspression , mens primær GBM (85%) viser en sen debut, dårlig prognose og glia (klassisk), neurale eller mesenkymale ekspressionsmønstre. Hvorvidt disse mønstre af genekspression korrelerer med faktiske celle oprindelse af tumoren stadig undersøges aktivt. Akkumulerende data viser, at kombinationen af ​​genetiske mutationer forbundet med GBMS er prædiktiv for overlevelse. For eksempel er tab af heterozygocity (LOH) kromosomer 1p / 19q, IDH1 mutationer, PDGFRα amplifikationer, der er forbundet med sekundære GBMS, proneural udtryk mønster og en bedre prognose, hvorimod EGFR overekspression, Notch og Sonic pindsvineoverføringsvejen aktivering, Nf1 og PTEN tab og mutationer af p53 er korreleret med neural, klassisk eller mesenchymal primære GBM og dårligere prognose ^16,17. Fremkomsten af ​​store sekventering projekter og ophobningen af ​​mange patientprøver rådighed til test bringer et væld af nye oplysninger i forhold til genetiske mutationer og veje impliceret i GBM patogenese og progression og muligheden for individualiseret medicin, hvor behandlinger kan skræddersyet til genetiske abnormiteter i patienten. I sidste ende, at vurdere den prædiktive værdi af disse mutationer og veje på en systematisk måde, og for at teste mulige behandlinger i hvert enkelt tilfælde, kræver dyremodeller af GBM med forudbestemte genetiske ændringer. Transposon medieret integration af genomisk DNA tilbyder en mulig fremgangsmåde.

The Sleeping Beauty transposon-system, medlem af TC1 / mariner klasse af transposoner, var "vækkes" (konstrueret) i en multi-trins process af stedspecifik mutagenese fra en laksefisk transposase gen, som blev sovende mere end 10 millioner år siden ^18,19. I det væsentlige, DNA transposoner flankeret af specifikke sekvenser (omvendte gentagelser / direkte gentagelser: IR / DR) kan integreres i genomet i en "cut and paste" måde ved hjælp af aktiviteten af ​​Tornerose transposasen. Transposasen genkender enderne af IR sites, exciserer transposon og integrerer det tilfældigt ind i et andet DNA-sted mellem baserne T og A, baser, der duplikeres ved hver ende af transposonet under gennemførelse (figur 1a). The Sleeping Beauty transposase består af tre domæner, et transposon bindende domæne, en kernelokaliseringssekvens og et katalytisk domæne. Fire transposasesekvenser molekyler er forpligtet til at bringe de to ender af transposonet sammen og give mulighed for gennemførelse, men hvis alt for mange molekyler af transposase er til stede, kan de dimerisere og tetramerisere at hæmmeomlejringsreaktionen ^20. En effektiv gennemførelse reaktion kræver et optimalt forhold af transposase til transposoner. DNA'et, der koder for transposasen kan leveres på det samme plasmid med transposon (i cis) eller på et andet plasmid (i trans). For at sikre optimale forhold mellem transposasen og transposoner, kan vælges en promotor med passende aktivitet til ekspression af transposasen (til "cis" model) eller forholdet mellem plasmiderne i injektionsvæsken kan optimeres (for "trans" model). The Sleeping Beauty transposon kan anvendes med succes til funktionel genomforskning, insertionsmutagenese, gensplejsning og somatisk genterapi ^21. At være en syntetisk konstruktion omlagte til en funktionel molekyle fra en sovende laksefisk variant, er den sovende skønhed transposase ikke binde sig til andre transposoner i mennesker eller andre pattedyr ^20. Siden opdagelsen, molekylær teknik har lydudstyred gennemførelsen effekten af ​​SB transposon systemet gennem ændringer i IR-sekvenser og tilsætning af TATA dinucleotider flankerer transposonet, hvilket resulterer i PT2 transposoner. Disse transposoner har optimeret binding af SB til IR stedet og øget effektivitet af excision. SB transposase undergik også signifikant forbedring; transposasen anvendt i eksperimenter præsenteret heri er SB100X, en hyperaktiv transposase frembragt af en DNA-shuffling strategi efterfulgt af et stort genetisk skærm i pattedyrceller ^22.

I denne rapport præsenterer vi en hurtig, alsidig og reproducerbar metode til at inducere iboende GBM i mus med non-viral, transposon-medieret integration af plasmid DNA i celler i sub-ventrikulær zone af neonatale mus ^23. Vi præsenterer en enkel måde at skabe transposoner med nye gener, som kan underkastes for genomisk integration ved hjælp af Tornerose transposasen og vise hvordan man kan overvåge plasmid optagelse ogsygdomsprogression ved anvendelse af bioluminescens. Vi karakteriserer også histologiske og immunhistokemisk funktioner af GBM gengivet med denne model. Derudover præsenterer vi en hurtig metode til at generere primære GBM cellelinier fra disse tumorer. The Sleeping Beauty model, hvor tumorer induceres af celler original til dyret, tillader funktionel vurdering af den rolle, kandidat GBM gener i induktion og progression af tumorer. Dette system er også velegnet til afprøvning af nye GBM behandlinger, herunder immunterapier i immunkompetente mus, uden behov for invasive inflammatoriske kirurgiske procedurer, hvilket kan ændre den lokale mikromiljø.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyr protokoller er blevet godkendt af University of Michigan udvalg for brug og pleje af dyr (UCUCA).

1. Kloning af sekvensen af ​​interesse i nye Sleeping Beauty Transposoner

BEMÆRK: Hvis du vil indsætte gener eller hæmmende elementer (som shRNA) ved hjælp af Tornerose transposasen system klone sekvensen af ​​interesse i rygraden i en pKT eller pT2 plasmid. Direkte kloning således, at de regulatoriske elementer, forbliver genet af interesse og markører flankeret af omvendte gentagelser (IR / DR). Et eksempel på kloning PDGFβ i en pKT rygrad er beskrevet nedenfor (se også figur 1b).

