Protocol
Undersøgelse godkendelse: De eksperimentelle protokoller blev godkendt af det italienske sundhedsministerium (Rom, Italien) i henhold til Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609 / EØF i materia di Protezione degli animali utilizzati et fini sperimentali o ad altri fini scientifici."
1. Indhentning hudprøver
- Aflive musen ved cervikal dislokation.
- Øre:
- Klip den hårløse del af ørerne af musen.
- Separat dorsale og ventrale side ved at trække dem fra hinanden med en pincet. Fjern tilbageværende brusk ved forsigtigt at skrabe den indre del af ørerne med pincet.
- Trunk hud:
- Barbere hele huden på dyret, både med en elektrisk barbermaskine og med fine hårfjerningsmidler lotion.
- Afbrød den ønskede hud prøve (fra 2 cm2 op til hele dyrehud).
- Hvis afskære hele dorsale og elvtrale musehud, lave en lodret snit i midten af musen tilbage og derefter skåret langs grænserne af den barberede områder omkring muse krop.
- Forsigtigt adskille huden fra peritoneum og rygmuskler, holde prøven huden stadig med pincet mens adskillelse hudprøven med de lukkede runde kanter spidser af en kirurgisk saks eller en skalpel.
- Der fremstilles en 100 mm cellekultur-plade indeholdende 10 ml iskold PBS.
- Fjerne subkutant fedt ved at nedsænke hudprøven i PBS i pladen fremstillet i trin 1.3.3 og skrabe huden prøven med pincet.
- Hale:
- Afbrød halen af musen.
- Lav en lodret snit på halen med en kirurgisk saks eller kirurgisk skalpel, startende fra haleroden og nå til spidsen af halen.
- Brug pincet til at frigøre huden fra halen. Grib kanten af snittet ved haleroden og træk forsigtigt mod spidsen, mens du holderorgan af halen med en pincet.
- Fjern overskydende fedt ved forsigtigt at skrabe prøven huden.
- trædepude
- Klip hele mus fod med kirurgiske sakse. Undgå at skære nogen behåret hud.
- Skære huden af foden på langs fra anklen til begyndelsen af cifrene.
- Hold ankelknoglerne med pincet eller med hånden, mens sensationsprægede huden med en pincet og trække huden mod cifrene, som om at tage ud en handske.
2. Fordøjelse
- Forbered fordøjelsen cocktail fra stamopløsningen (fremstillet som i Materials List) med følgende opskrift: Enzym mix (se Materialer List for specifikationer) 300 pg / ml, DNAse1 50 U / ml. Fortynd i RPMI 5% FBS.
- Hak hudprøver med saks i små stykker i en 35 mm petriskål med 2 ml Fordøjelsen Cocktail (til krop hud: 2 ml Digestion Cocktail hver 2 cm2 af huden, op til 3 ml i alt).
- Der inkuberes ved 37 ° C i 90 minutter. Ryst petriskålen 1-2 gange under inkubation.
- Hæld fordøjede hudprøver på en 70 um cellefilter i 66 mm petriskål indeholdende 1 ml RPMI1640 5% FBS.
- Vask sien med 5 ml RPMI 1640 5% FBS.
- Klem prøven gennem cellen si med et sprøjtestempel.
- Flush stempel, petriskål og si med 20 ml RPMI1640 5% FBS, overførsel til 50 ml rør.
3. Antistoffer og mærkning
- Vask opnåede suspension to gange med 5 ml PBS 1% FBS (eller BSA).
- Mærk den opnåede cellesuspension med de ønskede antistoffer.
- Resuspendere prøverne i 100 pl / prøve af en blanding indeholdende 2 ug / ml aCD16 / CD32 (klon 2.4G2) fortyndet i PBS 1% FBS.
- Inkuber i 15 minutter ved 4 ° C for at blokere ikke-specifik binding af de ønskede antistoffer via Fc-receptorer.
- Tilføj antistofferne anført i tabel1.
- Forbered en blanding fortynding af de ønskede antistoffer i 100 pl / prøve af PBS 1% FBS i en koncentration på 4 pg / ml.
- Tilsæt 100 pi af blandingen fremstillet i trin 3.2.3.1 til hver prøve, således at i røret, vil der være et volumen på 200 pi af antistof blanding ved en endelig koncentration på 2 ug / ml.
- Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C og dække mod lys.
- Vask med 1 ml PBS 1% FBS, centrifugeres i 5 minutter ved 400 xg, supernatanten fjernes, og resuspender i 300 pi PBS 1% FBS.
