Immunology and Infection

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

Published: April 20, 2016 doi: 10.3791/52589

Achille Broggi^1,2, Clara Cigni¹, Ivan Zanoni^1,2,3, Francesca Granucci^1,3

¹Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, ²Boston Children's Hospital, Division of Gastroenterology, Harvard Medical School, ³Humanitas Clinical and Research Center

Protocol

אישור לימוד: פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי משרד הבריאות האיטלקי (רומא, איטליה) על פי Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione דלה Direttiva n. 86/609 / CEE ב מאטריה di protezione degli animali utilizzati פיני sperimentali o המודעה אלטרי פיני scientifici."

1. קבלת דגימות עור

להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
אֹזֶן:
1. חותכים את החלק ללא שיער של האוזניים של העכבר.
2. הגב נפרד בצד הגחון על ידי משיכת אותם לגזרים עם מלקחיים. הסר את כל סחוסים הנותרים על ידי גירוד החלק הפנימי בעדינות של אוזניים עם מלקחיים.
עור Trunk:
1. לגלח את העור כולו של החיה שניהם עם סכין גילוח חשמלי ועם קרם מקריח עדין.
2. חותך את מדגם העור הרצוי (מ -2 סנטימטרים ² עד עורות בעלי החיים השלמים).
  1. אם ניתוק הגב כולו venעור עכבר tral, לעשות חתך אנכי באמצע העכבר בחזרה ואז לחתוך לאורך גבולות האזורים המגולחים סביב גוף העכבר.
  2. בעדינות להפריד את העור מפני הצפק ושרירי גב, לשמירת דגימת העור עדיין עם המלקחיים תוך הפרדה בין מדגם העור בקצות הטו הסגורות של מספרי כירורגיות או אזמל.
3. הכינו צלחת תרבית תאים 100 מ"מ המכיל 10 מ"ל של PBS קר כקרח.
4. לחסל שומן תת עורי על ידי השריית מדגם העור ב- PBS בצלחת מוכן בשלב 1.3.3 וקרצוף מדגם העור עם מלקחיים.
זָנָב:
1. חותכים את הזנב של העכבר.
2. ביצוע חתך אנכי על הזנב עם מספריים כירורגיות או אזמל כירורגי, החל מבסיס הזנב ולהגיע אל קצה הזנב.
3. שימוש במלקחיים כדי לנתק את העור מהזנב. תפוס את הקצה לחתוך בבסיס הזנב בעדינות למשוך לכיוון הקצה תוך כדי לחיצה עלגוף של הזנב עם מלקחיים.
4. הסר את כל עודפי שומן על ידי גירוד מדגם העור בעדינות.
שׁוֹדֵד דְרָכִים
1. חותכים את הרגל העכבר כולו עם מספריים כירורגיות. הימנעות חיתוך כל עור שעיר.
2. חותכים את העור של כף הרגל longitudinally מן הקרסול לתחילת הספרות.
3. החזק את עצמות קרסול עם מלקחיים או ביד בעת גרירת העור עם מלקחיים למשוך את העור כלפי הספרות כאילו הוא ממריא כפפה.

עיכול 2.

הכן את קוקטייל עיכול מפתרון המניות (שהוכן כמו רשימת חומרים) עם המתכון הבא: תערובת אנזימים (ראה רשימת חומרים עבור מפרטים) 300 מ"ל / מיקרוגרם, DNAse1 50 U / ml. לדלל ב FBS 5% RPMI.
קוצצים דגימות עור עם מספריים לחתיכות קטנות לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ עם 2 מ"ל של קוקטייל עיכול (לעור המטען: 2 מ"ל של קוקטייל עיכול כל 2 ס"מ ² של העור, עד 3 מ"ל סה"כ).
לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. נער בעדינות את צלחת פטרי 1-2 פעמים במהלך הדגירה.
יוצקים דגימות עור מתעכל על מסננת 70 מיקרומטר תא 66 צלחת מ"מ פטרי המכילה 1 מ"ל של RPMI1640 FBS 5%.
שטפו את המסננת עם 5 מ"ל של RPMI 1640 5% FBS.
סוחט את המדגם דרך מסננת התא עם בוכנה במזרק.
הבוכנה סומק, צלחת פטרי מסננת עם 20 מ"ל של RPMI1640 FBS 5%, להעביר לתוך שפופרת 50 מ"ל.