1. Digest 5 ug plasmidvektor pKT-IRES-Katushka i 4 timer ved 37 ° C med 5-10 enheder Xbal / Xhol restriktionsenzymer i 50 pi reaktionsvolumen.
2. Fordøje mPDGFβ cDNA af 5 ug pGEM-T- mPDGFβ plasmid til 4 timer ved 37 ° C med 5-10 enheders af Ncol / Sacl-restriktionsenzymer.
3. Præcipiter det totale DNA ved tilsætning af 2,5 volumener 100% ethanol og 1/10 volumen 3 M Na-acetat, pH 5,8 og inkuberes natten over ved -20 ° C.
4. Centrifugeres prøverne ved 13.800 xg i 15 min.
5. Vask DNA pellet med 500 pi 70% ethanol, centrifugeres ved 13.800 xg i 1 min, gentages en gang og re-suspendere 19 pi sterilt DNase frit vand.
6. Følg producentens anvisninger i Hurtig Blunting Kit til stumpe ender både vektor (pKT-IRES-Katushka) og indsæt (mPDGFβ).
7. Læg stumpe vektor og indsætte på en 1,2% ethidiumbromidfarvet agarosegel og kørt ved 80 V i 40 min. Pletterne af bands, udskære dem med et rent barberblad og gel oprense DNA under anvendelse af en gel rensning kit ifølge producentens protokol.
8. Ligere indsatsen og vektor-DNA oprenset i trin 1.7 ved at tilføje dem i et rør på en 4: 1 molforholdet (indsæt: vektor). Ind i dette rør, pipette 1 pi T4 ligase og 2 pi T4 ligasepuffer (indeholdende ATP), og justere lydstyrken til 20 pi med sterilt vand. Inkubér ligeringsreaktionen i 18 timer ved 16 ° C.
9. Transform kemisk kompetente DH5a bakterieceller med de ligerede produkter.
   1. Optø de kompetente celler på is.
   2. Tilsæt hele mængden af ​​ligeringsreaktionen til 50 pi kompetente celler, ryst forsigtigt røret og inkuber blandingen på is i 30 minutter. Varmechok-bakterierne i 45 sekunder ved 42 ° C og vende tilbage straks til is; inkuber på is i yderligere 2 minutter.
   3. Tilføj 950 pi Luria Broth til kulturen og inkuberes med omrystning ved 37 ° C i 1 time. Centrifuger bakterier ved 2.400 xg i 3 min og re-suspendere pellet i 200 gi LB.
   4. Spred transformerede bakterier på en petriskål coatet med LB-agarose, og det tilsvarende antibiotikum. Inkubér pladen natten over ved 37 ° C.
   5. Endelig samle 5-10 bacterial kolonier og kultur natten over ved 37 ° C i 5 ml LB-medium med antibiotikum.
   6. Renses plasmid-DNA under anvendelse af et plasmid DNA mini kit ifølge producentens anvisninger. Udfør en diagnostisk restriktionsspaltning at kontrollere den korrekte inkorporering af insertet i vektoren og indgive positive kloner til DNA-sekventering for at sikre den rigtige orientering af insertet.
10. Vælg de korrekte kolonier og opskalere DNA produktion ved hjælp af en høj kvalitet, endotoksinfrit plasmidpræparat kit.
11. Elueres DNA i sterilt vand eller 1 mM Tris-HCI. Opbevar DNA ved -20 ° C indtil den er klar til at injicere i nyfødte.

