Protocol
Studie goedkeuring: De experimentele protocollen werden door het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (Rome, Italië) volgens de Decreto goedgekeurde legislativo 27 gennaio 1992 n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609 / EEG in materia di protezione degli animali utilizzati een fini sperimentali ad altri fini scientifici."
1. Verkrijgen huidmonsters
- Euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie.
- Oor:
- Knip de haarloze deel van de oren van de muis.
- Aparte rug- en buikzijde door ze uit elkaar te trekken met een pincet. Verwijder eventuele kraakbeen door voorzichtig schrapen de binnenkant van de oren met een tang.
- Trunk huid:
- Scheer de hele huid van het dier, beide met een elektrisch scheerapparaat en met delicate ontharingscrème lotion.
- Snijd de gewenste sample huid (van 2 cm 2 tot en met de hele huid dier).
- Als het afsnijden van de gehele rug- en ventraal muis huid, maak een verticale snede in het midden van de muis heen en snijd langs de grenzen van de geschoren gebieden rond de muis lichaam.
- Voorzichtig scheiden de huid van het buikvlies en rugspieren, nog steeds houden van de huid monster met de tang terwijl het scheiden van het monster huid met het gesloten rondje kanten tips van een chirurgische schaar of een scalpel.
- Bereid een 100 mm celkweek plaat met 10 ml ijskoude PBS.
- Elimineer onderhuids vet door onderdompeling van het monster huid in PBS in de plaat bereid in stap 1.3.3 en schrapen het monster huid met een tang.
- Staart:
- Afgesneden van de staart van de muis.
- Voeg een verticale snede op de staart van een chirurgische schaar of chirurgische scalpel, vanaf de staartbasis en tot aan de punt van de staart.
- Gebruik een tang om de huid van de staart los. Pak de rand van de snede aan de basis van de staart en trek in de richting van de punt terwijl u deorgaan van de staart met een tang.
- Verwijder overtollig vet door zachtjes schrapen van de huid monster.
- struikrover
- Knip de hele muis voet met chirurgische schaar. Het vermijden van het snijden van alle behaarde huid.
- Snijd de huid van de voet in langsrichting van de enkel naar het begin van de cijfers.
- Houd de enkels met een pincet of met de hand, terwijl grijpen de huid met een tang en trek de huid in de richting van de cijfers als het opstijgen een handschoen.
2. Spijsvertering
- De voorbereiding van de spijsvertering cocktail van de voorraad-oplossing (bereid zoals in Materials List) met het volgende recept: Enzyme mix (zie Materialen List voor specificaties) 300 ug / ml, DNAse1 50 U / ml. Verdund in RPMI 5% FBS.
- Hak monsters huid met een schaar in kleine stukjes in een 35 mm petrischaal met 2 ml Spijsvertering Cocktail (Voor trunk huid: 2 ml Spijsvertering Cocktail elke 2 cm 2 van de huid, tot 3 ml totaal).
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 90 min. Schud de petrischaal 1-2 keer tijdens de incubatie.
- Pour gedigereerd huidmonsters op een 70 urn zeef in cel 66 mm petrischaal met 1 ml RPMI1640 5% FBS.
- Was de zeef met 5 ml van RPMI 1640 5% FBS.
- Knijp het monster door de cel zeef met een zuiger.
- Flush plunjer petrischaaltje zeef met 20 ml RPMI1640 5% FBS, overbrengen naar 50 ml buis.
3. Antilichamen en Labeling
- Was de verkregen suspensie tweemaal met 5 ml PBS 1% FBS (of BSA).
- Label de verkregen celsuspensie met de gewenste antilichamen.
- Resuspendeer de monsters in 100 ul / monster van een mengsel dat 2 ug / ml aCD16 / CD32 (kloon 2.4G2) verdund in PBS 1% FBS.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C om niet-specifieke binding van de gewenste antilichamen via Fc-receptoren te blokkeren.
- Voeg de in tabel antilichamen1.
- Bereid een mengsel verdunnen de gewenste antilichamen in 100 ul / monster PBS 1% FBS in een concentratie van 4 ug / ml.
- Voeg 100 ul van het mengsel bereid in stap 3.2.3.1 elk monster zodat in de buis, zal een volume van 200 gl antilichaam mix in een eindconcentratie van 2 ug / ml.
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C en dekken tegen licht.
- Wassen met 1 ml PBS 1% FBS, centrifugeer 5 min bij 400 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer in 300 ul PBS 1% FBS.
- Voeg DAPI bij een uiteindelijke concentratie van 2 pg / ml en incuberen bij 4 ° C, beschermd tegen licht gedurende 10 minuten.
- Analyseer de monsters verkregen door FACS.
- Om leukocyten te isoleren, gebruikt u de volgende gating strategie:
- elimineren eerst alle dode cellen door gating op de DAPI- bevolking.