3. נוגדנים תיוג

שטפו את ההשעיה השיג פעמיים עם 5 מ"ל של 1% PBS FBS (או BSA).
לייבל השעית התא שהושגה עם הנוגדנים הרצויים.
1. Resuspend דגימות 100 μl / מדגם של תערובת המכילה מ"ל 2 מיקרוגרם / של aCD16 / CD32 (שיבוט 2.4G2) מדולל FBS 1% PBS.
2. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C על מנת לחסום את הלא ספציפי המחייב של הנוגדנים הרצויים באמצעות קולטני Fc.
3. מוסיף את הנוגדנים מצוינים בטבלה1.
  1. להכין תערובת דילול נוגדנים הרצוי 100 μl / מדגם של FBS 1% PBS בריכוז של 4 מיקרוגרם / מ"ל.
  2. הוספת 100 μl של תמהיל מוכן בשלב 3.2.3.1 לטעום כל כך בצינור, יהיו בהיקף של 200 μl של תערובת נוגדנים בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל.
4. דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C ו לכסות מפני אור.
לשטוף עם 1 מ"ל של FBS 1% PBS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 XG, וזורקים supernatant ו resuspend ב 300 μl של FBS 1% PBS.
הוסף DAPI בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור במשך 10 דקות.
ניתוח הדגימות מתקבלות על ידי FACS.
1. על מנת לבודד לויקוציטים, להשתמש באסטרטגיה gating הבאה:
  1. ראשית לחסל את כל תאים מתים על ידי gating על אוכלוסיית DAPI-.
  2. Singlets בחר בעלילה FSC-A לעומת FSC W כמצוין באיור 1
  3. שער התאים המבוססים על גודל גרעיניות טיפוסי של לויקוציטים עניין.
  4. בחר CD45 + תאים בעלילה FSC-A CD45 כמצוין באיור 1.
2. להבחין בין אוכלוסיות שונות של לויקוציטים ידי הביטוי של סמנים משטח כדלקמן:
  1. זהה DCs כמו CD11c ⁺ MHC II ⁺ תאים. אלו ניתן לנתח לאחר מכן על מנת לתת ביטוי CD207 להבחין בין תאי לנגרהנס ואת CD207 + Dermal DCs מ CD207- Dermal DCs.
  2. זהה המקרופאגים כמו CD64 + F4 / 80 + תאים.
  3. לזהות תאי B כמו CD19 + MHCII + תאים.
  4. לזהות תאי T כמו CD8 + או CD4 + תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עור מאזור אחר של הגוף היה מתעכל פי הפרוטוקול המתואר ומוכתם נוגדנים המצוינים. אסטרטגית gating מתוארת באיור 1. ראשית בחרו תאי חיים (תאי DAPI-), אז שער על singlets (FSC-A לעומת-W FSC) ועל תאים עם מורפולוגיה הלימפוציטים (FSC-A לעומת SSC-A). כאשר הדבר מתבקש, CD45 ⁺ תאים ממקור hematopoietic נבחרים.

DCs מסומנים עם אנטי CD11c, -MHCII, ו -CD45 נוגדנים, המקרופאגים מזוהים F4 / 80 ⁺ CD64 ⁺ CD45 ⁺ תאים, תאי B כמו CD19 ⁺ CD45 ⁺ MHCII ⁺ תאים, לימפוציטים מסוג CD4 ⁺ T כמו CD4 ⁺ CD45 ⁺ תאים, ו- CD8 ⁺ T לימפוציטים כמו CD8 ⁺ CD45 ⁺ תאים (איור 2).

שיטה זו ג.א.arantees כדאית גבוהה של האוכלוסייה מתעכלת עם יותר מ -50% של תאי קיימא כוללים (DAPI-) בכל אזורי העור כי מנותחים (איור 3 א). אינדיקציה לגבי מספר CD45 ⁺ תאים להניב לס"מ ² מתואר באיור 3 ב.

אומדן המספר הכולל של DCS, המקרופאגים, תאי B ו- CD4 ⁺ או CD8 ⁺ T תאים השגה מן העיכול של 1 ס"מ ² של העור העכבר מופיע באיור 3C.