2. Intra-ventrikulære neonatale Indsprøjtninger

1. Tre til fire uger før eksperimentere, oprette en mus avl bur med en mandlig og en kvindelig mus, og en plastik farvet iglo. Dette giver en beriget miljø og aids parring proces.
2. Når graviditet er bekræftet, skal du fjerne male til et nyt bur. Atten dage efter parring, overvåge bur dagligt for levering. Udfør intraventrikulære injektioner på postnatal dag 1 (P1).
3. Fremstilling af injektionsopløsning
   BEMÆRK: injektionsopløsning fremstilles ved at blande plasmid-DNA'et med transfektionsreagens at skabe partikler til transfektion. Nedenfor er et eksempel på fremstilling af en injektion løsning med en plasmid, der koder for Tornerose transposasen og luciferase: pT2 / SB100x-Luc og to transposonsekvenser plasmider: Pt / CAGGS-NRASV12 og Pt / CMV-SV40-LGT, i et forhold på 1: 2: 2. Alle plasmider har en koncentration på 2 pg / pl. Vigtige detaljer om forberedelsen af ​​injektionsopløsningen præsenteres i diskussionen.
   1. Forbered DNA ved tilsætning af: 4 pg (2 pi) i pT2 / SB100x-Luc, 8 ug (4 pi) af Pt / CAGGS-NRASV12 og 8 ug (4 pi) af Pt / CMV-SV40-LGT og 10 pi 10% glucose til et endeligt volumen på 20 pi ved en koncentration på 1 ug / mlDNA og 5% glucose.
   2. Forbered PEI opløsning ved tilsætning af 2,8 pi in vivo jet PEI, 7,2 pi sterilt vand, og 10 pi 10% glucose til en endelig koncentration på 5% glucose.
   3. Tilsæt PEI løsning på DNA-opløsning, bland og vortex, og lad sidde ved stuetemperatur (RT) i 20 min. Løsningen er nu klar til injektion. Efter en time ved stuetemperatur, opløsningen opbevares på is.
   4. Monter en 10 ul ren sprøjte med en 30 gauge kanyle med 12,5 ° smig til Mikropumpe (Figur 2 # 1).
4. For at bekræfte velfungerende indsprøjtningssystem, skal du bruge den automatiske injektor (Figur 2 # 1) at trække 10 pi vand i sprøjten og derefter tømme sprøjten helt
5. Afkøl neonatal stereotaktisk trin (figur 2 # 3) med en opslæmning af tøris og alkohol til en temperatur på 2-8 ° C.
6. Fremkald anæstesi ved at placere hvalpene på våd isfor 2 min. Anæstesi vil fortsætte på den kølede stereotaktisk ramme for den resterende del af proceduren. Opretholdelse af temperaturen af ​​rammen over frysepunktet mellem 2-8 ° C vil forhindre termiske forbrændinger. Som særlige forholdsregler hvalpe kan pakkes ind i gaze, før anbringelse på våd is.
7. Fyld sprøjten med DNA / PEI-opløsning.
8. Immobilisere hvalpen i stereotaktisk ramme ved at placere sit hoved mellem gaze dækket øre stænger (figur 2B). Kontroller, at den dorsale side af kraniet er vandret, parallelt med overfladen af ​​rammen, og at kranielle suturer er klart synlige. Tør hovedet med 70% ethanol.
9. Sænk nålen af sprøjten og justere stereotaksiske koordinater ved hjælp ringer af stereotaktisk ramme indtil nålen rører lambda (midterlinjen skæringspunktet mellem parietal og occipital knogler) (2b figur).
10. Løft nålen og justere stereotaksiske koordinater til 0,8 mm lateralt og 1,5 mm rostralt for lambda (figur 2b).
11. Sænk nålen, indtil det rører og lidt smilehuller huden. Mål koordinaterne. Sænk nålen yderligere 1,5 mm. Nålen vil gennembore huden og kraniet, og passere gennem cortex at indtaste den laterale ventrikel (figur 2c).
12. Brug af den automatiske injektor, injicere 0,75 pi af DNA / PEI-opløsning ved en hastighed på 0,5 ul / min
13. Hold pup på rammen for et minut for at tillade opløsningen at dispergere ind i hjertekamrene. I mellemtiden bedøver anden pup, på is i 2 min i forberedelse til den næste injektion.
14. Forsigtigt og langsomt løfte nålen og placere hvalpen under en varmelampe. Overvåg vejrtrækning og aktivitet. Hvis det er nødvendigt, giver blid stimulation af lemmerne, indtil første vejrtrækning ensues.
15. Retur hvalpen til sin mor, efter at den er varmet op, har nået et rosenrødt farve, trækker vejret regelmæssigt og er aktiv, normalt 5-7 min. Hvis more end én pup injiceres på et tidspunkt, holde alle hvalpe sammen, indtil alle injektioner er færdig. Hvis injektioner tager længere tid end 30 minutter, returnere halvdelen af ​​hvalpene efter de første 30 min og resten ved afslutningen af ​​proceduren.
16. Overvågning af, at dæmningen er lydhør og pleje til hendes hvalpe. Om nødvendigt tilsættes et surrogat mor til buret.
17. Sørg for, at intervallet mellem placere hvalpen på is og placere den under opvarmning lampen er mindre end 10 min. Jo hurtigere procedure bedre overlevelse. Normalt den tid det tager at bedøve og indsprøjte en hvalp er 4 min.

3. Bioluminescens Overvågning af tumordannelse og progression

3.1) Overvågning Plasmid Optagelse Efter injektion

1. 24-72 timer efter injektion, fjerne alle hvalpe fra moderens bur og sted i en 6 godt ren vævskulturskål, en hvalp per brønd.
2. Forbered en ml opløsning 30 mg / af luciferin opløst i normalt saltvand eller Phosphate buffer. Denne opløsning fremstilles i forvejen og opbevares i små alikvoter ved -20 ° C.
3. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 30 gauge kanyle injiceres 30 pi luciferin subkutant mellem skulderbladene af hvalpen. Sørg for, at nålen ikke stikke nogen organer, ved at klemme huden og løfte det lidt, inden du sætter nålen.
4. Billede straks ved anvendelse af en in vivo bioluminescens imaging system. For IVIS Spectrum Brug følgende indstillinger til opkøb: automatisk eksponering, store binning, og blænde f = 1.

3.2) Overvågning tumordannelse og progression

BEMÆRK: Dyr vil begynde at danne makroskopiske tumorer kan påvises ved bioluminescens og histologi inden 2½-6 uger afhængigt af den onkogene plasmider injiceres.

1. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte udstyret med en 26 gauge nål injiceres 100 pi af en 30 mg / ml luciferin opløsning intraperitonealt.
2. Placer dyret i anæstesi kammer. Injicer op til fem dyr på samme tid.
3. Vent 5 min start derefter ilt / isofluran flow (1,5-2,5% isofluran) for at bedøve dyrene. Efter 3-4 min, fjerne dyrene fra anæstesi kammer, starte ilt / isofluran flow i bioluminescens kammer. Placer dyr i de respektive slidser udstyret med glas Spidskegler at muliggøre anæstesi og uhindret passage af lys.
4. Typisk erhverve en serie på 6 billeder på 2 min intervaller med en automatisk eksponeringstid, median binning og en åben blænde på f = 1.
5. Indstil region af interesse for alle dyr afbildes, typisk en oval over hovedet regionen og måle luminescens intensitet ved hjælp af kalibrerede enheder fotoner / s / ^cm2 / sr.
6. Optag den maksimale værdi for hvert dyr. Efterfølgende kan optagelser sammenlignes under progression af tumoren for hvert dyr og / eller mellem dyr, for eksempel when forskellige behandlinger er beskæftiget.

4. histologiske og immunhistokemisk analyse af New GBMS

BEMÆRK: Når tumorerne har nået den ønskede eksperimentel tid-punkt, kan dyrene aflives, hjerner perfusionerede, faste og analyseres. For at overleve analyserer døende fase repræsenterer slutpunktet af forsøget, hvor dyrene humant aflivet på de første tegn på tumor byrde, som defineret af den kliniske fase, hvor dyret bliver symptomatisk viser funktionshæmmede, krum stilling og scruffy pels. En kort beskrivelse af faste histologiske og immunhistokemisk metoder er præsenteret nedenfor.