- Selecteer singlets in de FSC-A vs. FSC W plot zoals aangegeven in figuur 1
- De Poort van de cellen op basis van grootte en granulariteit typisch voor de leukocyten van belang.
- Selecteer CD45 + cellen in de FSC-A CD45 grafiek zoals in figuur 1.
- Onderscheid de verschillende populaties van leukocyten door de expressie van oppervlaktemarkers als volgt:
- Identificeren DCs als CD11c + MHC II + cellen. Deze kunnen later worden geanalyseerd op de expressie van CD207 op Langerhanscellen en CD207 + dermale DCs onderscheiden CD207- Dermaal DCs.
- Identificeer Macrofagen als CD64 + F4 / 80 + cellen.
- B-cellen identificeren als CD19 + MHCII + cellen.
- Identificeer T-cellen als CD8 + of CD4 + cellen.
- Om leukocyten te isoleren, gebruikt u de volgende gating strategie:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Huid ander gebied van het lichaam werd verteerd volgens de beschreven en gekleurd met de aangegeven antilichamen protocol. De gating strategie is in Figuur 1. Eerst selecteert levende cellen (DAPI- cellen) en poort aan singlets (FSC-A versus FSC-W) en lymfocyt cellen met morfologie (FSC-SSC-A vs. A). Wanneer aangegeven, worden CD45 + cellen van hematopoietische afkomst geselecteerd.
DCs zijn voorzien van anti-CD 11 c, -MHCII en -CD45 antilichamen, worden geïdentificeerd als macrofagen F4 / 80 + CD64 + CD45 + cellen, B-cellen en CD19 + CD45 + MHCII + cellen, CD4 + T-lymfocyten en CD4 + CD45 + cellen en CD8 + T-lymfocyten als CD8 + CD45 + cellen (figuur 2).
Deze methode guarantees hoge levensvatbaarheid van de bevolking gedigereerd met meer dan 50% van de totale levensvatbare cellen (DAPI-) in alle gebieden van de huid die zijn geanalyseerd (Figuur 3A). Een indicatie van het aantal CD45 + cellen opbrengst per cm 2 is in Figuur 3B.
Een schatting van het totale aantal DCs, macrofagen, B-cellen en CD4 + of CD8 + T-cellen verkregen uit de vertering van 1 cm2 van de huid van muizen is in figuur 3C.
Figuur 1. Identificatie van cellen van hematopoietische afkomst in de huid eencellige suspensies. Enkelvoudige celsuspensies werden gekleurd met DAPI en het anti-CD45 antilichaam. Onder levende cellen (DAPI-negatief), singlets (FSC-A vs FSC-H) geanalyseerd met cellen waar leukocyten selecteren morfologie (FSC-A vs. SSC-A). Cellen van hematopoietische oorsprong worden geïdentificeerd als CD45 +.
Figuur 2. Analyse van immuuncellen in de huid van muizen afkomstig uit verschillende gebieden. Cellen worden afgesloten, zoals aangegeven in figuur 1. DCs worden geïdentificeerd als CD11c + MHC II + CD45 + cellen en later gekleurd met CD207 tot Langerhanscellen en CD207 + onderscheiden dermal DCs van CD207 -; Macrofagen zijn geïdentificeerd als CD64 + F4 / 80 + CD45 + cellen; T lymfocyten worden onderverdeeld in CD8 + CD45 + cellen en CD4 + CD45 + cellen; B-cellen worden geïdentificeerd als MHCII + CD19 + CD45 + cellen. Percentages worden verwezen naar de totale CD45 + cellen.
Figuur 3. Kwantitatieve analyse van de immuuncellen in de huid van muizen van verschillende gebieden (A) Percentage levensvatbare. (DAPI -) cellen afkomstig van de genoemde gebieden van muizenhuid. (B) Absolute aantallen CD45 + cellen in de verschillende gebieden van de huid van muizen, uitgedrukt in aantal cellen per cm2 huid. (C) Schatting aantal DCs, MO, B-cellen en CD4 + of CD8 + T-cellen afkomstig van 1 cm2 van huid tegen de aangegeven gebieden van muizenhuid.
| Antilichaam | kleuring | Concentratie | Tijd | Temperatuur |
| DCsMengen | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 ug / ml | 30 minuten | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| macrofagen Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 ug / ml | 30 minuten | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| T- en B-cellen Mix | PE | 2 ug / ml | 30 minuten | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Tabel 1. Indicaties voor de kleuring van de verschillende populaties van immuuncellen vullen van de huid. Drie mengsels zijn geïndiceerd voor kleuring van DCs, macrofagen en lymfocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een werkwijze beschreven voor de bereiding van enkelvoudige celsuspensies van verschillende muizen huidgebieden. De werkwijze van de spijsvertering we hebben aangenomen, geeft niet alleen een hoge opbrengst, maar behoudt ook de expressie van oppervlakte-markers, dat fundamenteel is voor de volgende FACS analyse.