- Tilføj DAPI i en slutkoncentration på 2 ug / ml og inkuberes ved 4 ° C, beskyttet mod lys i 10 min.
- Analysere de prøver opnået ved FACS.
- For at isolere leukocytter brug bør følgende gating strategi:
- Først at eliminere eventuelle døde celler ved gating på DAPI- befolkning.
- Vælg slåbrokker i FSC-A versus FSC W plot som vist i figur 1
- Gate cellerne baseret på størrelse og granularitet typisk for leukocytter af interesse.
- Vælg CD45 + celler i FSC-A CD45 plot som vist i figur 1.
- Adskille de forskellige populationer af leukocytter ved ekspressionen af overflademarkører som følger:
- Identificer DC'er som CD11c + MHC II + celler. Disse kan senere analyseret for ekspressionen af CD207 at skelne Langerhanske celler og CD207 + Dermal DC'er fra CD207- Dermal DC'er.
- Identificere makrofager som CD64 + F4 / 80 + celler.
- Identificere B celler som CD19 + MHCII + celler.
- Identificere T-celler som CD8 + eller CD4 + -celler.
- For at isolere leukocytter brug bør følgende gating strategi:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hud fra anden region af kroppen blev fordøjet ifølge protokollen beskrevet og farvet med de angivne antistoffer. Gating strategi er afbildet i figur 1. Først vælger levende celler (DAPI- celler), derefter gate på singletter (FSC-A vs. FSC-W) og på celler med lymfocyt morfologi (FSC-A versus SSC-A). Når angivet, er CD45 + -celler fra hæmatopoietisk oprindelse valgt.
DC'er er mærket med anti-CD11 c, -MHCII, og -CD45-antistoffer, er Makrofager identificeret som F4 / 80 + CD64 + CD45 + -celler, B-celler som CD19 + CD45 + MHCII + celler, CD4 + T-lymfocytter CD4 + CD45 + celler og CD8 + -T-lymfocytter som CD8 + CD45 + celler (figur 2).
Denne metode guarantees høj levedygtighed fordøjet befolkning med mere end 50% af de samlede levedygtige celler (DAPI-) i alle regioner i huden, der analyseres (figur 3A). En angivelse af antallet af CD45 + -celler udbytte per cm2 er afbildet i figur 3B.
Et estimat af det totale antal DC'er, makrofager, B-celler og CD4 + eller CD8 + -T-celler kan opnås fra fordøjelsen af 1 cm2 af musehud er angivet i figur 3C.
Figur 1. Identifikation af celler af hæmatopoietisk oprindelse i huden enkelt-cellesuspensioner. Single-cellesuspensioner er farvet med DAPI og anti-CD45-antistof. Blandt levende celler (DAPI-negative), undertrøjer (FSC-A vs FSC-H) analyseres for at vælge celler med leukocyt morfologi (FSC-A versus SSC-A). Celler af hæmatopoietisk oprindelse, identificeres som CD45 +.
Figur 2. Analyse af immunceller til stede i musehud afledt af forskellige regioner. Celler låge som vist i figur 1. DC'er er identificeret som CD11c + MHC II + CD45 + celler og senere farvet med CD207 at skelne Langerhanske celler og CD207 + dermal DC'er fra CD207 -; Makrofager er identificeret som CD64 + F4 / 80 + CD45 + celler; T-lymfocytter opdeles i CD8 + CD45 + -celler og CD4 + CD45 + -celler; B-celler identificeres som MHCII + CD19 + CD45 + celler. Procentdelene er henvist til de totale CD45 + celler.
Figur 3. Kvantitativ analyse af immunceller til stede i musehud fra forskellige regioner (A) Procentdel af levedygtige. (DAPI -) celler afledt fra de angivne regioner i musehud. (B) det absolutte antal CD45 + celler i de forskellige regioner i musehud udtrykt i antal celler pr cm2 af huden. (C) Vurdering antal DC'er, MO, B-celler og CD4 + eller CD8 + T-celler afledt fra 1 cm2 af hud fra de angivne regioner i musehud.
| antistof | Farvning | Koncentration | Tid | Temperatur |
| DCsBlande | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 pg / ml | 30 min | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| makrofager Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 pg / ml | 30 min | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| T- og B-celler Mix | PE | 2 pg / ml | 30 min | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Tabel 1. Indikationer for farvningen af de forskellige populationer af immunceller befolker huden. Tre blandinger er indiceret til farvning af DC'er, makrofager og lymfocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af enkelt-cellesuspensioner fra forskellige mus hudområder. Metoden med fordøjelsen, vi har vedtaget, giver ikke kun høje udbytter, men også bevarer udtryk for overflademarkører, som er grundlæggende for den efterfølgende FACS-analyse.
