单细胞悬液的细胞荧光分析从不同的鼠标皮肤区域准备

Protocol

研究批准：实验方案得到根据Decreto卫生意大利外交部（意大利，罗马）批准legislativo 27 gennaio 1992年，N。 116“Attuazione德拉Direttiva六百○九分之八十六/ CEE在时珍迪protezione阿布鲁animali utilizzati一个FINI sperimentaliØ广告altri FINI scientificiñ。”

1.获取皮肤样本

1. 安乐死颈椎脱位鼠标。
2. 耳：
   1. 切出鼠标的耳朵无毛部分。
   2. 独立的背部和腹部的侧拉他们除了用钳子。轻轻刮钳耳的内部部分除去任何残留的软骨。
3. 躯干部皮肤：
   1. 都与电动剃须刀和精致的化妆水脱毛剃须动物的整皮。
   2. 切断所需的皮肤样品（约2cm ²至整个动物皮肤）。
      1. 如果切断了整个背部和VEN二尖瓣小鼠皮肤，使在小鼠沿着围绕鼠标主体的剃区域的边界背面，然后切的中间垂直切割。
      2. 轻轻地在肌肤由腹膜和背部肌肉分开，用钳子保持皮肤样本，同时还与分离手术剪刀或手术刀的封闭圆边提示皮肤样本。
   3. 制备含有10ml冰冷的PBS的100毫米细胞培养板。
   4. 通过浸没在步骤1.3.3准备好的平板在PBS的皮肤样本，并刮用钳子皮肤样本消除皮下脂肪。
4. 尾巴：
   1. 切断小鼠的尾部。
   2. 就用外科剪刀或外科手术刀，从尾基部开始并延伸到尾部的末端的尾部的垂直切割。
   3. 使用镊子取下从尾部皮肤。抢切的尾巴根部的边缘，向前端按住轻轻一拉用钳子尾体。
   4. 轻轻刮皮肤样本中删除任何多余的脂肪。
5. 暴客
   1. 切出手术剪整个鼠标脚。避免切割任何毛茸茸的皮肤。
   2. 从脚踝到的数字开始切脚的皮肤纵向。
   3. 用镊子或用手抓住的同时用钳子皮肤握住脚踝骨头和拉扯皮肤朝向数字仿佛脱下手套。

2.消化

1. 准备从原液（如材料清单制备）用下列配方的消化鸡尾酒：酶混合物（参见规格材料清单）300微克/毫升，DNAse1 50单位/毫升。稀释RPMI 5％FBS。
2. 砍皮肤样本，用剪刀小块，放入35毫米的培养皿用2毫升消化鸡尾酒（对于躯干部皮肤：皮肤2毫升消化鸡尾酒每2 ^平方厘米，最高至3ml总数）。
3. 孵育在37℃下90分钟。轻轻摇动培养皿孵化期间的1-2倍。
4. 倾消化皮肤样品上的70微米的细胞滤网66含有1ml RPMI 1640 5％FBS的毫米的培养皿。
5. 用5毫升RPMI 1640 5％FBS的清洗滤网。
6. 通过用注射器柱塞细胞过滤挤压样品。
7. 冲洗柱塞，培养皿，用20ml的RPMI1640 5％FBS的滤网，转移到50ml管中。

