Abstract
Reduceret rygmarv blodgennemstrømning (SCBF) (dvs. iskæmi) spiller en central rolle i traumatisk rygmarvsskade (SCI) patofysiologi og er derfor et vigtigt mål for neurobeskyttende terapier. Selvom flere teknikker er blevet beskrevet for at vurdere SCBF, de alle har væsentlige begrænsninger. At overvinde den sidstnævnte, vi foreslår brugen af real-time kontrast forstærket ultralydsscanning (CEU). Her beskriver vi anvendelsen af denne teknik i en rotte kontusion model af SCI. En jugular kateter først implanteres for gentagen injektion af kontrastmiddel, en natriumchloridopløsning af svovlhexafluorid indkapslede mikrobobler. Rygsøjlen derefter stabiliseret med en skræddersyet 3D-ramme og rygmarven dura mater er udsat af en laminektomi på ThIX-ThXII. Ultralydsonden placeres derefter på den posteriore side af dura mater (overtrukket med ultralyd gel). For at vurdere baseline SCBF, en enkelt intravenøs injektion (400 ul) af contrast påføres på optage dens passage gennem den intakte rygmarv mikrovaskulaturen. En vægt-slip enhed efterfølgende anvendes til at generere en reproducerbar eksperimentel kontusion model af SCI. Kontrastmiddel er re-injiceres 15 min efter skaden for at vurdere post-SCI SCBF ændringer. CEU muliggør realtid og in vivo vurdering af SCBF ændringer efter SCI. I skadede dyr, ultralydsscanning viste ujævne blodgennemstrømning langs intakte rygmarven. Endvidere 15 min post-SCI, der var kritisk iskæmi på niveau med epicentret mens SCBF forblev bevaret i de mere fjerntliggende intakte områder. I regionerne støder op til epicentret (både rostralt og caudal) blev SCBF væsentligt reduceret. Dette svarer til den tidligere beskrevne "iskæmisk penumbraen zone". Dette værktøj er af stor interesse for at vurdere virkningerne af behandlinger der tager sigte på at begrænse iskæmi og den resulterende vævsnekrose efter SCI.
Introduction
Traumatisk rygmarvsskade (SCI) er en ødelæggende tilstand, der fører til en betydelig forringelse i motor, sensoriske og autonome funktioner. Til dato har ingen behandling vist sin effektivitet i patienter. For sådan grund er det vigtigt at identificere nye teknikker, der vil forbedre vurderingen af potentielle behandlinger og kan yderligere belyse skade pathiophysiology 1.
SCI er opdelt i to på hinanden følgende faser, betegnet som primære og sekundære skader. Den primære skade svarer til den oprindelige mekaniske skade. Mens de sekundære skade grupperne en kaskade af forskellige biologiske hændelser (såsom inflammation, oxidativt stress og hypoxi), der yderligere bidrager til gradvis udvidelse af den oprindelige læsion, vævsskade og derfor neurologisk underskud 2,3.
På den akutte fase af SCI, er neurobeskyttende behandlinger til formål at reducere den sekundære skade patologi og shOuld derfor forbedre neurologiske udfald. Blandt de mange sekundære skade begivenheder, iskæmi spiller en afgørende rolle 4,5. På niveau med SCI epicenter, de beskadigede parenkymale mikrokar hæmme den effektive rygmarv blodgennemstrømning (SCBF). Desuden er SCBF også reduceret betydeligt i området omkring skaden epicentret, et område specifikt kendt som "iskæmiske penumbraen zone". Hvis SCBF ikke hurtigt kan genoprettes inden for disse områder, kan iskæmi føre til supplerende parenchymal nekrose og yderligere nervøs vævsskade. Da selv den mindste vævskonservering kan have betydelige virkninger af funktion, er det af stor interesse for at udvikle lægemidler og behandlingsformer, der kan reducere iskæmi post-SCI. For at fremhæve dette fænomen, har tidligere arbejde vist, at bevarelsen af kun 10% af myelinerede axoner var nok til at tillade gå hos katte efter SCI 6.