איור 1. זיהוי של תאים ממוצא hematopoietic ב תא בודד השעיות העור. תא בודד השעיות שהוכתמו DAPI ואת נוגדן אנטי CD45. בין תאים חיים (DAPI שלילי), singlets (FSC-A vs FSC-H) מנותחים לבחור תאים עם לויקוציטים מורפולוגיה (FSC-A לעומת-A SSC). תאים ממוצא hematopoietic מזוהים CD45 ^+.

איור 2. ניתוח של תאים חיסוניים נוכח עור העכבר נגזרו מאזורים שונים. תאים הם מגודרים כמצוין באיור 1. DCs מזוהה CD11c ⁺ MHC II ⁺ CD45 ⁺ תאים ומוכתמים מאוחר יותר עם CD207 להבחין בין תאי לנגרהנס ואת CD207 ⁺ עורי DCs מ CD207 ^-; המקרופאגים מזוהים CD64 ⁺ F4 / 80 ⁺ CD45 ⁺ תאים; T לימפוציטים מחולקים CD8 ⁺ CD45 ⁺ תאים מסוג CD4 ⁺ CD45 ⁺ תאים; תאי B מזוהים MHCII ⁺ CD19 ⁺ CD45 ⁺ תאים. אחוזים מכונים תאי CD45 ⁺ הכולל.

איור 3. ניתוח כמותי של התאים החיסוניים נוכח עור עכבר מאזורים שונים (א) אחוז הקיימא. (DAPI ^-) בתאים שמקורם באזורים המצוינים של עור עכבר. (ב) מספרים מוחלטים CD45 ⁺ תאים באזורים שונים של העור העכבר לידי ביטוי במספר תאים לס"מ ² של העור. (ג) הערכת מספר DCS, MΦ, תאי B ו- CD4 ⁺ או CD8 ⁺ T בתאים שמקורם 1 ס"מ ² של העור מפני האזורים הרשומים של העור העכבר.

CD8a

נוֹגְדָן	הַכתָמָה	ריכוז	זְמַן	טֶמפֶּרָטוּרָה
DCsלְעַרְבֵּב
CD11c	PE-Cy7	2 מיקרוגרם / מ"ל	30 דק '	4 ° C
MHC II	פ	"	"	"
CD45	PE-Cy5.5	"	"	"
CD207	APC	"	"	"
מערבבים המקרופאגים
F4 / 80	APC-Cy7	2 מיקרוגרם / מ"ל	30 דק '	4 ° C
MHC II	פ	"	"	"
CD45	PE-Cy5.5	"	"	"
CD64	PE-Cy7	"	"	"
תאי T ו- B מערבבים
פ	2 מיקרוגרם / מ"ל	30 דק '	4 ° C
CD4	APC-Cy7	"	"	"
CD19	APC	"	"	"
CD45	PE-Cy5.5	"	"	"

טבלת 1. אינדיקציות המכתימות של האוכלוסיות השונות של תאי מערכת חיסון לאכלוס העור. שלוש תערובות מצוינות עבור מכתים של DCS, מאקרופאגים לימפוציטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תארנו שיטה להכנת תא בודדת השעיות מאזורי עור עכבר שונים. השיטה של עיכול אמצנו, לא רק נותנת תשואות גבוהות אלא גם משמרת את הביטוי של סמני משטח, שהוא יסוד לניתוח FACS הבא.

שימוש קוקטייל של collagenase I ו- II ו thermolysin, מבטיח יצווה מינימום להבדלים יצוו בפעילות אנזים עושים שיטה זו מאוד לשחזור. שיטות שפורסמו אחרות מסתמכות על קוקטיילי אנזים שונים אך בידינו הם נותנים תשואות נמוכות, וחשוב יותר, הם פחות לשחזור. השיטה שלנו, לעומת זאת, אינה מפלה בין תאים לאכלוס האפידרמיס ותאי לאכלוס הדרמיס. לאור העובדה שבמקרים רבים זה יכול להיות שימושי כדי להבחין בין שני אלה תאים שונים, אנו מפנים את הקורא לעבודות קודמות אלה המשתמשות בשיטות כאלה. ¹⁵

במדגם ניסיון עורנוים מהאוזן והזנב קל יותר לעיכול מאשר עור המטען שבו שכבת השומן תת עורית צריכה להיות מגורדת ביסודיות על מנת להפוך את הדרמיס נגיש קוקטייל האנזים. צעד סיכת דה, אם כי, כמו גם את החיתוך צריך להתבצע במהירות ובעדינות על מנת לשמור על כדאיויות תא. צעד הסרת שומנים ממושכת או משוכלל מדי יכול לגרום נזק תושב תאים חיסוניים העור ולכן לגרום תשואה נמוכה בהרבה וירידה הכדאיות של תאים התאושש.