4.1) Perfusion og fiksering

1. Bedøver musen med en intra-peritoneal injektion af 100 mg / kg af ketamin og 10 mg / kg xylazin.
2. Kontroller pedal refleks ved at klemme foden af ​​musen. Når denne refleks afskaffes angiver dyb anæstesi, IMMOBilize musen på en dissektion bord med ben, åbne bughulen, dissekere mellemgulvet og åbn brysthulen at visualisere hjertet.
3. Indsæt en stump 20 gauge kanyle i den venstre ventrikel i hjertet. Slut kanylen med plastrør passerer gennem en peristaltisk pumpe til en beholder med iltet og hepariniseret Tyrode opløsning (0,8% NaCl, 0,0264% _CaCl2 2H ₂ O, 0,005% NaH ₂ PO _4, 0,1% glucose, 0,1% _NaHCO3, 0,02 % KCl). Start strømmen af ​​Tyrode opløsning ved at justere hastigheden af ​​den peristaltiske pumpe for at sikre en langsom og konstant flow, ca. en dråbe per sekund eller mindre, hvis dyrene er mindre.
4. Lav et lille snit i højre atrium af hjertet til at tillade afløb af blod og Tyrodes.
5. Overvåg perfusion effektivitet ved at observere blanchering af indre organer (mest oplagte i lever og nyrer), da de blevet uden blod.
6. Nåropløsning afdrypning fra hjertet er klart (3-5 min), skifte løsninger fra Tyrodes til 4% paraformaldehyd til fiksering (4% PFA, pH 7,34 i phosphatbufret saltvand).
7. Overvåg god fiksering af væv af den øgede stivhed i nakke og hale.
8. Halshugge musen og omhyggeligt dissekere hjernen fra kraniet.
   1. Træk pelsen som dækker kraniet rostrally, mod næsen, og få fat i det fast at stabilisere hovedet, dorsale side op.
   2. Ved hjælp af en skarp skalpel, skæres ned langs kanten af ​​rummet, at transektere de orbitale muskler og de underliggende kindbensbuerne.
   3. Drej hovedet ventrale side op og fjern vedhæftede nakkemuskler ved hjælp af en rongeur. Knus den første ryghvirvel og fjerne den fra hjernestammen.
   4. Visualiser cochlea, tag fat i overliggende tindingebenet med rongeur og skabe en åbning mellem den tidsmæssige og nakkeknude. Skrælle nakkebenet fra overfladen af ​​lillehjernen.
   5. Dreje hovedet ventrale side op. Hjernen vil glide ned fra den resterende del af kraniet, som er forbundet nu udelukkende gennem de kraniale nerver. Brug af en lille saks klippe olfaktoriske, optik og trigeminus nerver. Dette vil frigøre hjernen.
9. Placer hjerne i 4% PFA natten over ved 4 ° C for post-fiksering.
10. For histologisk analyse og hematoxylin-eosin farvning, overføre hjerner til fosfatbuffer i 24 timer og derefter gå videre til paraffinindlejring.
11. For immuno-histologisk analyse overføre hjerner i en 30% saccharose-opløsning i phosphatbufret saltvand i 24-48 timer (indtil hjerner synke til bunden af ​​røret)
12. Afsnit hjerner i halve gennem midten af ​​tumor-regionen, Den overskårneside ned i en indefrysning støbeform, indlejre i cryo-indlejring medier (OCT-forbindelse), og flash-freeze i en opslæmning af tøris ethanol, tøris isopentan eller i flydende nitrogen. Hold frosne blokke ved -80 ° C indtil sektionering og farvning.

4.2) Hematoxylin-eosinfarvning af paraffin Embedded Brains for Histo-patologisk analyse af Intrinsic GBMS

1. Afsnit paraffin indlejret hjerner ved 4 pm tykkelse, falde i et 42 ° C vandbad og montere på objektglas.
2. De-paraffinize slides ved at placere dem i 10 minutter i en 60 ° C ovn og derefter overføre dem ved 5 minutters intervaller gennem en serie af tre slide beholdere fyldt med xylen.
3. Hydrere slides gennem en række ethanol bade: 100% ethanol i 2 minutter, gentag én gang, 95% ethanol i 2 min, gentages en gang, 70% ethanol i 2 min og derefter overføre slides til vand.
4. Farv dias ved at dyppe dem i et dias container fyldt med Harris Hematoxylin i 2 min.
5. Skyl i ledningsvand indtil vandet er klart.
6. Dip glider to gange i blånelse opløsning (0,1% Natriumcarbonat).
7. Lad objektglassene stå i ledningsvand i 2 min, derefter overføre til 80% ethanol i 2 min.
8. Farv objektglassene ved at dyppe dem i en beholder fyldt med Eosin for 5 min.
9. Dehydrer slides i en serie af ethanol bade (80% ethanol 3-4 dips, 95% ethanol 2 minutter, gentag gang, 100% ethanol 2 minutter, gentages en gang).
10. Klar med 3 på hinanden følgende bade xylen, 3 min hver.
11. Dækglasset med en xylen-baserede montering medium og lad tørre på en flad overflade ved stuetemperatur indtil den er klar til billeddannelse. Opbevares ved stuetemperatur.

4.3) Immuno-histokemi af Cryo bevarede Indlejrede Brains for Molecular and Cellular karakterisering af De Novo induceret GBMS

1. Hent frosne blokke fra -80 ° C opbevaring, anbringes i kryostat og tillade temperaturen at ækvilibrere i 30 min.
2. § 12-14 Um tyk sektioner og montere 2-3 sektioner onto positivt ladede objektglas. Skær sektioner serielt, ved at samle tilstødende sektioner på forskellige lysbilleder. Dette tillader farvning med forskellige antistoffer på tilstødende vævssnit i tumoren.
3. Tørre glider i en ekssikkator i mindst 1 time efter sektionering at muliggøre god vedhæftning af vævet.
4. Opret en hydrofob barriere (med en hydrofob markør) ved hver ende af glideren for at tillade væske at dække dele, og at bo på objektglasset under vaskene. Dæk sektioner med en opløsning af phosphatpufret saltvand med 0,1% Triton-X (PBS 0,1% TX) og ryst forsigtigt i 5 minutter på en horisontal omryster at permeabilisere vævet. Gentag to gange.
5. Bloker specifik binding med en opløsning af 10% normalt gedeserum (eller serum fra dyr, i hvilket det sekundære antistof blev rejst) i 30 minutter med forsigtig rystning
6. Forbered primære antistof opløsning i 2% normalt gedeserum i PBS 0,1%Tx og afpipetteres løsningen i løbet af afsnittene. Glassene anbringes i en overdækket fugtigt kammer i mørke og holde ved stuetemperatur natten over.
7. Den næste dag vaskes sektioner tre gange i 5 minutter med PBS 0,1% Tx og inkuberes i fluorescerende sekundære antistof fortyndet i 2% normalt gedeserum PBS 0,1% Tx i en time.
8. Vask sektioner tre gange i 5 minutter med PBS 0,1% Tx, kontrastfarve med en nuklear farvning (f.eks DAPI) i 2 minutter, vaskes en gang mere, klart i vand og dækglas med en vandbaseret montering medium, der vil bevare fluorescens. Placer slides på en flad overflade, og lad dem hærde i mindst 24 timer, i mørke, indtil den er klar til billeddannelse. Hold ved 4 ° C derefter.

5. generation af primær tumor cellelinier med specifikke genetiske ændringer.

1. For at generere cellelinjer fra Tornerose tumorbærende mus vælge en mus med bekræftet stor tumor (bioluminescens 10 ⁷ -10 ⁸ fotoner / s / cm2 / SR).
2. Aflive mus med en overdosis af isofluran bedøvelse, halshugge dyret og omhyggeligt dissekere hjernen fra kraniet (som beskrevet i afsnit 4). Placer hjernen i en ren petriskål.
3. Ved hjælp af et barberblad, gør koronale snit anterior og posterior til tumoren. Placeringen af ​​tumor er normalt genkendelige på grund af gennemsigtigheden i hjernen.
4. Dissekere tumor, normalt 5-7 mm i diameter med fin pincet og anbringes i et 1,5 ml rør fyldt med 300 pi neural stamcelle Media (NSC Media: DMEM / F12 med B-27 supplement, N2 supplement og Normocin suppleret med human rekombinant EGF og bFGF i en koncentration på 20 ng / ml hver).
5. Forsigtigt homogeniseres tumor med en plast støder, som passer til væggene af røret.
6. Der tilsættes 1 ml enzymfri væv dissociation opløsning og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter.
7. Pass cellesuspensionen gennem en 70 pm cellefilter vaskes si med 10 mlNSC medier, centrifugeres ved 300 xg i 4 min dekanteres supernatanten og re-suspendere pellet i 7 ml NSC medier.
8. Plade på en T25 dyrkningskolbe og kultur ved 37 ° C i en vævskultur-inkubator med og atmosfære af 95% luft og 5% _CO2. Efter 3 dage, har nogle celler døde nogle klæbet til bunden af ​​dyrkningsskålen, og nogle danner neurosfærer, frit flydende i medierne.
9. Fjern disse suspenderede celler og re-plade på en T75 vævskulturkolbe.
10. Efter yderligere tre dages dyrkning, indsamle neurosfærer, dissociere som beskrevet i trin 5.6, stamme gennem celle si og tælle celler. Frys prøver af celler i føtalt bovint serum 10% DMSO og passage-celler ved en densitet på en million celler i 14 ml NSC suppleret med EGF og FGF til T75 kolbe. Vækstraten vil afhænge af de onkogener, der anvendes til at generere tumorer. Adapt celledyrkningsbetingelser for at forhindre overvækst og opretholde cellerne ved relativt høj densitet.

Representative Results

For at karakterisere histo-patologiske træk ved SB-inducerede glioblastomer blev C57 / BL6 neonatale mus injiceret på P1 med et plasmid, der koder for luciferase (pT2 / SB100x-Luc) i kombination med plasmider, der koder transposoner med onkogent DNA, dvs NTM (Pt / CAGGS -NRASV12) og SV40 LGT (Pt / CMVSV40-LGT) (figur 3c) eller et plasmid, der koder for et kort hårnål p53 med PDGFβ og et GFP reporter (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) i kombination med NTM (figur 3d). Dyrene blev overvåget for bioluminescens dagen efter injektion (figur 2a) og regelmæssigt, indtil den når den døende tilstand, da de blev aflivet. Døende fase defineres som den kliniske fase, hvor dyret bliver symptomatisk viser forringet mobilitet, foroverbøjet kropsholdning, scruffy pels og vægttab. Nogle gange, dyr udvikler anfald eller unormale bevægelsesmønstre, som at gå i cirkler og pludselig hoppe. Ved afslutningen af ​​forsøget dyrs blev bedøvet. Hjernerne blev perfunderet, indlejret i paraffin og behandles for hematoxylin og eosin-farvning. Dataene viser tumorer udviser kendetegnende for human GBM (WHO grad IV) med blødninger (figur 3c), pseudo-pallisading nekrose (figur 3e) og perivaskulær og diffus invasion ind i hjernen parenkym (figur 3G, f). Dannelsen af pseudopallisades indledes med brud af store glomeruloid fartøjer med utæt endotel (figur 3i), som resulterer i regioner af blødning med massiv infiltration af mononukleære celler (Figur 3h). Atypiske mitose (figur 3J) og gigantiske flerkernede tumorceller (Figur 3k) også patognomonisk af human GBM.

Glioblastomas dannet ved anvendelse af Sleeping Beauty transposase system kan overvåges under hele progression af tumorvækst med bioluminescens, hvis plasmider injiceretencode luciferase. Et eksempel eksperiment er vist i figur 4a. Dyr normalt bukke under af tumorbyrde når luminescens når en intensitet på 10 ⁷ -10 ⁹ fotoner / s / ^cm2 / SR. Den gennemsnitlige overlevelse af dyr er forudsigeligt afhængig af de kombinationer af onkogene transposoner injiceret i neonatal hjerne, som illustreret i overlevelseskurverne præsenteret i figur 4b. Bemærk, at de mest aggressive tumorer induceres med de nationale tilsynsmyndigheder og SV40 LGT antigen (median overlevelse på 30 dage), mens median overlevelse dyr med GBM induceret med shp53 nationale tilsynsmyndigheder og PDGF er 62,5 dage og dyr injiceret med shp53 og de nationale tilsynsmyndigheder 83 dage.

De novo dannede tumorer kan karakteriseres immuno-histokemisk ved deres ekspression af molekyler karakteristiske for gliale tumorer. Figur 5 viser en spirende tumor (22 dpi, bioluminescens 2x10 ⁵ fotoner / s / ^cm2 / sr), induceret med shp53og de nationale tilsynsmyndigheder. Den injicerede shp53 plasmid koder for grønt fluorescerende protein (GFP) for at muliggøre identifikation af transficerede celler og deres afkom (pT2 / shp53 / GFP). GFP + tumorceller udtrykker den neurale stamcelle markør nestin og nogle GFP + -celler også udtrykker glial fibrillært surt protein (GFAP). Figur 6 illustrerer en tumor fra en døende dyr ved 56 dpi, tumor, som også blev induceret med shp53 / GFP og NTM. Talrige GFAP + astrocytter omgiver tumoren. GFP + tumorceller udtrykker nestin, men ikke GFAP.

En stor fordel ved anvendelse af denne teknik til at inducere GBMS er evnen til at generere hidtil ukendte GBM cellelinier med unikke genetiske ændringer ved hjælp af transposoner injiceres. Desuden kan brugerdefinerede cellelinier frembringes ved anvendelse af transgene dyr med specifikke genetiske makeup. Disse cellelinjer er medvirkende til at stille mange mekanistiske spørgsmål ved hjælp biokemiske analyser. De er velegnet til Cytotoksicitetsstudier med nye lmemotherapeutic midler. Figur 7 illustrerer en neurosfære fra en Sleeping Beauty tumor induceret med shp53, PDGF og NTM, viser ekspression af GFP, som er kodet på en af de injicerede plasmider. Bemærk, at udtrykket ikke er lige så intens i alle cellerne, hvilket indikerer den heterogene karakter af disse primære GBM celler.

Figur 1: (a) Skematisk repræsentation, der illustrerer den "cut and paste" mekanisme, der anvendes af Sleeping Beauty transposase at integrere transposoner i værtens kromosomale DNA En donor transposon plasmid er afbildet med genet af interesse flankeret af omvendte gentagelser / direkte gentagelser. (IR / DR, røde pil feltet) sekvenser. SB transposase (grøn) binder til IR / DR, exciserer transposon og reintegrerer det mellem tilfældige TA dinukleotid basepar på værtens kromosomale DNA. (B) Eksempel på kloninget gen af interesse (mPDGFβ) ind i rygraden i en SB-vektor (pKT-IRES-Katushka). SB vektor indeholder to IR / DR gentagelsessekvenser (rød) og en genekspressionskassette, der omfatter promotor- og enhancersekvenser, et multipelt kloningssite (MCS, blå), interne ribosomale entry sites (IRES), en fluorescerende reporter markør (Katushka: gul) og en polyadenilation sted (polyA). Onkogenet af interesse (mPDGFβ, orange) er indeholdt i en kloningsvektor pGEMT. Onkogenet, flankeret af specifikke restriktionssteder (Ncol / Sad) frigøres ved enzymatisk fordøjelse, og sløvet af afstumpningsorganet enzym. Vektoren lineariseres og stumpe samt. Endelig mPDGFβ onkogen indsat i donorvektoren ved hjælp af en stump ende ligeringsreaktion at generere nye plasmid transposon vektor:. PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka Klik her for at se en større version of denne figur.

Figur 2: forsøgsopstilling og vejledninger for inden ventrikulære injektioner i neonatale mus (a) En stereotaktisk ramme (2) med mikrometer ringer er udstyret med en automatisk injektor besiddelse af en sprøjte 10 pi (4). Inde i U rammen er en neonatal adapter ramme fastgøres (3). Kontrolpanelet for den automatiske injektor (1) giver mulighed for præcis markering af sprøjten, volumen og vandføring (b) Fotografi af en neonatal mus (P1) med en nål indsat på koordinaterne, der kræves for injektioner i den laterale ventrikel:. 1.5 mm ventralt og 0,8 mm lateralt til lambda. (c) Illustration af en koronale snit gennem hjernen i en neonatal mus (P1) fremhæve de relative dimensioner og placering af hjertekamrene.

Figur 3: inducerede tumorer med Tornerose transposon-system viser histologiske kendetegnende for human GBM (a) Bioluminescens billede af en neonatal hvalp 24 timer efter intraventrikulær injektion med plasmider kodende nationale tilsynsmyndigheder, SV40 LGT (b) Bioluminescens billede af et voksent dyr (. 50 dpi) med en stor tumor induceret med shp53 nationale tilsynsmyndigheder og PDGF. (c) Hematoxilin og eosinfarve af en koronale sektion fra en hjerne af en døende mus med en tumor induceret med de nationale tilsynsmyndigheder og LGT (28 dpi). (d) Supragingival sektion fra en hjerne af en døende mus med en tumor inducerer med shp53 nationale tilsynsmyndigheder og PDGF. (e) Pseudopalisading nekrose, histologisk kendetegnende for human GBM er observeret i de novo genererede tumorer. Pilen peger på celler arrangeret i palisader migrerer væk fra det centrale område af nekrose (N) (f) og (g) de novo genereret tumorer er stærkt invasive, viser invasion langs blodkar (g) og diffus (f) i den normale hjerne parenkym. (H) Region blødning med massiv invasion af mononukleære celler (pil), den indledende fase af et område med pseudopalisading nekrose. (I) Stor glomeruloid fartøj med utæt endotel (pil) til grund for at diffundere blødning inde i en tumor induceret med de nationale tilsynsmyndigheder og SV40 -LgT. (j) Atypisk mitose i et tumorceller (pilespids). (k) Gigantisk tumor celle med flere store kerner (pilespids).

Figur 4: Tumor-bærende dyr kan overvåges med bioluminescens under hele sygdomsprogression. Den gennemsnitlige overlevelse af dyr er forudsagt ved kombinationen afonkogent DNA injiceret. (A) Eksempel på bioluminiscerende spor fra en kohorte af 7 C57 / BL6 mus. Bemærk, at mus bukke omkring en uge efter bioluminescens når 10 ⁸ fotoner / s / cm2 / sr. (B) Prøve overlevelseskurver sammenligner median overlevelse af dyr med Tornerose tumorer genereret med forskellige plasmid kombinationer. Median overlevelse inducerede tumorer med de nationale tilsynsmyndigheder og SV40 LGT er 30 dpi hvorimod af dyr med tumorer induceret med shp53 nationale tilsynsmyndigheder og PDGF eller shp53 og de nationale tilsynsmyndigheder er 62,5 dpi eller 83 dpi hhv. DPI: dage efter injektion.

Figur 5: Nascent makroskopisk GBM (22 dpi) induceret med shp53 og NTM viser ekspression af nestin og GFAP i GFP + tumorceller (konfokale mikrografier) ​​Panel (a) viser et begyndende tumor udtrykker GFP.. Panel (B) repræsenterer det samme område viser nestin ekspression. Panel (a) og (b) illustrerer co-lokalisering af nestin og GFP. (D) GFP-ekspression i tumorceller. (E) GFAP ekspression i visse tumorceller og i celler, der omgiver den spirende tumor. (F) Overlay projektion af (d) og (e), der illustrerer nogle tumorceller (hvid) co-udtrykker GFAP og GFP. Scale barer i (a) og (d) udgør 75 um.

Figur 6: GBM induceret med shp53, de nationale tilsynsmyndigheder og PDGF fra en døende dyr (56 dpi), der viser GFP og nestin udtryk i tumorceller og rigelig farvning for den modne glia markør GFAP omgiver tumoren Panel (a) repræsenterer Nissl plet af acoronal sektion. gennem hjernen af ​​en døende dyr med en tumor (intens blåfarvning from øget cellularitet) induceret med den sovende skønhed transposon system ved hjælp shp53, PDGFΒ og de nationale tilsynsmyndigheder. Panel (b), en coronal tilstødende sektion til illustreret i panel (a) farvet med nukleare pletten DAPI, viser ekspression af GFP i tumorceller. Panel (c) repræsenterer en konfokal mikrografi af tumor grænsen viser GFP-ekspression i tumoren, identificeret ved de høje nukleare tæthed med DAPI. Panel (d) illustrerer det samme synsfelt som i (a), viser intens GFAP ekspression i celler støder op til tumoren. Panel (e) repræsenterer overlejring af panelerne (c) og (d). Panel (f) er et konfokalt mikrografi af tumor grænse, viser GFP-ekspression i tumorceller. Panel (g) repræsenterer det samme synsfelt som i (f), der viser ekspression af nestin i tumorceller. Panel (h) er overlay projektion af panelerne (f) og (g)

Figur 7:. Neurosfærer fra en Tornerose tumor induceret med shp53, PDGF og de ​​nationale tilsynsmyndigheder efter 5 dage i kultur, passage 2. Cellerne udtrykker GFP kodet på shp53 PDGF plasmid (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) Panel (a) er en brightfield mikrograf af en neurosfære. Panel (b) betegner en epi-fluorescerende mikrografi af det samme billede som i (a) viser ekspressionen af GFP i neurosfæren celler. Panel (c) repræsenterer overlejring af paneler (a) og (b).

Discussion

I denne artikel, vi detaljer en alsidig og reproducerbar metode til frembringelse af nye modeller af GBM hjælp SB transposase- medieret integration af onkogent plasmid-DNA i celler, der omgiver den subventrikulære zone af neonatale mus. Vi præsenterer en protokol til at generere transposonsekvenser plasmider med nye gener af interesse, illustrerer hvordan man kan overvåge udviklingen af ​​tumorerne med levende dyr, og hvordan man kan karakterisere histo-patologiske og immunhistokemisk funktioner i disse tumorer.

Som vores laboratorium (Figur 3), og andre ¹³ har vist, denne model pålideligt skaber tumorer med de vigtigste karakteristika for human GBM herunder (1) pseudo-palisading nekrose, (2) vaskulær proliferation, (3) nuklear atypia (4) unormale mitose og ( 5) perivaskulær og diffus invasion. Brugen af ​​neonatale mus er optimal ud fra et logistisk synspunkt, hvilket giver en forholdsvis let teknisk procedure med minimal udstyr og seling / restitutionstid, der giver mulighed for hurtig generering af store stikprøver af tumorer med specifikke genetiske ændringer. Disse tumorer forårsage dyr at bukke under for tumorbyrden med en forudsigelig median overlevelse afhænger af de genetiske ændringer induceres. Endelig har SB model blevet anvendt som et terapeutisk intervention skærm for behandlingsrespons ^24.