Selvom flere teknikker er blevet beskrevet for at vurdere SCBF, deny har alle væsentlige begrænsninger. For eksempel anvendelse af radioaktive mikrosfærer 7,8 og C14-iodopyrine autoradiografi 9 kræver efterfølgende dyr offer og kan ikke gentages på senere tidspunkter. Brint clearance teknik 10 afhænger af indføring af intraspinale elektroder, som yderligere kan beskadige rygmarven. Mens laser Doppler imaging, fotoplethysmografi 14,15 og in vivo lysmikroskopi 16 har en meget begrænset dybde / område måling 11-13.
Vores team har tidligere vist, at kontrastforbedret ultralyd (CEU) billeddannelse kan anvendes til at vurdere realtid og in vivo de SCBF ændringer i rotte rygmarven parenkym 17. Det er vigtigt at bemærke, at en lignende teknik blev anvendt af Huang et al. I et porcint model af SCI 18. CEU anvender en bestemt form for ultralydsscanning, som gør det muligt at knytte gråtoner morfologiske imaldre (fremstillet ved den konventionelle B-mode) med rumlige fordeling af blodgennemstrømningen 19. Den SCBF billedbehandling og kvantificering afhængig intravaskulær injektion af ekko-kontraststoffer. Kontrastmidlet består af svovlhexafluorid mikrobobler (gennemsnitlig diameter på omkring 2,5 um og 90% har en diameter mindre end 6 um) stabiliseret med phospholipider. Mikroboblerne afspejler ultralydsstrålen, der udsendes af sonden dermed øge ekkoet fra blod og øge kontrasten af vævene efter deres blodgennemstrømning. Det er derfor muligt at vurdere blodstrøm i et givet område af interesse ifølge intensiteten af det reflekterede signal. Mikroboblerne er også sikre, og de er blevet klinisk anvendt i mennesker. Den svovlhexafluorid hurtigt ryddet (middel terminal halveringstid er 12 min) og mere end 80% af den administrerede svovlhexafluorid genfindes i udåndingsluften inden for 2 min efter injektion. Denne protokol giver en enkel måde at bruge CEU imaging at vurdere SCBF forandringer hos rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: der er beskrevet i dette manuskript metoder blev godkendt af bioetik udvalg Lariboisière School of Medicine, Paris, Frankrig (CEEALV / 2011-08-01).
1. Instrument Forberedelse
- Forbered og rengør følgende instrumenter til kateter indsættelse: mikro-tang, mikro-saks, mikro-kar klemme, store sakse, kirurgisk tråd (Sort flettet silke 4-0) og en 14 G kateter. Heparinize kateteret med en heparin-opløsning (5.000 U / ml).
- Forbered og rengør følgende instrumenter til laminektomi: store saks, skalpel og en knogle cutter. Udfør laminektomi med en skræddersyet knogle cutter designet til at reducere risikoen for at skade rygmarven under laminektomi (figur 1).
- Opsætning 3D-rammen anvendes til positionering og stabilisering af dyret. Den specialfremstillede ramme er bygget med elementerne i en ekstern fiksator Hoffman 3 i samarbejde med pincet, which er buet for at passe lændehvirvelsøjlen af dyret.
- Forbered vægt-drop-enhed (attrappen) anvendt til rygmarven biomekanisk skade.
BEMÆRK: skræddersyet impaction enhed er designet med en 3D-software og trykt i 3D. - Tænd for ultralyd maskine.
- Forbered kit til rekonstituering af kontrastmidlet.
BEMÆRK: Sættet indeholder 1 hætteglas indeholdende 25 mg frysetørret pulver, 1 fyldt injektionssprøjte indeholdende 5 ml natriumchlorid og en mini-spike transfer-system (figur 2). Trinene til rekonstitution af kontrastmidlet er beskrevet nedenfor (i afsnit 5).
2. halsvenen kateterisation (figur 3)
- Bedøver dyret med 4% isofluran. Dyret i liggende stilling. Bekræft korrekt bedøvelse ved at sikre, at dyret ikke reagerer, når poterne klemt med en pincet. Påfør dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens undER anæstesi.
- Barbere halsen og rense huden. Lave et snit på midterlinjen af halsen. Træk sternocleidomastoidian muskel for at finde den interne halsvene. Stramme en ligatur på den rostrale del af venen.
- Påfør en mikrovaskulære klemme på venen, 1 cm under ligatur. Passere en anden tråd omkring venen, lige under klemmen med knuden klar til at blive stramme når klemmen er frigivet.