Het gebruik van een cocktail van collagenase I en II en thermolysine, garandeert een minimale charges verschillen in enzymactiviteit maken deze werkwijze zeer reproduceerbaar. Andere gepubliceerde methoden een beroep doen op verschillende enzym cocktails, maar in onze handen geven ze lagere opbrengsten en, nog belangrijker, zijn minder reproduceerbaar. Onze werkwijze is echter geen onderscheid tussen cellen vullen van de epidermis en de dermis cellen bevolken. Omdat in veel gevallen nuttig onderscheid tussen deze twee compartimenten kunnen zijn, leiden we naar deze eerdere werken dergelijke methoden. 15
In onze ervaring huid steekproefs van het oor en staart zijn makkelijker te verteren dan de stam huid waar de onderhuidse vetlaag moet grondig worden geschraapt om de dermis te bereiken om het enzym cocktail. Het ontvetten stap, hoewel evenals moeten snijden snel en voorzichtig worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cellen te handhaven. Een verlengde of te ontvet stap kan leiden tot schade aan de immuuncellen resident in de huid en dus tot veel lagere opbrengst en een verminderde levensvatbaarheid van de cellen teruggewonnen.
Ook moet worden opgemerkt dat de integriteit van oppervlaktemarkers bewaren, moet de vertering worden uitgevoerd in een medium zonder reductiemiddelen zoals β-mercaptoethanol. Om ongewenste beschadiging van de oppervlakte markers voorkomen moet de incubatietijd kortere mogelijk en in elk geval bewaard, niet verlengd met meer dan 90 min.
Bijzondere aandacht dient te worden, ook, genomen bij het gieten van de verteerde huid monsters in de celzeef. Het is belangrijk om de gedigereerde huid grondig wassen om de vrijgemaakte cellen wegspoelen voor het inslaan van de gedigereerde monster met de zuiger. Met deze stap wordt de huid monster wordt gewassen uit de bevrijde immuuncellen die vervolgens geen enkele meer fysieke stress ondergaan. Het neerslaan dient ook voorzichtig worden uitgevoerd om alle cellen te doden en niet zowel de cel zeef en de zuiger grondig in de daaropvolgende wasstap worden gewassen.
Huid digestie kan worden uitgevoerd in een valk in een waterbad 50 ml bij 37 ° C. In dit geval kan de huid vooraf gesneden en vervolgens in de Falcon buisje. Merk op dat de huid monsters moet altijd worden bij de spijsvertering buffer tijdens de incubatie onder water en dat oor-stukken kleven aan de wanden van de valk buizen. Bij het gebruik van valk buizen, dus zorg ervoor dat de stukken gehakte huid verblijf ondergedompeld in de vertering medium.
Deze methode kan nuttig zijn in many verschillende experimentele instellingen, in het bijzonder bij het bestuderen van niet-ontstoken huid. Tijdens inflammatie, vasodilatatie en weefsel zwelling maak de structuur van het weefsel en immuuncellen uit bloed massaal gerekruteerd voor de huid. De efficiëntie van cel herstel is dus veel hoger. In homeostatische omstandigheden een effectieve manier om de strakke extracellulaire matrix van de dermis verteren is in feite noodzakelijk om de immuuncellen die het complexe netwerk vullen van de huid te herstellen.
De lezer zou ook geïnteresseerd in een uitgebreid overzicht dat de oorsprong en de fenotype van verschillende dendritische cellen en macrofagen bevolken de huid in zowel homeostatic en inflammatoire aandoeningen dekt zijn. 16
In verschillende experimentele instellingen, kunnen verschillende delen van de huid van muizen behandeld. Bijvoorbeeld, bij huidtransplantatie modellen, een deel van de staart kan worden getransplanteerd op de stam van een ontvangende dier; wanneer studying oedeemvorming of immunisatie procedures worden vaak geïnjecteerd stimuli op de voetzool van muizen, terwijl het oor vaak gebruikt om T-cel geheugen DTH testen beoordelen. Met onze methode kunnen we efficiënt te halen huid ingezeten immuuncellen vanuit verschillende locaties maken van onze methode bruikbaar is voor de experimentele setting van de keuze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
- Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
- Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W.
- Shen, W., et al. Adaptive immunity to murine skin commensals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).
- Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance. Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).
- Pan, J., et al. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).
- Vitali, C., et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells. Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).
- Azukizawa, H., et al. Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).
- Idoyaga, J., et al. Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction. The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).
- Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis. Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).
- Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. The multitasking organ: recent insights into skin immune function. Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).
- Rosenblum, M. D., et al. Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues. Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).
- Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. 177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues. Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).
- Kim, B. S., et al. TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation. Science translational medicine. 5 (170), (2013).
- Gopinathan, K. M. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).
- Sandrine, H., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).
- Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin. Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).