Der er flere vigtige faktorer at overveje, når de udarbejder de løsninger, der anvendes til neonatale injektioner. DNA-opløsninger skal være sterile, endotoxin fri og koncentreret (2-7 pg / pl) for at tillade minimalt volumen af ​​injektioner. Det optimale forhold mellem kvælstof rester i polyethylenimin (PEI) til phosphatrester i DNA (N / P-forhold) er 7. Dette sikrer dannelsen af ​​positivt ladede partikler komplekser, som vil binde anioniske dele på celleoverflader og vil blive endocytoserede. Når i cytoplasmaet, vil osmotisk tilstrømning medføre partiklerne til at briste og frigive encapsulated plasmid-DNA. In vivo jet-PEI opløsning har en koncentration på 150 mM, udtrykt som kvælstof rester. Eftersom et ug DNA har 3 nmol anionisk phosphat, mængden af ​​transfektionsreagens nødvendigt kan beregnes med formlen:

pi in vivo jet-PEI = [(ug DNA x 3) x N / P-forhold] / 150.

For eksempel, for at forberede 40 pi 0,5 pg / pl DNA-opløsning med en N / P-forhold på 7, 20 ug af DNA er nødvendige. Mængden af ​​PEI påkrævet vil være 20 * 3 * 7/150 = 2,8 pi.

Op til fem forskellige plasmider kan injiceres samtidigt. Eksperimenter præsenteret heri levere Tornerose transposasen i trans på et plasmid, der også koder luciferase (SBLuc). Som nævnt i indledningen, forholdet mellem transposasesekvenser molekyler til transposoner er vigtigt at sikre optimal gennemførelse. Det optimale forhold (empirisk etableret) i SB100x plasmidet til transposon DNA-plasmid er 1: 4. Derfor, hvis man anvender to forskellige transposon plasmider, T1 og T2 for eksempel, forholdet mellem SBLuc: T1: T2 vil være 1: 2: 2; eller i alt 20 ug DNA i en 40 pi opløsning 4 ug SBLuc vil blive blandet med 8 ug T1 og 8 ug T2. For tre forskellige transposon plasmider bliver forholdet SBLuc: T1: T2: T3 = 1: 1,33: 1,33: 1,33 og fire transposoner: 1: 1: 1: 1: 1.

Det er nyttigt at kontrollere optagelsen af ​​plasmid DNA ved bioluminescens 24-72 timer efter injektion. Som dyrene vokser, den øgede optiske densitet af skind, kranium og hjerne, forhindrer overvågning af tumorprogression indtil tumoren har nået en tærskelværdi størrelse, ca. 1-2 mm ³ for mørkt pigmenterede C57BL6 mus. Bedre overførsel af lyset er muligt i disse mus, hvis deres pels er barberet, eller ved brug af mus med hvid eller ingen pels.

Adskillige begrænsninger skal overvejes, når denne model. Først genettic materiale indføres med de injicerede plasmider kan integreres tilfældigt i værtsgenomet på forskellige steder og antallet af kopier. Dette kan føre til variabilitet mellem tumorceller og mellem tumorer. For det andet er DNA indføres indsat primært i intron TA gentagelsessekvenser DNA ²⁵ dog mulighed for interferens med kodende genomisk værts-DNA tilbage. For det tredje intraventrikulære indsprøjtninger kan forårsage en lille, men vedvarende sats hydrocephalus hos unge mus, som bliver klinisk synlig og symptomatisk i 3.-4. leveuge. Nogle stammer af mus er mere tilbøjelige til hydrocephalus end andre (dvs. C57 / BL6 mere end FVB). For at minimere risikoen for at inducere hydrocephalus, anbefales det at injicere så lille et volumen som muligt (mindre end 1 ul i C57 / BL6-mus), for at sikre, at nålene er skarpe, løsningerne har lavt saltindhold og give voksende hvalpe med beriget mad, for at muliggøre rettidig ossifikation af kraniet bones. Endelig sene tumorer udvikler ofte nekrose, som skal tages i betragtning ved overvågning mus ved bioluminescens. En lavere aflæsning kan angive en avanceret tumor med store områder med nekrose og ikke nødvendigvis en opløsning af tumoren som følge af behandling. I sidste ende, histologisk analyse fortsat guldstandarden at vurdere tumorprogression.

Fremkomsten af ​​tumor hel genomsekventering i de senere år har åbnet døren for udforskningen af ​​den rolle, som gentagne muterede gener i GBM. The Sleeping Beauty model er optimal for validering potentielle onkogener eller tumorsuppressorer. Som i eksemplet i dette papir med PDGFβ ligand, kloning af muse cDNA sekvensen af ​​et kandidat onkogen i en etableret SB plasmidskelet vil føre til konstitutiv ekspression i transficerede celler. Evaluering af den rolle, tumorsuppressorer effektivt kan udføres ved kloning i rygraden i SB plasmidet med kandidat-sekvenser, (available for eksempel i RNAi codex database ^26), for at skabe robuste udtryk for andengenerations mir korte hårnåle.

En løbende debat på GBM forskning er relateret til identiteten på den celle-of oprindelse. Det er for nylig blevet vist, at i mus, tumorer induceret af nedregulering p53 og NF1 i neurale stamceller stammer fra oligodendrocyt precursorceller ^27. Brug af Tornerose transposon model, kan lignende undersøgelser være designet til at teste, om andre genetiske ændringer fortrinsvis rettet mod andre populationer af stamceller / precursorceller at generere GBMS. Viden fra disse undersøgelser vil øge vores forståelse af GBM ætiologi og give muligheder for nye behandlingsmetoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20 oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	For the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	Serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	Serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	For the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	For the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um	Fisher Scientific	08-771-2	For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified)	Fisher Scientific	314-631