- Åbne væggen af venen (venotomi) mellem klemmen og den rostrale ligatur. Indføre en 14 G kateter i lumen af venen og skubbes mod hjertet.
- Når det kommer op mod klemme, slipper sidstnævnte og skubbe kateteret yderligere. Fastgør kateteret i venen ved fast stramme knude på venen med kateteret indeni.
- Vurdere åbenheden af kateteret ved udtagning af en lille mængde venøst blod i kateteret og efterfølgende derefter skylle den med hepariniseret saltvand. Dette forhindrer tilstopning af catheter af en potentiel blodprop.
- Forbinde fleksibel slange til kateteret for yderligere injektion af kontrastmiddel (mikrobobler). Hold den lukket (forseglet), indtil klar til brug.
3. Adgang til Spine, laminektomi og Rotte Positionering (i 3D-ramme)
- Sende dyret i en flad tilbøjelige vandret position. Barbering og rense ryggen (thorax region) af dyret.
- Identificere det bageste ribben (XIIIth i rotter) ved palpation (figur 4). Dette gør det muligt at estimere placeringen af XIIIth brysthvirvel (ThXIII).
- Lav en 4 cm hud snit på midterlinjen, centreret om ThXIII. Åbne hudincision samt den underliggende bursa. Overhold aponeurosis af rygmuskler samt spidsen af vertebrale rygsøjlen processer.
- Lokalisere omhyggeligt rygsøjlen processen med ThXIII ved palpere XIIIth ribben.
BEMÆRK: XIIIth ribbe er forbundet til ThXIII og udgør derfor en nem at locate anatomisk vartegn for identifikation af ThXIII. Dette trin muliggør lokalisering af ThXII at ThIX spinosus proces samt L1 og L2 (første og anden lændehvirvlerne). - Skær den muskuløse aponeurosis og tag musklerne på begge sider til at eksponere torntappene, de lamellerne og facetled fra ThIX til L2. Udsætte laterale aspekter af L1 og L2 ved at tage muskler fra de tværgående processer.
- Hook dyrets fortænder på 3D-frame at sikre positionen (figur 5). Klemme L1 og L2 ryghvirvler med de modificerede pincet. Forbinde de modificerede pincet til 3D-rammen for at stabilisere dyret.
- Træk forsigtigt kaudalt pincet holder lumbal for at stramme hele rygsøjlen og at hæve brystkassen fra bænken.
BEMÆRK: Med den beskrevne indretning bør dyret være i stand til at ånde. På trods respiratoriske bevægelser af brystkassen, rygsøjlen og spinalledning bør også fortsat være immobile. - Fjern spinosus processer, fra ThIX til ThXII. Sæt forsigtigt ringere klinge af knoglen cutter under venstre lamina af ThXII og derefter lukke knoglen cutter for at skære pladen (figur 6).
- Gentag samme manøvre for retten lamina og successivt fjerne den bageste bue. Gentag de foregående trin for ryghvirvler ThXI til ThIX for at opnå en fire-niveau laminectomy. Fjern begge facetled for hver ryghvirvel.
BEMÆRK: I hele den procedure, rense operative felt fra lokal blødning. For at bruge vatpinde og vanding med lunkent saltvand. Hæmostase systematisk sker inden for få minutter.
4. CEU Probe Positionering
- Dæk dura mater med ultralyd gel. Dette tillader effektiv overførsel af ultralydsbølger mellem sonde og rygmarv (figur 7).
- Stabiliser ultralydsonden witha klemme, der efterfølgende kan forbindes til 3D-frame med en leddelt arm. Manuelt placere sonden. Sørg for, at sonden er orienteret for at opnå en skrå langsgående sagittal skive. I en korrekt position, rygmarven er strengt vandret på billedet og den centrale kanal af rygmarven er synlig langs hele segment af rygmarven.
BEMÆRK: Positionering bør være styret af real-time B-mode billede, der vises på skærmen af ultralyd maskine. Den brændvidde på ultralydsonden bør tilpasses den centrale kanal af rygmarven. På dette tidspunkt, er tilgængelig for posteriore side af rygmarven, som i sidste ende vil give mulighed for anbringelse af slaglegemet. - Når optimal, låse leddelt arm at stabilisere positionen.
5. Udarbejdelse af Contrast Agent - Mikroboble Opløsning
- Ved hjælp af indholdet af et kommercielt rekonstituering kit og tilslut stempelstangen ved at fastgøre det tightly ind i sprøjten (med uret). Åbn transfersystemet blister og fjern sprøjtespidskapslen. Åbn transfersystemet hætte og tilslut sprøjten til transfersystemet (sy fast).
- Fjern den beskyttende disken fra hætteglasset. Skub hætteglasset i den gennemsigtige hylster af
- transfersystem og tryk fast for at låse hætteglasset på plads.
- Tømme indholdet af sprøjten i hætteglasset ved at skubbe på stempelstangen. Ryst kraftigt i 20 sekunder for at blande hele indholdet i hætteglasset for at få en hvid mælkeagtig homogen væske.
- Vendes systemet og omhyggeligt trække kontrastmidlet ind i sprøjten. Skru sprøjten fra transfersystemet. Efter rekonstituering (som anvist), 1 ml af den resulterende dispersion indeholder 8 pi svovlhexafluorid i mikroboblerne. Trække suspensionen af mikrobobler i en 100 ml sprøjte. Sæt 100 ml sprøjten i den elektriske pumpe. Luk låget.
- Start konstant omrøring af reudgjorde mikrobobler. Opnået konstant omrøring ved langsom rotation af sprøjten, som opretholder mikroboblen suspension. Tilslut pumpen til jugularis kateter gennem den fleksible slange. Indstil ultralyd maskine til "Harmonic Mode".
BEMÆRK: Sidstnævnte svarer til den tilstand, i hvilken mikrobobler specifikt kan opdages og visualiseres. Denne tilstand har en lav mekanisk indeks, som ikke ødelægger mikroboblerne i modsætning til B-tilstanden. - Udrense kateteret ved infusion en første dosis (400 ul) af kontrastmiddel. I løbet af denne første infusion, skal du kontrollere, at mikroboblerne synes på ultralyd skærmen. Dette bekræfter, at hele kredsløbet (fra sprøjten til rotten blodbanen) er intakt og åben.
- Indstil ultralyd maskine til "B-tilstand" for at visualisere rygmarven parenkym og ødelæggelse af de få resterende mikrobobler i blodbanen. Den høje frekvens af "B-Tilstand" tranSmits høj energi til de mikrobobler, som giver dem mulighed for nedbrydning.
- Lad dyret lå stille i ca. 30 min. Denne periode tillader stabilisering af hæmodynamiske parametre.
6. Vurdering af SCBF i ubeskadiget Spinal Cord
- Indstil ultralyd maskine til "Harmonisk Mode". Starter samtidigt (1) infusion af kontrastmiddel (400 pi) og (2) den kronometer.
BEMÆRK: Under infusionen, bør koncentrationen af mikrobobler i blodet øges, så kontrasten forestille af rygmarven (Figur 8). Da mikroboblerne hurtigt ødelægges, blodkoncentrationen af mikrobobler begynder faldende, når injektionen er fuldført, som genererer et progressivt fald i modsætning visualisering af rygmarven. - Efter 1 min, skal du vælge (tryk) på "Clip Store" -knappen på ultralyd maskine. Dette vil gøre det muligt at spare 1 min af raw ultralyd data og imaging videooptagelse (der tidligere blev vist på ultralyd skærmen).
- Indstil ultralyd maskine til "B-tilstand". Dette vil fjerne de resterende mikrobobler.
7. Eksperimentel SCI
- Brug af mikromanipulator forbundet til 3D-frame, placere vægt-drop impaction enhed, så at spidsen af slaglegemet kommer i kontakt med dura mater (på rygmarven midterlinjen), ved forbindelsen mellem THX og ThXI (figur 9) .
BEMÆRK: Dette niveau skal svare til midten af segmentet af rygmarven iagttaget med ultralydsapparat. Den angriber og kroppen af slaglegemet er 8 mm i diameter. Spidsen af slaglegemet, hvilket vil generere skaden, er 3 mm i diameter. - Placer angriber af impaction enheden ved en 10 cm høj position. Fremkalde den eksperimentelle SCI ved at frigive de strejkende af impaction enhed. Den angriber falder og frigiver the attrappen, sårede rygmarven. Den specialfremstillede impaction leverer en effekt svarende til en 10 g vægt faldet fra en højde på 10 cm.
8. Vurdering af SCBF 5 min Post-SCI
- Gentag trinene i afsnit 6 (Vurdering af SCBF). Mikroboblerne vil være i stand til at passere gennem det beskadigede mikrovaskulatur og skaden epicentret vil forblive mørke (figur 10).
9. Animal Sacrifice
- Aflive dyret med intra-peritoneal dødelig injektion af pentobarbital (100 mg).
10. Kvantificering af SCBF af Offline Analysis
- Start Ultra-Extend Software bruges til kvantificering (på ultralyd maskine). Vælg "File" og vælg derefter tidligere gemte rådata og åbne de tilhørende filer. Aktivere "kvantificering mode" ved at trykke på (vælge) af "Chi Q" -knappen. Select "Set ROI" (knap) og vælg den cirkulære form.
- Vælg "Tegn ROI" (knap) og tegne syv tilstødende cirkulære områder af interesse (ROI) på rygmarven (Figur 11). Åbn menuen "Fitting" og vælg funktionen "Curve værdi". Overhold software viser flere kurver, der hver svarer til ændringerne i mikrobobler koncentration inde i en ROI.
BEMÆRK: Hver kurve har en "perfusion-deperfusion" profil. Den første fase af kurven er flad og svarer til den periode, før ankomsten af mikrobobler. I den anden fase, koncentrationen af mikrobobler hurtigt stiger som følge af infusionen. I den tredje fase, som begynder, når infusionen er gennemført, koncentrationen af mikrobobler gradvis aftager som de disintegratse i blodbanen. - Anbring den første lodrette linje i begyndelsen af anden fase af cUrve og vælg "SET". Det oplyser den software, hvor man skal begynde analysen.
- Placer den anden lodrette linje i slutningen af optagelsen og igen vælge "SET". Det oplyser den software, hvor skal stoppe analysen.
- Se på "Cv" menuen og registrere "AUC" værdi, som svarer til "arealet under kurven" analyseret. Denne værdi er proportional med SCBF inde i tilsvarende ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med beskrevet protokollen ovenfor, er det muligt at kortlægge SCBF langs en langsgående rygmarv sagittal segment.
I ubeskadiget rygmarven, synes der at være SCBF uregelmæssigheder i parenkym (figur 12). Dette kan forklares ved den variable fordeling af radiculo-medullære arterier (RMA) fra et dyr til et andet. RMA betegner segmental arterier, der når den anteriore spinal arterie (ASA), og derfor giver blodforsyning til rygmarven parenkym. I modsætning hertil radikulære arterier svarer til segmenter arterier, der ikke når frem til ASA, og derfor ikke giver spinal forsyning navlestrengsblod. Derfor, i rygmarv segmenter, hvor RMA anastomoser med ASA, der er mere blodgennemstrømning (som vist i vores resultater).
Efter SCI, real-time CEU imaging viser en mangel i omløb på skaden epicenter. Epicentret forbliver mørkt (ingen kontrastmiddel signal),da der ikke er nogen aktiv blodgennemstrømning. Mere detaljeret analyse af blodgennemstrømningen ved hjælp af flere ROIs viser tre unikke blodgennemstrømning territorier. Dels på niveauet for epicentret, blodgennemstrømningen er det laveste med en gennemsnitlig nedgang på ca. -90%. For det andet, i de områder der støder op til epicentret (både rostralt og caudal), SCBF blev også faldet væsentligt (fra -50% til -80%). For det tredje, i de mest afsidesliggende områder, der svarer til intakt væv, er SCBF bevaret. Den anden region svarer til den "iskæmiske penumbra zone", som bør være målet for potentielle neurobeskyttende behandlinger. At være i stand til let at visualisere og kvantificere SCBF ændrer post-SCI er nyttig til at vurdere effektiviteten af behandlinger til formål at reducere væv iskæmi, og fremhæver derfor betydningen af denne teknik (figur 13).