ראוי גם לציין כי על מנת לשמור על שלמות סמני משטח, לעיכול צריכה להתבצע בתוך נטול בינונית של צמצום סוכנים כגון β-mercaptoethanol. כדי למנוע ניזק בלתי רצוי על פני שטח סמנים, זמן הדגירה צריך להישמר כפי קצר ככל האפשר, ובכל מקרה, לא ממושך במשך יותר מ 90 דקות.

זהירות מיוחדת צריכה, גם, כשדודה מזיגת דגימות עור המעוכל אל תוך התאמִסנֶנֶת. חשוב לשטוף את העור ביסודיות מתעכל כדי לשטוף את התאים המשוחררים לפני לנפץ המדגם מתעכל עם הבוכנה במזרק. עם הצעד הזה מדגם העור נשטף מתאי החיסון המשוחררים במידה אז לא עברו שום מאמץ פיזי יותר. הניפוץ צריך גם להתבצע בעדינות כדי לא לחסל את תאים ושניהם מסננים תא ואת הבוכנה במזרק יש לשטוף ביסודיות על שלב כביסה שלאחר מכן.

עיכול העור יכול להתבצע גם בז 50 מ"ל באמבט מים ב 37 ° C. במקרה זה העור יכול להיות קצוץ מראש ולאחר מכן הכניס לתוך הצינור בז. ראוי לציין, כי דגימות העור צריכות להיות שקועות תמיד חיץ עיכול במהלך הדגירה וכי חלקי אוזן מקלים על צידי צינורות פלקון. כאשר באמצעות צינורות בזים, ולכן, לוודא את חלקי שהות עור קצוץ השקוע בתוך בינוני העיכול.

שיטה זו יכולה להיות שימושית maNY שונה גדרות ניסוי, במיוחד כאשר לומדים עור שאינו דלקתי. במהלך דלקת, נפיחות התרחבות ורקמות לשחרר את מבנה הרקמות ותאי חיסון מדם מגויס מסיבי על העור. היעילות של התאוששות תא היא, וכך, הרבה יותר גבוהה. בתנאים ההומיאוסטטית, דרך יעילה לעכל את מטריקס קולגן החזק של הדרמיס, למעשה, הדרושים על מנת לשחזר את תא החיסון המהווים את הרשת המורכבת לאכלוס העור.

הקורא עשוי להתעניין גם ב סקירה מקיפה המכסה את מוצאם ואת הפנוטיפ של תאים דנדריטים שונים מקרופאגים לאכלוס העור בשני תנאים ההומיאוסטטית ודלקתיות. ¹⁶

בהגדרות ניסויים שונות, חלקים שונים של עור עכבר ניתן לטפל. למשל, במודלי השתלת עור, חלק של הזנב יכול להיות מושתל על הגזע של חית קבלה; כאשר ת'מחקרהיווצרות או חיסון נהלים בצקת גרם, גירויים לעתים קרובות מוזרקים על השודד של עכברים, בעוד האוזן משמשת לעתים קרובות כדי להעריך זיכרון תא T עם מבחני DTH. בשיטה שלנו נוכל וביעילות לחלץ תושב עור תאים חיסוניים ממקומות שונים מה שהופכים את השיטה שלנו שימושית עבור ההגדרה ניסיון של בחירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Supplemented RPMI 1640 medium			RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	resuspend [2.5 mg/ml] in dH₂O; store aliquots at -20 °C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml]
Materials
Surgical Scissors
Surgical Forceps
Surgical Scalpel
35 mm Petri dishes
66 mm Petri dishes
100 mm Petri dishes
70 µm Cell Strainers	BD	352350
Digestion cocktail			Dilute in RPMI 5% FBS
LIberase TM			300 µg/ml
DNAse1			50 U/ml
Antibodies
Name	Company	Clone	Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC