Summary
Mieloma multiplo (MM), le cellule umane richiedono il microambiente favorevole cellule mesenchimali e componenti della matrice extracellulare per la sopravvivenza e la proliferazione. Abbiamo stabilito un vivo pollo modello embrione con cellule di mieloma e mesenchimali umane trapiantate per studiare gli effetti dei farmaci anti-tumorali sulla crescita del tumore, l'invasione e l'angiogenesi.
Abstract
Il mieloma multiplo (MM), una malattia delle cellule del plasma maligne, resta incurabile e nuovi farmaci sono necessari per migliorare la prognosi dei pazienti. A causa della mancanza del microambiente dell'osso e fattori di crescita auto / paracrino cellule MM umane sono difficili da coltivare. Pertanto, non vi è un urgente bisogno di stabilire una corretta in vitro e in sistemi di coltura in vivo per studiare l'azione di nuove terapie sulle cellule umane di MM. Presentiamo qui un modello di crescere cellule di mieloma multiplo umano in un ambiente 3D complesso in vitro e in vivo. Linee cellulari di MM OPM-2 e RPMI-8226 sono state trasfettate per esprimere la GFP transgene e sono stati coltivati in presenza di cellule mesenchimali umane e collagene di tipo I matrice come sferoidi tridimensionali. Inoltre, sferoidi sono stati innestati sulla membrana corioallantoidea (CAM) di embrioni di pollo e la crescita del tumore è stata monitorata mediante microscopia a fluorescenza stereo. Entrambi i modelli consentono lo studio del romanzo dru terapeuticogs in un ambiente 3D complesso e la quantificazione della massa tumorale dopo omogeneizzazione di innesti in un GFP-ELISA specifico transgene. Inoltre, le risposte angiogenici dell'ospite e l'invasione delle cellule tumorali nel tessuto ospite soggiacente possono essere monitorate quotidianamente da un microscopio stereo e analizzati mediante immunoistochimica contro le cellule tumorali umane (Ki-67, CD138, Vimentin) o cellule murali ospiti che coprono i vasi sanguigni (desmin / ASMA).
In conclusione, il sistema permette onplant studiare crescita cellulare MM e l'angiogenesi in un ambiente 3D complesso e permette lo screening per composti terapeutici mirati sopravvivenza e la proliferazione delle cellule di MM.
Protocol
Secondo la legge austriaca, e l'Ufficio di animali da laboratorio benessere del servizio sanitario pubblico embrioni aviaria degli Stati Uniti non sono considerati animali vertebrati vivi fino hatching.The NIH Office of Laboratory Animal Welfare ha fornito indicazioni scritte in questo settore (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm e NIH Pubblicazione n .: 06-4515).
1. Colture Cellulari e lentivirali trasfezione
- Linee Cultura MM cellule OPM-2, RPMI-8226 e cellule staminali mesenchimali umane da midollo osseo in mezzo RPMI1640, integrato con 10% di siero fetale bovino vitello e 100 UI / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e glutammina 2 mM in presenza 5% di CO 2 a 37 ° C.
- Trasfettare 5 x 10 6 cellule HEK 293FT con mix virale imballaggio (9 mg) DNA e 3 mg pLenti6 / V5 dest eGFP vettore per l'uso di 30 microlitri di reagente liposomiale trasfezione e medie trasfezione (10 ml). Rimuovere medio trasfezione dopo 12 ore eaggiungere 10 ml DMEM con 10% di siero di vitello e 1% di aminoacidi non essenziali (NEAA).
- Dopo 5 giorni, raccogliere surnatanti di cellule HEK293FT dopo centrifugazione di cellule nuoto (1.000 XG, 5min). Determinare titolo virale mediante real time PCR come descritto altrove 28.
- Trasfettare 1 x 10 6 cellule di MM con particelle lentivirali eGFP (1 x 10 5 particelle) in un piatto 24 bene in mezzo di crescita completa. Dopo 3 giorni, iniziare il processo di selezione aggiungendo 2 ug / ml blasticidin al mezzo di coltura. Per il eGFP lentivirus disponibile in commercio, usare 500 ug / ml di neomicina.
- Dopo 2 settimane di selezione, grappoli di eGFP esprimono cellule di MM apparirà; raccogliere le cellule per centrifugazione (1.000 xg, 5 min) e di espandersi come OPM-2 eGFP e RPMI-8226 sottolinee eGFP per esperimenti (sezione 2 e 3).
2. 3D Multiplo modello mieloma Spheroid
- Tipo I Freddo collagene soluzione e 10 x DMEM on ghiaccio.