Figur 2. Skematisk afbildning af kit til mikrobobler rekonstitution og Vueject ° pumpen anvendes til mikrobobler infusion. Systemet overførsel giver mulighed for levering af mikrobobler og saltvand mellem hætteglasset og sprøjten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. jugular kateter. Kateteret skal indsættes i halsvene og derefter skubbet mod hjertet og til sidst sy fast med en knude. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Metode til korrekt identifikation af de vertebrale niveauer. Hos rotter, er det sidste ribben knyttet til XIIIth ryghvirvel. Sidstnævnte kan palperes gennem huden som et vartegn for den sidste brysthvirvel, XIIIth. Muskler er fritliggende på hver side af torntappene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Stabilisering af dyret i 3D-frame. (1) fortænder er hooked på rammen, mens den første og anden lændehvirvlerne (L1 & L2) er fastspændt med skræddersyede pincet. (2) Lændehvirvelsøjlen lidt spændt som stabiliserer dyret og løfter thorax fra bænken, hvorved frie respiratoriske bevægelser uden rygsøjlen bevægelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Tekniske detaljer af laminektomi. Først den tynde klinge af specialfremstillet knogle fræser bestået under hinden uden at beskadige rygmarven. Derefter knoglen cutter er lukket, hvilket cUTS og fjerner en del af hinden. Proceduren gentages på begge sider og fra ThXII til TxIX for at opnå en fire-niveau laminektomi. Endelig facetled er også fjernet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Placering af ultralydsonden og impaction enheden. Proben er parallel med rygmarven og let skråtstillet (20-30 °), således at vægten slip slaglegeme kan placeres mod den posteriore side af dura. Rygmarven skal være synlig med det centrale kanalen til stede i hele den midterste segment på ultralydsscanning "B-Mode". Klik her for at seen større version af denne figur.
Figur 8. Contrast billeddannelse af det intakte rygmarv. De successive tal i kontrast (orange farvede billeder) viser, hvordan kontrastmidlet (mikrobobler) gradvis vises efter infusionen, og dermed forbedre kontrasten af rygmarven. Bolusinfusion varer omkring 10 sekunder, og data kontrasten blev registreret for 1 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. Ændringer i B-mode følgende eksperimentelle SCI. En hyperekkoisk læsion vises inde parenkym, der svarer til den oprindelige parenkym h emorrhage post-SCI. Histologi (H & E-farvning): blødningen skyldes massiv traumatisk afbrydelse af små blodkar, der fører til blod ekstravasation i parenkym (gul skala bar = 2,000 um). Den impaction enheden er vist til højre. Den angriber frigives fra en højde på 10 cm, og kolliderer med attrappen, der efterfølgende genererer rygmarvsskade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10. Contrast billeddannelse 15 min post-SCI. Svarende til figur 8, mikroboblerne er synlige, når de passerer gennem rygmarven mikrovaskulaturen. På epicentret (stjerne), er blodgennemstrømningen blokeret af microvascular forstyrrelser.10large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11. Protokol for SCBF kvantificering. Med Ultra-Extend Software, er syv cirkulære og tilstødende områder af interesse (ROI) trukket på den langsgående rygmarven billede. Den første ROI placeres på skaden epicentret. I hver ROI, softwaren genererer en perfusion-deperfusion kurve og beregner arealet under denne kurve. Denne værdi korrelerer med blodgennemstrømningen i området. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12. Heterogenitet af blodstrømmen langsrygmarven. Disse grafer vise heterogenitet rygmarven blodgennemstrømning samt variabiliteten mellem dyr. Dette kan hovedsagelig forklares ved den vaskulære anatomi af rygmarven. Men på grund af heterogeniteten og variable vaskulære anatomi, skal der anvendes blodgennemstrømningen målinger (fra hver ROI) inden skade, da basislinjen. Målingerne foretages på følgende tidspunkter (post-SCI) er udtrykt som procentdele ændring af baseline. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13. Ændringer i rygmarv blodgennemstrømning (SCBF) induceret af den eksperimentelle rygmarvsskade (SCI). 15 min efter SCI der er kritisk iskæmi på niveau med epicentret mens SCBF forblev preserveret i de mere fjerntliggende intakte områder. I regionerne støder op til epicentret (både rostralt og caudale), er SCBF væsentligt reduceret. Dette svarer til den tidligere beskrevne "iskæmiske penumbra zone". Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om vi har beskrevet, hvordan man bruger CEU i en rotte SCI kontusion model, kan denne protokol modificeres til at passe andre eksperimentelle mål eller SCI-modeller. Vi har valgt at måle SCBF på kun to tidspunkter (før skade og 15 min post-SCI), men antallet af tidspunkter og forsinkelsen mellem SCBF målinger kan tilpasses til at opfylde behovene i andre undersøgelser. For eksempel i vores tidligere arbejde 17 har vi målt SCBF på fem på hinanden følgende tidspunkter under hele den første time efter SCI. Det er vigtigt at bemærke, at i sham-gruppen (ingen SCI), blev vi overrasket over at iagttage en progressiv reduktion i SCBF. Mens vi oprindeligt frygtede, at gentagen mikroboble infusion kunne skade rygmarven vaskulatur, yderligere eksperimentering (upublicerede data) bekræftede, at disse ændringer var forårsaget af progressive ændringer i lokal væv fysiologiske betingelser (temperatur, hydratisering) induceret af laminektomi, samt den langvarige fremstilling af than dura og omgivende væv til den omgivende luft og ultralyd gel. Disse problemer er almindelige i alle eksperimenter, der beskæftiger sig med mikrocirkulationen, da cirkulationen er ekstremt følsom over for mange parametre, og derfor udsat for vascoconstriction eller vasodilatation. Anbefaler vi derfor, at den periode, hvor det kirurgiske sår forbliver åben, er så kort som muligt. Hvis flere SCBF målinger er behov over en længere periode, ville det være at foretrække at lukke dyret snit mellem opkøbene for at genskabe fysiologiske forhold omkring og inde i rygmarven.
Det er også muligt at modificere formen, størrelse, placering og antallet af ROI'er for SCBF analyse. En af de store fordele ved CEU er, at målinger kan udføres når som helst følgende eksperimentelle afsluttet ved at behandle registrerede data offline. Det er også muligt at gentage de målinger eller til at ændre indstillingerne måling / standarder om nødvendigt.
Rumlige opløsning ultralydsscanning er proportional med frekvensen af ultralydsbølger. Jo højere ultralyd frekvens, jo bedre den rumlige opløsning. Vi har anvendt en høj-Frekvens (12-14 MHz) probe, som giver et billede med en pixelopløsning på ca. 100 um. Med meget-høj opløsning systemer, frekvensen stiger op til 55 MHz og hver pixel er omkring 20 um 20. Sådanne indretninger kan også anvendes til CEU, der skildrer langt mere præcist fordelingen af SCBF i parenkym. Imidlertid er systemer de meget-høj opløsning meget dyrere.
Der er blevet foreslået flere andre teknikker til at måle SCBF i SCI, men de har alle unikke begrænsninger. Nogle, såsom radioaktive mikrosfærer 7,8 eller C14-iod-antipyrin autoradiografi 9, kræver dyr offer. I disse tilfælde skal rygmarven høstes til analyse. På den anden side er hydrogen clearance teknik 10, kræver intraspinal elektrode indsættelse som faktisk kan modificere SCBF. Desuden kan målingen kun foretages i et meget begrænset område af rygmarven parenkym. Lysmikroskopigennem en spinal vindue giver også en måde at vurdere mikrocirkulationen, men denne fremgangsmåde har en meget begrænset dybde af observation. Det tillader kun at observere omsætning i overfladiske pia sagen og ikke i parenkym 16.
I litteraturen er real time in vivo vurderinger af SCBF normalt udføres ved hjælp af laser Doppler imaging 11-13. Men selv denne teknik har flere begrænsninger. For det første, eftersom laseren er mindre end 1 mm i diameter, SCBF kan kun vurderes i et meget begrænset område svarende til en halvkugle af cirka 1 mm i diameter. Eftersom rottens rygmarv er omkring 3 mm i diameter, det begrænsede område af analysen er en væsentlig hindring. Som vi har vist, at SCBF i ubeskadiget rygmarv ikke er homogent, er det vigtigt at måle SCBF i et større område for en passende repræsentation af væv mikrocirkulationen. For det andet laseren har en begrænset indtrængningsdybde og derfor detects overfladisk SCBF. Som følge heraf er det ikke kun måler parenchymal SCBF men også af pia mater (der omgiver parenkym). Da pia mater har en unik vaskulære system og er ikke underlagt de samme auto-regulerende mekanismer som parenkymale fartøjer, kan denne information være misvisende. Endelig betyder laser-Doppler ikke give nogen morfologisk information. CEU overvinder sådanne begrænsninger ved at vise morfologiske billeder af ledningen (B-mode), mens entydigt præsenterer kontrastmidlet, der klart kan identificeres i parenkym.
Trods sine mange fordele ved at andre tilgange, CEU har også nogle forskellige begrænsninger. Da målingerne foretages på en bi-dimensional sagittal skive (normalt parallelt med den centrale kanal), SCBF fra andre regioner i parenkym er utilgængelige. Endvidere kan oplysninger, der genereres af en enkelt bi-dimensional sagittale rygmarv segment ikke være repræsentative for hele ledningen. Nevertheless, kan dette styres ved flere forholdsregler. Dels ved at gentage målingerne på samme sted, den første måling foretaget (intakte rygmarv) kan anvendes som et pålideligt udgangspunkt. Det andet ved skade på rygmarven midterlinjen (bilateral skade), bør SCBF ændringer være symmetrisk mellem venstre og højre (ikke-offentliggjorte data). Disse forholdsregler til at sikre, at analysen af enkelt sagittal skive er nok til at afspejle den globale langsgående fordeling af SCBF.
Den høje pris på ultralyd maskiner er en anden begrænsning. Imidlertid eksisterer flere løsninger til at målrette dette problem. For det første kan nogle labs forhandle en midlertidig lån af fabrikanten for deres eksperimenter. Da ultralyd maskiner er transportable, er mulige midlertidige lån. Dette har været den fremgangsmåde, der anvendes af vores laboratorium. Alternativt kan en gruppe af labs samle ressourcer til at købe maskinen og opdele omkostningerne. Ellers mange universitets institutioner har billeddiagnostiske faciliteter og ultralyd maskines kan anbefales som vigtige værktøjer. Således kan dyrene transporteres den billeddannende facilitet for CEU vurdering og derefter bragt tilbage til andre forsøg.
For at vurdere vaskulære ændringer, kontrastmiddel (mikrobobler) skal injiceres intravenøst. Selv kateterisation af jugularis eller vena femoralis er invasive og risikabelt, venerne er let tilgængelige og tydeligt identificeres. I modsætning hertil haleveneinjektion er langt mindre invasiv, men fartøjet er dårligt skelnes / synlig for korrekt kateterisation. Der er derfor en risiko for, at nålespidsen ikke vil blive korrekt placeret inde i venen eller at det kan bevæge sig under injektion, kompromittere hele eksperimentet. Til en sådan årsag, foretrækker vi at anvende halsvenen og indføre et kateter til konsekvent mikroboble infusion.
Ryghvirvel knogler omgiver rygmarven. Som ultralydsbølger reflekteres af knogle og kan ikke passere gennem rygmarven lamellerne, billedbehandling kræverfjernelse af knogle (laminektomi) for at åbne en akustisk vindue. Den nemmeste måde at åbne rygmarvskanalen er at fjerne den bageste bue af ryghvirvel gennem en laminektomi. I denne protokol, kræver vi en fire-niveau laminectomy at visualisere en lang segment af rygmarven, herunder epicentret, penumbraen zone og fjerntliggende områder af intakt rygmarven. Selv om et flertal af eksperimentelle SCI modeller kræver en laminektomi (for klip ansøgning eller slaglegemet kontusion), disse normalt bestå af fjerne 1-2 lamina. Den omfattende 4-niveau laminektomi er en anden begrænsning af vores undersøgelse. Men hvis man kun har brug for at studere epicenter og penumbraen zone, en mindre omfattende laminektomi kan gøres og anbefales.
Som konklusion på trods af de mange begrænsninger, der er beskrevet ovenfor, CEU er et nyttigt værktøj til at vurdere SCBF ændringer og virkningen af forskellige behandlingsformer (forskning formål). Denne pålidelige, real-time, in vivo metode er ideel til at se på behandlinger for at reducereiskæmi og efterfølgende vævsnekrose post-SCI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H. Contrast-enhanced and targeted ultrasound. World J Gastroenterol. 17 (1), 28-41 (2011).
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