Anvendelsen af en cocktail af collagenase I og II og thermolysin, garanterer minimum batch til batch forskelle i enzymaktivitet gør denne metode meget reproducerbar. Andre offentliggjorte metoder er afhængige af forskellige enzym cocktails, men i vores hænder, de giver lavere udbytte og, endnu vigtigere, er mindre reproducerbare. Vores metode er imidlertid ikke diskriminerer mellem celler befolker epidermis og celler befolker dermis. Da det i mange tilfælde kunne være nyttigt at skelne mellem disse to forskellige rum, vi leder læseren til disse tidligere værker, der bruger sådanne metoder. 15
Det er vores erfaring hudprøves fra øret og hale er lettere at fordøje end stammen huden, hvor det subkutane fedt lag skal være grundigt skrabet for at gøre dermis tilgængelige for enzymet cocktail. Den affedtende trin, selvom såvel som bør udføres skæringen hurtigt og forsigtigt for at opretholde cellernes levedygtighed. En forlænget eller for grundig affedtning trin kan resultere i beskadigelse af den residente immunceller i huden og derfor resultere i meget lavere udbytte og nedsat levedygtighed af de indvundne celler.
Det skal også bemærkes, at for at bevare integriteten af overflademarkører, bør fordøjelsen udføres i et medium uden reduktionsmidler, såsom β-mercaptoethanol. For at undgå uønsket beskadigelse overflademarkører, bør inkubationstiden holdes så kortere som muligt og under alle omstændigheder ikke forlænges i mere end 90 min.
Særlig forsigtighed bør, også taget når der hældes de fordøjede hudprøver ind i cellensi. Det er vigtigt at vaskes grundigt fordøjet huden for at vaske væk de befriede celler før smadrer spaltet prøve med sprøjtestemplet. Med dette skridt prøven hud vaskes fra de befriede immunceller, som så ikke undergår nogen mere fysisk stress. Sønderslagningen bør også udføres forsigtigt for ikke at dræbe eventuelle celler, og både cellesigte og sprøjtestemplet skal vaskes grundigt i det efterfølgende vasketrin.
Hud fordøjelse kan også udføres i en 50 ml falcon i et vandbad ved 37 ° C. I dette tilfælde huden kan hakkes forhånd og anbringes derefter i Falcon-rør. Bemærk at hudprøverne altid bør nedsænkes i digestionspuffer under inkubationen, og at ørestykker klæbe til siderne af Falcon-rør. Ved brug af falk rør, derfor skal du sørge for stykker af hakkede hud ophold nedsænket i fordøjelsen medium.
Denne metode kan være nyttig i maNY forskellige eksperimentelle indstillinger, især når de studerer ikke-betændt hud. Under inflammation, vasodilation og væv hævelse løsne strukturen af vævet og immunceller fra blod er massivt rekrutteret til huden. Effektiviteten af celleindvinding er således meget højere. I homeostatiske tilstande, en effektiv måde at fordøje den stramme collagen matrix af dermis er faktisk nødvendigt for at genvinde den immuncelle udgør det komplekse net befolker huden.
Læseren kan også være interesseret i en omfattende gennemgang, der dækker oprindelse og fænotype af forskellige dendritiske celler og makrofager befolker huden i både homøostatiske og inflammatoriske tilstande. 16
I forskellige eksperimentelle indstillinger, kan forskellige dele af musehud behandles. For eksempel i huden transplantationsmodeller, en del af halen kunne transplanteres på stammen af en modtager animalske; når studying ødemdannelse eller immuniseringsfremgangsmåder, er stimuli ofte injiceres på trædepuden af mus, medens øret ofte anvendes til at vurdere T-celle-hukommelse med DTH-assays. Med vores metode kan vi effektivt udtrække huden bosiddende immunceller fra forskellige steder gør vores metode anvendelig til den eksperimentelle indstilling af valg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
- Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
- Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W.
- Shen, W., et al. Adaptive immunity to murine skin commensals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).
- Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance. Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).
- Pan, J., et al. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).
- Vitali, C., et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells. Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).
- Azukizawa, H., et al. Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).
- Idoyaga, J., et al. Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction. The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).
- Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis. Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).
- Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. The multitasking organ: recent insights into skin immune function. Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).
- Rosenblum, M. D., et al. Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues. Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).
- Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. 177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues. Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).
- Kim, B. S., et al. TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation. Science translational medicine. 5 (170), (2013).
- Gopinathan, K. M. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).
- Sandrine, H., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).
- Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin. Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).