- Mescolare 1/10 Volume di 10 x DMEM medio in matrice di collagene; aggiungere NaOH (0,2 N) per neutralizzare la soluzione acida di collagene ad un valore pH di 7,4; immagazzinare il collagene / soluzione a medio sul ghiaccio.
- Mescolare linee cellulari di MM transgeniche (OPM-2 eGFP o RPMI-8226 eGFP; 250.000 per sferoide,) con cellule umane mesenchimali (50.000 cellule / sferoide, vale a dire, il 30 microlitri drop).
- Miscela di cellule Centrifuga in provette da 15 ml (1000 xg, 5min), aggiungere freddo miscela di collagene preparato (1 ml) al pellet e mescolare bene (con 1.000 punta microlitri).
- Subito pipetta 30 microlitri della miscela di collagene / cella (con 100 microlitri punta) in una piastra a 24 pozzetti su parafilm sterile e lasciare miscela di cellule / collagene polimerizzare per 30 minuti a 37 ° C (vedere Figura 1A).
- Sferoidi MM sovrapposizione con mezzo di coltura contenente 1 ml 1, 10 e 100 nM bortezomib (vedi Figura 1B).
- Dopo 72 h di incubazione a 37 ° C, sferoidi documento dafluorescenza stereomicroscopia (vedi Figura 1C).
- Trasferire ogni spheroid dall'uso di pinze con ganasce piatte larghe in un tubo di reazione per la misura di GFP (vedere Figura 1D).
3. 3D mieloma multiplo Xenograft modello in CAM
- Incubare uova di gallina in un incubatore speciale per uova di volatili a 37 ° C e 70% di umidità per tre giorni.
- Successivamente, uova aperte e trasferimento embrioni sterilizzati con barche etanolo, quadrato, di 10 cm in plastica di peso con la cultura di cellule coperchio piatto e incubare "ex ovo" per altri sei giorni, in modo che la CAM è in grado di sviluppare (vedere Figura 2A).
- Tipo I freddo collagene soluzione e 10 x DMEM su ghiaccio, mescolare 1/10 volume di 10 x terreno DMEM nella matrice di collagene, Aggiungere NaOH (0,2 N) per neutralizzare la soluzione acida di collagene ad un valore pH di 7,4; immagazzinare il collagene / soluzione a medio sul ghiaccio.
- Mescolare linee cellulari di MM transgenici (OPM-2 o eGFPRPMI-8226 eGFP; 250.000 per sferoide,) con cellule mesenchimali umane (50.000 cellule / sferoide).
- Centrifugare le cellule in 15 ml provette (1.000 XG, 5min, per ciascun composto di prova 1 fiala), aggiungere 1 ml di freddo miscela di collagene preparata con la droga (a concentrazione di lavoro desiderato) al pellet e mescolare bene (con 1.000 punta microlitri).
- Inserire collagene gocce (30 ml ciascuno) su parafilm in 6 ben pate per 30 min per permettere la polimerizzazione della matrice extracellulare a 37 ° C.
- Transfer "onplants" dal punto 3.6 con l'uso del forcipe alla superficie trattata del CAM (2 cm da embrione) di 9 giorni di embrioni di pollo (4 onplants per ogni embrione di pollo, si veda la Figura 2B)
- Dopo 5 giorni di crescita in vivo in un incubatore uovo alla 37 ° C e 70% di umidità, xenotrapianti documento per fluorescenza stereomicroscopia (vedere la Figura 2C). Euthanize embrioni di pollo da ipotermia a 4 ° C in frigorifero per 5h.
- Rimuovere xenotrapianti con tessuto CAM soggiacente da una forbice oftalmica e pinze con ganasce piatte larghe. Usali per la misura di GFP (sezione 4, vedi Figura 2D) o per l'analisi immunoistochimica dei vasi sanguigni e / o cellule tumorali invadono (sezione 5).
4. Quantificazione di eGFP proteine mediante ELISA
- Trasferire ogni sferoide MM o xenotrapianto asportato in 0,5 ml RIPA buffer contenente 200 mcg / ml inibitori della proteasi.
- Omogeneizzare sferoide / xenotrapianto con un omogeneizzatore tessuto sul ghiaccio.
- Eseguire tre congelamento / scongelamento-cicli in azoto liquido e 37 ° C bagnomaria.
- Centrifugare omogenato a 4 ° C per 20 min (12,000 g) e memorizzare supernatanti.
- Diluire i campioni 1:20 in tampone (200 microlitri) del kit ELISA. Misurare GFP livelli da un GFP commerciale ELISA Kit utilizzando anticorpi biotinilati anti-GFP, secondo il protocollo del produttore.
5. ImmunohiAnalisi stochemical dei vasi sanguigni e invadere le cellule tumorali
- Fissare xenotrapianti asportati con area CAM in paraformaldeide al 4% O / N a 4 ° C.
- Inserire xenotrapianti fissi in cassette incorporamento e trasferirli in una stazione embedding tessuto con una serie alcool crescente graduata (50%, 70%, 80%, 95% di etanolo, xilolo e paraffina; ogni passo 60 min).
- Xenotrapianti Sezione (5 micron) mediante l'uso di un microtomo rotativo da banco. Cuocere sezioni di paraffina sui vetrini O / N a 56 ° C.
- Deparaffinare le sezioni di una serie graduata alcool riduzione acqua bidistillata (xilolo, 95%, 80%, 70%, 50% di etanolo, acqua bidistillata; ciascun passo 10 min).
- Eseguire recupero dell'antigene in un bagno d'acqua (95 ° C, 20 min) con una soluzione di recupero dell'antigene (tampone citrate-; pH 7,0; volume di 100 microlitri).
- Bloccare l'attività perossidasica endogena con 100 microlitri 3% H 2 O 2 / metanolo per 30 min.
- Sezioni di blocco in PBS contenenteSiero bovino fetale al 10% per 45 min (volume 100 ml).
- Stain per 1 ora con 100 microlitri di anticorpo primario (1 ug / ml) diluito in PBS contenente siero fetale di vitello 1% a RT.
- Dopo aver lavato 3 volte in PBS, incubare per 1 ora con l'anticorpo secondario biotinilato (0,1 mg / ml) in PBS contenente siero fetale di vitello 1% a RT.
- Dopo aver lavato 3 volte in PBS effettuare reazione colorata dalla soluzione avidina / biotina-complesso (ABC) e la diaminobenzidina (DAB) substrato secondo le istruzioni del produttore.
- 5.11. Smettere di reazione trasferendo sezioni doppio acqua distillata, di contrasto con ematossilina e montare le sezioni con un mezzo di montaggio sintetico.
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Representative Results
L'analisi in vitro dei composti target in 3D mieloma multiplo test spheroid
A causa delle limitazioni di coltura di cellule primarie umane di MM in vitro abbiamo stabilito nuovi modelli di coltura in vitro 3D per linee cellulari MM umane che fanno uso di una matrice extracellulare crescita e cellule mesenchimali umane primarie di supporto dal midollo osseo (Figura 1A, B). Linee cellulari di MM transgenici EGFP consentono la visualizzazione e la quantificazione della MM massa tumorale dopo la crescita 3D in sferoidi. Entrambe le linee cellulari di MM OPM-2 eGFP e RPMI-8226 eGFP state coltivate per 3 giorni in presenza di concentrazioni crescenti (1- 100 nM) di bortezomib e tumori sono state visualizzate mediante l'espressione di GFP in un microscopio a fluorescenza stereo (Figura 1C) . Massa di cellule del tumore è stata quantificata dopo omogeneizzazione di sferoidi e misurazione contenuti eGFP da un GFP-ELISA (Figura 1D).
Nell'analisi vivo dei composti target in molteplici xenotrapianti mieloma in embrioni di pollo
Tre giorni di embrioni di pollo vecchio state coltivate ex ovo per 6 giorni e al giorno 9 utilizzati per l'innesto di cellule di MM (Figura 2A). EGFP cellule del mieloma transgeniche (OPM-2 eGFP) insieme con cellule mesenchimali di midollo osseo umani sono stati incorporati in collagene di tipo I, come componente della matrice extracellulare. Il bortezomib sostanza obiettivo è stato applicato localmente a 1 nMol (Figura 2b). Per ogni animale 4 "onplants" sono state innestate sulla membrana corioallantoidea (CAM) di embrioni di pollo. Dopo 5 giorni, xenotrapianti MM formano i tumori che potrebbero essere visualizzati mediante l'espressione di eGFP. Rispetto ai controlli, bortezomib inibito la crescita delle cellule di MM in xenotrapianti. Innesti visualizzate meno MM verde di massa delle cellule tumorali (Figura 2C). Xenotrapianti singoli MM da thdiversi animali ree (n = 12) sono stati asportati, omogeneizzati e, successivamente, misurati con GFP ELISA. Nel confronto diretto ai controlli xenotrapianti bortezomib trattati hanno avuto una significativa riduzione di massa di cellule di mieloma (Figura 2D).
Nell'analisi vivo delle risposte angiogenici e l'invasione di xenotrapianti mieloma in embrioni di pollo
Risposte angiogeniche intorno onplants possono essere osservati da stereomicroscopia. Vascolarizzazione di xenotrapianti è stata significativamente ridotta in trattati con farmaci xenotrapianti (1 nMol Plitidepsin, Figura 3). Risposte angiogeniche sono stati quantificati contando vasi sanguigni germinazione in onplant come descritto per il saggio spugna di gelatina da Ribatti et al. 21.
Per l'analisi di invasione, xenotrapianti sono stati asportati con l'area adiacente CAM. Xenotrapianti sono stati fissati, inclusi in paraffina e sezioni preparati (figura 4 (Figura 4).
Figura 1. 3D affetti da mieloma multiplo Spheroids. (A) Generazione di OPM-2 eGFP e RPMI-8226 sferoidi eGFP con cellule primarie umane di midollo osseo mesenchimali e collagene di tipo I, come componente della matrice extracellulare. (B) Spheroids sono state incubate con terreno di coltura e rispettiva concentrazione di bortezomib (1- 100 sferoidi nM). (C) mm sono state coltivate per 3 giorni e fotografati con un microscopio stereo-fluorescenza. Bar indicano 500 micron. (D) sph Singoloeroids sono stati omogeneizzati in un tampone di lisi e, successivamente, calcolati in GFP ELISA. Concentrazioni GFP di singoli sferoidi sono stati calcolati (n = 5, media ± SEM). Stelle indicano valori di p <0,05; Co. = controllo; Bzb = bortezomib. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. mieloma multiplo dello xenotrapianto Model. (A) Un giorno di sviluppo 9 embrioni ex ovo di pollo sono stati utilizzati per esperimenti di innesto. (B) OPM-2 eGFP e RPMI-8226 eGFP sono stati miscelati con cellule primarie mesenchimali del midollo osseo umano, il collagene di tipo I, come componenti della matrice extracellulare e con 1 Nm di bortezomib. Dopo sferoidi solidificazione (n = 4) sono stati innestati sulla membrana corioallantoidea dell'embrione di pollos. (C) Dopo cinque giorni MM innesti nel CAM può essere visualizzato mediante l'espressione di eGFP. Xenotrapianti possono essere fotografati quotidianamente da uno stereo microscopio fluorescenza. Bar indicano 500 micron. (D) xenotrapianti MM singoli stati asportati con il tessuto CAM soggiacente, omogeneizzati in tampone di lisi e misurato in un GFP ELISA. Concentrazioni GFP di tumori singoli sono stati calcolati (n = 12, Media ± SEM). Stelle indicano valori di p <0,05; Bzb = bortezomib. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Analisi dell'angiogenesi mieloma. Xenotrapianti MM (OPM-2 eGFP) sono stati documentati cinque giorni dopo il trapianto il CAM di embrioni di pollo. In confronto a controllare innesti, treatment con plitidepsin (1nMol, n = 10) sono stati rilevati tumori superficialmente crescita che erano meno vascolarizzato da tessuto CAM. I vasi sanguigni che crescono ai onplants (rossi) sono stati contati come illustrato nel modello grafico dei tipi di vasi sanguigni. Bar indicano 1 mm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Analisi di invasione delle cellule di mieloma. L'analisi immunoistochimica di xenotrapianti MM (OPM-2 eGFP) con tessuto ospite CAM soggiacente (bortezomib-trattati rispetto ai controlli). Cellule proliferanti MM umane macchia positivo per Ki-67, CD138 e Vimentina e invadono come gruppi di cellule ospitano tessuti. I vasi sanguigni di pollo sono macchiati di marcatori di cellule murale ASMA (le navi più grandi e delle arterie) e desmina (capillari). Magnificatisu 200x, asterischi indicano vasi sanguigni del CAM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici per refrattario MM richiede meno tempo e costosi sistemi in vivo per valutare la sensibilità di cellule MM umane ai farmaci. Finora, solo pochi sistemi in vivo sono a disposizione per la valutazione preclinica di nuove terapie anti-mieloma. Tutti loro hanno i loro limiti per lo screening su larga scala di librerie di composti 29.
I migliori modelli attuali di cellule di MM umane sono altamente immuni topi con deficit 7,13,30 ed embrioni di tacchino 29. Sia il mouse SCID e modelli di xenotrapianto embrionali aviaria possono essere utilizzati per studiare la biologia del MM e per testare i composti terapeutici. Tuttavia, i sistemi murini hanno diverse limitazioni, tra genotipo inbred, procedure tecnicamente esigenti, lunghi periodi di osservazione e costi elevati.
In questo studio, uno sferoide romanzo 3D e modello di xenotrapianto aviaria è presentato per lo studio della biologia cellulare MM umana che comporta la presenza di mes umanienchymal cellule staminali e della matrice extracellulare come componenti di supporto. Cellule MM dipendono fortemente dalla rispettiva microambiente, cioè la presenza di fattori di crescita stroma-derivato, citochine e componenti ECM per sopravvivere e proliferare 31-33. Inoltre, i farmaci potrebbero essere inefficiente o visualizzare un'attività alterata quando le cellule del mieloma sono protette dal loro microambiente locali 31,34.
Rispetto ai modelli murini, 3D descritto in vitro e in sistemi modello in vivo non sono costosi, rapida e facile da maneggiare. Inoltre, il trapianto di 3D MM sferoidi di embrioni di pollo permette l'analisi di angiogenesi indotta da mieloma. Una limitazione del nostro sistema è il breve tempo di crescita cellulare MM e quindi, l'analisi di metastasi alle ossa aviaria non è possibile. Un ulteriore limite dei nostri modelli è che lavoriamo con applicazione topica di farmaci nel CAM che potrebbero non riflettere applicazioni sistemiche e fatturato droga / modifica da parte degli enzimi epatici. InInoltre, un tasso di sopravvivenza di circa il 50% fino a quando l'innesto è stato osservato a causa di ex ovo condizioni di crescita di embrioni di pollo. Per quanto riguarda i marcatori endoteliali per l'analisi IHC, la maggior parte degli indicatori utilizzati nella sezione umano e il mouse per colorare le cellule endoteliali non sono specifici di vasi sanguigni nel pollo. Pertanto, si consiglia la colorazione per i marcatori di cellule murale desmin / ASMA o l'iniezione di lectine in embrioni di pollo 35. Non tutte le linee di cellule di mieloma umane disponibili crescerà invasivo in tessuto ospite pollo e potrai crescita superficiale. Questo si tradurrà in tessuto distrutto dopo il taglio sezioni sul microtomo. Inoltre, particolare attenzione (antibiotici selezione) dovrebbe essere presa che le cellule transfettate non perdono l'espressione GFP transgene nel tempo, a causa di riarrangiamenti genetici permanenti o processi di metilazione del DNA.
In conclusione, il nostro pollo embrione modello di xenotrapianto di cellule di MM umane con il supporto stromale fornisce un riproducibile e prevedibile il modello in vivo per STUcrescita umana dy cellule MM e l'angiogenesi. Questo ha descritto il modello MM può facilitare velocemente in vivo processi di screening di farmaci anti-MM, contribuendo a ridurre i tempi di sviluppo ei costi di nuovi farmaci. Con ulteriori misure migliorative, come materiale osseo di sostituzione, di matrice ECM complesso e citochine il sistema potrebbe essere migliorato per testare terapie anche contro i campioni dei pazienti. Questo è un prerequisito per la medicina personalizzata cancro e collaudo di sensibilità ai farmaci nei singoli pazienti MM refrattari.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
- Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
- Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
- Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv.Hematol. 2014, 864058 (2014).
- Chauhan, D., et al. A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma. Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).
- Kuehl, W. M. Mouse models can predict cancer therapy. Blood. 120 (2), 238-240 (2012).
- Nefedova, Y., Gabrilovich, D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies. Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).
- Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations. Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).
- Dazzi, F., et al. Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation. Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).
- Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
- Feuring-Buske, M., et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).
- Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
- Li, M., et al. Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect. Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).
- Tassone, P., et al. A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma. Blood. 106 (2), 713-716 (2005).
- Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Drug discovery through stem cell-based organoid models. Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).
- Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).
- Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds). Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J.Vis.Exp. (41), (2010).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Kern, J., et al. GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib. Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp.Cell Res. , (2014).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J.Vis.Exp. (33), (2009).
- Kobayashi, T., et al. A chick embryo model for metastatic human prostate cancer. Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).
- Koop, S., et al. Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate. Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).
- Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines. BMC.Cancer. 12, 501 (2012).
- Martowicz, A., et al. EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth. Mol.Cancer. 12, 56 (2013).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. 6, 34 (2006).
- Farnoushi, Y., et al. Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos. Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).
- Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability. Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).
- Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets. Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).
- Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies. J.Vis.Exp. (85), (2014).
- Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal. Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).
- Jilani, S. M., et al. Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature. J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).