3.抗体和标记

1. 用5毫升PBS中的1％FBS（或BSA）洗所得悬浮液两次。
2. 标记与所需的抗体所获得的细胞悬浮液。
   1. 重悬的样品在100μl/含有2微克/毫升aCD16 / CD32（克隆2.4G2）的在PBS中的1％FBS的稀释的混合物的样品。
   2. 为了阻止通过Fc受体的所需抗体的非特异性结合孵育15分钟，4℃。
   3. 加在表中指出的抗体1。
      1. 制备混合稀释PBS中的1％FBS的100微升/样品中的所需抗体在4微克/ ml的浓度。
      2. 添加在步骤3.2.3.1制备各样品，使得在管中，将有200微升抗体混合物的体积，以2微克/毫升的最终浓度混合100微升。
   4. 孵育在4℃下30分钟，并从光盖。
3. 用1ml PBS中的1％FBS的，离心洗5分钟，在400 xg离心，弃去300微升PBS中的1％FBS的上清，重悬。
4. 添加DAPI以2微克/毫升的最终浓度和孵育在4℃，避光进行10分钟。
5. 分析通过FACS获得的样品。
   1. 为了分离白细胞，使用下面的门控策略：
      1. 首先通过门控的DAPI-人口消除任何死细胞。
      2. 在FSC-A与FSCW¯¯情节选择单线， 如图1所示
      3. 栅极基于尺寸和粒度典型感兴趣的白细胞的细胞。
      4. 在图1所示的FSC-A地块CD45选择CD45 +细胞。
   2. 通过表面标志物的表达区分白细胞的不同人群如下：
      1. 确定的DC作为的CD11c ⁺ MHC II ⁺细胞。这些可以稍后分析CD207的表达，从CD207-真皮树突区分朗格汉斯细胞和CD207 +真皮树突。
      2. 检测巨噬细胞作为CD64 + F4 / 80 +细胞。
      3. 鉴定B细胞CD19 + MHCII +细胞。
      4. 确定T细胞的CD8 +或CD4 +细胞。

Representative Results

从身体的不同区域的皮肤根据描述并用所示抗体染色的协议消化。门控策略如图1所示。首先选择汗衫（FSC-A与FSC-W），并与淋巴细胞形态（FSC-A与SSC-A）细胞活细胞（DAPI-细胞），然后门。当指出，从造血系统起源的CD45 ⁺细胞都被选中。

的DC标记与抗CD11c，-MHCII和-CD45抗体，巨噬细胞被标识为F4 / 80 ⁺ CD64 ⁺ CD45 ⁺细胞，B细胞为CD19 ⁺ CD45 ⁺ MHCII ⁺细胞，CD4 ⁺ T淋巴细胞的CD4 ⁺ CD45 ⁺细胞和CD8 ⁺ T淋巴细胞作为CD8 ⁺ CD45 ⁺细胞（ 图2）。

这种方法顾arantees与该被分析的肌肤（ 图3A）的各区域的总活细胞（DAPI-）的50％以上的经消化的人口的高存活率。 CD45 ⁺细胞的数目的指示每cm ²在图3B中描绘屈服。

从小鼠皮肤1厘米²的消化获得的总数的DC，巨噬细胞，B细胞和CD4 ⁺或CD8 ⁺ T细胞的过程中估计图3C中指示。

图1.鉴定皮肤单细胞悬液造血起源的细胞的。单细胞悬浮液已用DAPI染色和抗CD45抗体。在活细胞（DAPI阴性），背心（FSC-A对FSC-H）进行分析，以选择具有白细胞细胞形态（FSC-A与SSC-A）。造血起源的细胞被鉴定为CD45 ^+。

如在图1所示本在小鼠皮肤不同区域衍生的免疫细胞的图2分析。细胞门控。的DC被鉴定为CD11c的⁺的MHC II ⁺ CD45 ⁺细胞和后来与CD207染色以区分朗格汉斯细胞和CD207 ⁺真皮的DCs从CD207 ^- ;巨噬细胞被确定为CD64 ⁺ F4 / 80 ⁺ CD45 ⁺细胞; T淋巴细胞在CD8 ⁺ CD45 ⁺细胞和CD4 ⁺ CD45 ⁺细胞分裂; B细胞识别为MHCII ⁺ CD19 ⁺ CD45 ⁺细胞。百分比被称为总CD45 ⁺细胞。

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图3.存在于不同地区的小鼠皮肤免疫细胞的定量分析 （ 一 ）可行的百分比。（DAPI ^{- ）}小鼠皮肤的指示区域的细胞。 （B）的绝对数量的CD45 ⁺细胞在小鼠皮肤的不同区域中每皮肤厘米²细胞的数目来表示。 （C）的DC，MΦ，B细胞和CD4 ⁺或从皮肤为1cm ²从小鼠皮肤的所指示的区域衍生的CD8 ⁺ T细胞的估计数目。

CD8A

抗体	染色	浓度	时间	温度
树突状混合
表面CD11c	PE-Cy7的	2微克/毫升	30分钟	4℃
MHC II	PE	“	“	“
CD45	PE-经Cy5.5	“	“	“
CD207	APC	“	“	“
巨噬细胞混合
F4 / 80	APC-Cy7的	2微克/毫升	30分钟	4℃
MHC II	PE	“	“	“
CD45	PE-经Cy5.5	“	“	“
CD64	PE-Cy7的	“	“	“
T细胞和B细胞的混合
PE	2微克/毫升	30分钟	4℃
CD4	APC-Cy7的	“	“	“
CD19	APC	“	“	“
CD45	PE-经Cy5.5	“	“	“

表1. 适应症为免疫细胞填充皮肤的不同群体的染色。三个混合物被表示为的DC，巨噬细胞和淋巴细胞的染色。

Discussion

我们已经描述了用于从不同小鼠皮肤区域制备单细胞悬液的方法。我们通过消化的方法中，不仅使高收率而且还保留了表面标记物的表达，这对于随后的FACS分析的基础。

使用胶原酶I和II和嗜热菌的鸡尾酒，保证最小批量中酶的活性使这种方法高度可再现批次差异。其他公开的方法依赖于不同的酶鸡尾酒但在我们手中，他们给较低的产率，更重要的，是不太可重复的。我们的方法，但是，不细胞填充表皮和细胞填充真皮区分。因为在许多情况下，它可以是这两个不同的隔室之间进行区分是有用的，我们直接读者使用这样的方法，这些以往的作品^。15

根据我们的经验皮肤样本从耳和尾部s为更容易比躯干皮肤其中皮下脂层具有以使真皮访问酶鸡尾酒彻底刮下消化。脱脂工序中，虽然以及切割应迅速并轻轻以维持细胞活力进行。延长的或过彻底的脱脂步骤可导致对免疫细胞驻留在皮肤损伤，因此，导致低得多的产率，降低了回收的细胞的生存力。

还应当指出的是保持表面标记的完整性，消化应该在还原剂如β巯基乙醇的培养基中缺乏来执行。以避免不必要的损坏表面标记，孵育时间应保持尽可能短，并且在任何情况下，不延长超过90分钟。

应特别注意，也浇消化皮肤样本进入细胞内拍摄时过滤器。它彻底清洗消化皮肤以便与针筒柱塞砸消化样品之前洗去游离的细胞是重要的。与此步骤中的皮肤样品是从那么不进行任何更多的物理应力释放的免疫细胞洗涤。粉碎也应以不杀死任何细胞和两个细胞过滤网和所述针筒柱塞，应在随后的洗涤步骤中被彻底冲洗轻轻进行。

皮肤消化可以在水浴50毫升猎鹰在37℃下也进行。在这种情况下，皮肤可以预先切碎，然后放入falcon管。需要注意的是皮肤样品应该总是在消化缓冲液中孵育期间浸没和耳片粘到falcon管的两侧。当使用猎鹰管，因此，要确保在消化中淹没切碎皮肤保持件。

此法可在马有用纽约州不同的实验设置，研究非发炎的皮肤尤其是当。在炎症过程中，血管舒张和组织肿胀松开组织和从血液中免疫细胞的结构大规模招募到皮肤上。细胞回收的效率，因此，要高得多。在稳态条件下，实际上，根据需要为了恢复构成复合网填充皮肤免疫细胞消化真皮的紧胶原基质的有效方法。

读者可能也有兴趣进行全面审查，涵盖了产地和不同的树突状细胞和巨噬细胞填充两种稳态和炎症条件下，皮肤的表型^。16

在不同的实验设置，小鼠皮肤的不同部分可以治疗。例如，在皮肤移植模型，尾巴的一部分，可以对一个接收动物的躯干移植;学习在当克水肿形成或免疫程序，刺激经常注射对小鼠足垫，而耳经常用于评估与DTH测定T细胞记忆。随着我们的方法，我们可以有效地使可供选择的实验设置我们的方法有用的不同位置提取的皮肤驻地的免疫细胞。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Supplemented RPMI 1640 medium			RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml]
Materials
Surgical Scissors
Surgical Forceps
Surgical Scalpel
35 mm Petri dishes
66 mm Petri dishes
100 mm Petri dishes
70 µm Cell Strainers	BD	352350
Digestion cocktail			Dilute in RPMI 5% FBS
LIberase TM			300 µg/ml
DNAse1			50 U/ml
Antibodies
Name	Company	Clone	Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC