Summary
Denne artikkelen beskriver metodikk for å administrere korte perioder av intermittent hypoksi til postnatal dag 1-8 mus eller rotteunger. Denne tilnærmingen effektivt utløser en robust vev nivå "priming effekt" på dyrkede nevrale stamceller som er høstet i løpet av 30 minutter av hypoksi eksponering.
Introduction
Målet med denne metoden er å reproduserbart og effektivt levere periodiske utbrudd av systemisk senket ambient oksygen til nyfødte gnagere. Begrunnelsen for bruk av intermitterende hypoksi (IH) for å manipulere stammen cellebiologi stammer fra in vitro cellekultur eksperimenter hvor O 2 innholdet i vekstmediet blir endret. Nærmere bestemt, når sammenlignet med "standard" betingelser 20% O 2, utvidet kultur av stammen / progenitor-cellepopulasjoner celler i 3% O 2 resulterer i økt proliferasjon, apoptose redusert og øket neuronal utbytte 1,2.
Denne gruppen har betydelig erfaring med administrasjon av systemisk IH, og har gjennomført omfattende studier på rollen IH i luft plastisitet 3-7. Dette arbeidet, og den nylige funn at kronisk IH økt neurogenesis i gnager CNS 8-10, danner grunnlag for utforskning av akutt in vivohypoksi som en preconditioning stimulus (f.eks., før vev høst) på den påfølgende kultur av neural stilk / stamceller (NPC) 11. Bemerkelsesverdig, når museunger ble utsatt for en kort (<1 time) periode av akutt intermittent hypoksi (AIH), celler som ble høstet fra subventricular sonen (SVZ) hadde betydelig økt kapasitet for ekspansjon som neurosfærer eller adherente monolagsceller. Den AIH protokollen ble også forbundet med økt ekspresjon av en "neuronal edge" transkripsjonsfaktor (Pax6).
Følgelig in vivo AIH protokoller kan være et middel for å "prime" NPCer før kultur. For eksempel kan programmer for denne fremgangsmåten omfatter å utvide cellepopulasjoner før transplantasjon inn i det skadede sentralnervesystemet, eller ganske enkelt å øke neuronal differensiering av dyrkede celler før in vitro eksperimenter. Videre, fordi dette er en systemisk tilførsel, noeorgan, vev eller celle er en kandidat for lignende studie. Derfor er protokollen som er skrevet potensielt gjelder for et bredt spekter av studier på intermitterende oksygen manipulasjon i små pattedyr.
Det er visse fordeler med denne tilnærmingen. I andre publiserte arbeider, ble nyfødte behandlet som et kull med demningen i hypobar kamre, som gjør det mulig for kronisk dosering, mindre håndtering før behandling, og opprettholdt morens kontakt under behandling 9. Den aktuelle tilnærmingen omgår gjentatte behandlinger til en kvinnelig avl, eller bruk av en annen demning for hvert eksperiment. Denne protokollen tillater også studier av presise søppel-matchet og alderstilpassede nyfødte. Representative data viser en annen viktig styrke denne protokollen, nemlig hurtighet som AIH, som levert, utløser en kraftig og konsekvent biologisk respons i nevrale stamcellebiologi. Dette etablerer en presedens for denne protokollen for å lokke fram vevs- og cellenivå biological endringer som endrer cellebiologi.
Denne rapporten vil skissere de detaljerte prosedyrer som brukes for å utsette gnager valpene til AIH samt befolkningen analyse av SVZ celler dyrket som neurosfærer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyr prosedyrer i denne protokollen er utført med samtykke fra University of Florida Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og er i samsvar med "Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr".
1. Grunnleggende Experimental satt opp før Intermittent Hypoksi Administration
- Expose valper 12 til de forskjellige gassblandinger ved hjelp av en hel-kropp mus plethysmograph kamre mye på samme måte som voksne gnagere for andre eksperimentelle formål 5,13,14. Kamrene har en 4 tommers diameter (volum = 450 ml), noe som er av god størrelse til å romme 3-4 museunger eller 1-2 rotteunger. Her er AIH protokoller levert til nyfødte i alderen postnatal dag 1-8 (P1-P8).
- Bruk trykkluft gasstanker å levere 21% "baseline" gass, som opprett kammer oksygene på 21%. For å oppnå "relative hypoksi", bruk en 10% oksygen / 90% nitrogen gass tank.
IKKEE: Plastisk rør (3/16 "diameter) forbinder gasstanker til en strømningsmåler. Således er input til strømningsmåleren består av en tube for hver grunnlinje og hypoksi luftstrøm. - Konfigurer gass slangen som følger.
- Kjør plastrør (1/8 "diameter) fra strømningsmåleren til en skjevhet strømningsregulator, som gjør det mulig strømmer av 1 l / min til hvert kammer (dvs. 4 l / min, hvis 4 kammere blir brukt).
- Kjør plastrør (1/8 "diameter) fra forspennstrømningsregulatoren til pletysmografi kamre. Luftstrømmen ved 1 l / min til hvert kammer er en forutbestemt strømningshastighet ved hvilken gassutveksling anses for å være ikke-stressinduserende til dyrene basert på fysiologiske og adferdsobservasjoner.
- Forsegle alle tilkoblinger til og fra skjevhet flyt enhet og alle ubrukte åpninger til kamrene med caps slik at ingen gasstrømmen flykter til andre kamre ikke er i bruk, eller ut av plethysmography kamrene under protokollen.
- Plasser kammeret (s) I en inkubator før til å sette dyr i kammeret for å tillate likevekt til 37 ° C, eller kroppstemperatur.
2. Kalibrering av Cycle Times for Intermittent Hypoksi
- Inspisere alle rør, mellom lufttankene og strømningsmåler, flyt meter og bias flyt enhet, og bias flyt enhet og plethysmography kammer (er) for aktuelle tilkoblingene. Tilkoblingene er satt opp som beskrevet i Trinn 1. Kontroller tilkoblingen av en trinnvis sjekk av alle beskrevet linjer og nedleggelser: f.eks sjekke ubrukte linjer ut av skjevhet flyt enheten og eventuelle kammeråpningene ikke er i bruk.
- Koble en ambient O 2 sensor med en håndholdt O 2 meter og deretter feste sensoren til plethysmography kammeret lokket.
- Åpne begge gasstanker og fest ett par kirurgiske, lang håndteres hemostats isolert med plastrør å klemme off-syklus flyt av gass. På denne måten blir bare en gasstank i en tid leverer den 1 l / min gasstrøm per skammer. Klem "baseline" gassblanding, mens den "hypoksiske" gassblandingen føres til kammeret, og vice versa.
- Registrere den tid som er nødvendig for kammeret 2 O for å nå målet nivåer på 10% og gå tilbake til 21%. Utnytte de registrerte tider for påfølgende protokollen levering.
3. Administrasjon av akutt inter Hypoksi
- Inspiser alle slanger og koblinger som beskrevet i trinn 2.1.
- Plasser nyfødte i plethysmography kammer (e) og huse plethysmography kammer lokkene inn i kammeret basen. Bekrefte en korrekt tetning av O-ringtetningen er så vel som lukking av eventuelle ubrukte kammer forbindelser. Disse trinnene er avgjørende for å sikre riktig levering av gass blandinger.
- Plasser kamrene holder valpene som skal behandles inn i 37 ° C inkubator og lukke døren. Tillat kammer for å ekvilibrere til 37 ° C før start av protokollen. Opprettholde kontrolldyrene ved 37 ° C i incubateller på romluft oksygenering.
- Åpne begge gasstanker og bruke ett par kirurgiske, lang håndteres hemostats isolert med plastrør å klemme off-syklus flyt av gass. På denne måten blir bare en gasstank i en tid leverer den 1 l / min gasstrøm per kammeret.
- Bruk et håndholdt timer til nøyaktig tid sykluser og å angi tidspunkt å bytte hemostats mellom rørene, noe som resulterer i vekslingen av gasstrømmen til kamrene.
- Ta opp den fullføring av hver syklus ved hjelp av en behandling log slik som den som vist på fig 1 til å merke av alle trinn i to-trinns, 20 syklus protokoll.
- Overvåke temperaturen inkubator ved hver syklus for å sikre at endringen dyr opprettholdes på det angitte området (33-35 ° C, som er den innstilling på inkubator som fører til 37 ° C).
- Følge nøye med valpen aktivitet gjennom protokollen for å sikre at dyr tåler sykluser uten synlig nød som lyder, endret nivå avlem aktivitet eller rulle.
4. Isolering og kultur Stem / stamceller fra subventricular Zone
MERK: Endringen i neurosfære formasjon følgende AIH sammenlignet med kontroller er et eksempel på et endepunkt som demonstrerer effekten av denne protokollen for å fremkalle vevs- og celle-nivåendringer.
- For å isolere neurosfærer som danner cellene, fjerner mus- eller rotteunger fra kammeret umiddelbart etter AIH er fullført. Ofre dyrene ifølge IACUC protokoller innen 30 minutter av protokollen oppsigelse.
- Høste SVZ vev, legg inn neurosfære kultur og gjennomføre standard passasje og utvidelse av avledede neurosfærer, som tidligere publisert i metoder kapitlene 15,16 og en egen video protokoll 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De første forsøkene, basert på historiske data, ble utført ved bruk av en min syklus lengder. Basert på de påfølgende kalibreringer utført i trinn 2 ovenfor, ble det fastslått at O 2 nivået i kammeret var 13% ved 1 min post-hypoksi spyling, og at det tok en lignende tid til å vende tilbake til 21% baseline. Men en 2 min syklus var nok til å både oppnå 10% oksygen og en tilbakevending til 21% i løpet av "baseline" syklus. Senere har 2 min sykluslengder blitt brukt. Protokollen varighet besto av 20 sykluser alternerende mellom baseline og hypoksi (80 min totale behandlingstiden). En 20 syklusvarighet ble valgt på grunn av tidligere arbeid viser at en slik syklusens varighet er tilstrekkelig til å fremkalle endringer i luft resultat måler 11. Bruke den beskrevne satt opp (figur 2), nyfødte utsettes for AIH hadde ingen åpenbare bivirkninger og ikke utvise atferd som kan tyde på smerte og ubehag under 80min protokollen. Spesielt var ingen synlige apnea observert, overdreven lem eller hodebevegelser, eller lyder. Etter AIH, subventricular sone avledet nevrale stilk / stamcellepopulasjoner dyrket som neurosfærer i 14 dager (og også som heftmonolags populasjoner, data ikke vist) utviser en nesten dobling i diameter, noe som viser økt ekspansjon innenfor hver forming sfære (Figur 3). Celler som er neste belagt i permissive betingelser (dvs. fravær av mitogene faktorer) ga signifikant flere beta-3-positive celler (en økning fra <10% til> 45%) noe som indikerer mer omfattende neuronal differensiering sammenlignet med celler høstet fra normoksisk behandlede (kontroll) avkom (figur 4).
Figur 1. Denne skrå IH diagramskive anvendes for å dokumentere dyr og eksperimentelle detaljer, gir en sjekkliste for før og etter gjennomføringen av IH-protokollen, og fungere som et sporings dokument for nøyaktig oversikt over alle fullførte sykluser.
Figur 2. Intermittent hypoksi satt opp for nyfødte gnagere. (A) Inkubator for å opprettholde miljøet på 37 ° C. Pletysmografi kammer er vist i inkubatoren, og igjen med kammeret åpen dør (B). (C) Høyre, strømningsmåler justert til 1 L / min for hvert kammer. Gasstrømmen rettet via bias mengdeenhet splitter enhet (i midten) til alle tilkoblede kammer (venstre, innenfor inkubator). (D) hemostat kontroll over baseline (byråkrati) og hypoksi (gul tape) innspill linjer. ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kontroll neurosfærer (A) viser en mindre diameter enn AIH neurosfærer (B). Bilder tatt på 10X objektiv, skala bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kontroll neurosfærer (A) viser færre beta-3-tubulin-positive neuroblasts enn AIH neurosfærer (B). Bilder tatt på 20X objektiv, skala bar = 50 mikrometer.g "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
