Summary
Menneskelige myelomatose (MM) celler krever støttende mikromiljøet av mesenchymale celler og ekstracellulære matrise komponenter for overlevelse og formering. Vi har etablert en in vivo-modell kyllingembryo med innpodet humane myelom og mesenchymale celler for å studere virkningene av kreftlegemidler på tumorvekst, invasjon og angiogenese.
Abstract
Multippel myelom (MM), en plasmacelle ondartet sykdom, forblir uhelbredelig og nye medikamenter er nødvendig for å forbedre prognosen for pasienter. På grunn av mangel på benet mikromiljøet og auto / parakrine vekstfaktorer menneske MM celler er vanskelige å dyrke. Derfor er det et presserende behov for å etablere skikkelig in vitro og in vivo kultursystemer for å studere virkningen av nye behandlingsformer på menneske MM celler. Her presenterer vi en modell for å dyrke humane multiple myelomceller i et komplekst miljø 3D in vitro og in vivo. MM cellelinjer OPM-2 og RPMI-8226 ble transfektert til å uttrykke transgenet GFP og ble dyrket i nærvær av human mesenchymale celler og kollagen type-I matrise som tredimensjonale klumper. I tillegg ble sfæroider podet på chorioallantoic membran (CAM) av kyllingembryoer og tumorvekst ble overvåket ved stereo fluorescens mikroskopi. Begge modellene tillater studier av romanen terapeutisk drugs i et komplekst miljø 3D og kvantifisering av tumorcellemasse etter homogenisering av grafts i et transgen-GFP-spesifikk ELISA. Videre kan angiogene responser hos verten og invasjon av tumorceller inn i det nedenforliggende vertsvevet bli overvåket daglig med et stereomikroskop og analysert ved immunhistokjemisk farging mot humane tumorceller (Ki-67, CD138, vimentin) eller vertsceller som dekker vegg blodkar (desmin / ASMA).
Som konklusjon, gjør det mulig for systemet å studere onplant MM cellevekst og angiogenese i et komplekst miljø 3D og muliggjør screening for nye terapeutiske forbindelser rettet mot overlevelse og proliferasjon av celler MM.
Protocol
Ifølge den østerrikske loven, og Office of Laboratory Animal Welfare av de amerikanske helsevesenet avian embryoer regnes ikke som levende virveldyr før hatching.The NIH Office of Laboratory Animal Welfare har gitt skriftlig veiledning på dette området (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm og NIH Publikasjon nr .: 06-4515).
1. Cell Culture og Lentiviral Transfeksjon
- Culture MM cellelinjer OPM-2, RPMI-8226 og humane stamceller fra benmarg i RPMI1640 medium, supplert med 10% bovint føtalt kalveserum og 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 2 mM glutamin i nærvær av 5% CO2 ved 37 ° C.
- Transfektere 5 x 10 6 293FT HEK-celler med virale emballasje blanding (9 ug) DNA og 3 ug pLenti6 / V5 dest EGFP-vektoren ved anvendelse av 30 pl liposomal transfeksjon reagens og transfeksjon medium (10 ml). Fjern transfeksjon medium etter 12 timer ogtilsettes 10 ml DMEM-medium med 10% bovint kalveserum og 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA).
- Etter 5 dager, samle supernatants av HEK293FT celler etter sentrifugering av svømme celler (1000 xg, 5 min). Bestem viral titer av real time PCR som beskrevet andre steder 28.
- Transfektere en 10 x 6 mm celler med EGFP lentivirale partikler (1 x 10 5 partikler) i en 24-brønners plate i fullstendig vekstmedium. Etter 3 dager, starter utvelgelsesprosessen ved tilsetning av 2 ug / ml blasticidin til kulturmediet. For den kommersielt tilgjengelige EGFP lentivirus, bruker 500 pg / ml neomycin.
- Etter to uker med valget, vil klynger av EGFP uttrykker MM celler vises; samle celler ved sentrifugering (1000 xg, 5 min) og utvide dem som OPM-2 EGFP og RPMI-8226 EGFP underlinjer for eksperimenter (seksjon 2 og 3).
2. 3D-multippelt myelom Spheroid Model
- Chill kollagen type-I-løsning og 10 x DMEM on is.
- Bland 1/10 Volume 10 x DMEM medium i kollagen matrise; legge NaOH (0,2 N) for å nøytralisere sure kollagen oppløsningen til en pH-verdi på 7,4; butikken kollagen / medium løsning på is.
- Bland transgene MM cellelinjer (OPM-2 EGFP eller RPMI-8226 EGFP, 250.000 per celleklump,) med menneskelige mesenchymalceller (50.000 celler / celleklump, dvs. 30 mL dråpe).
- Sentrifuger celleblanding i 15 ml rør (1000 xg, 5 min), tilsett kaldt forberedt kollagen blanding (1 ml) til cellen pellet og bland godt (med 1000 mL tips).
- Umiddelbart pipette 30 ul av kollagen / celle blanding (med 100 ul tip) i en 24-brønners plate i sterile parafin film og tillate celle / kollagen blandingen å polymerisere i 30 minutter ved 37 ° C (se figur 1A).
- Overlay MM kuler med 1 ml kultur medium som inneholder 1, 10 og 100 nM bortezomib (se figur 1B).
- Etter 72 timers inkubering ved 37 ° C, dokument sfæroider avfluorescens stereomikroskopi (se figur 1C).
- Overfør hver sfæroid ved bruk av pinsett med bred flat kjever i et reaksjonsrør for måling av GFP (se figur 1D).
3. 3D multippelt myelom Xenotransplantat Model i CAM
- Inkuber kylling egg i en spesiell inkubator i avian egg ved 37 ° C og 70% fuktighet i tre dager.
- Deretter, for å åpne egg og overførings embryoer sterilisert med etanol, firkantet, 10-cm plastveieskip med cellekulturplate lokket og inkuber "ex ovo" for ytterligere seks dager, slik at CAM er i stand til å utvikle seg (se figur 2A).
- Chill kollagen type-I-løsning, og 10 x DMEM på is, bland 1/10 volum av 10 x DMEM-medium inn i kollagenmatriksen, til NaOH (0,2 N) for å nøytralisere sure kollagenoppløsning til en pH-verdi på 7,4; butikken kollagen / medium løsning på is.
- Bland transgen MM cellelinjer (OPM-2 EGFP ellerRPMI-8226 EGFP; 250.000 per celleklump,) med menneskelige mesenchymalceller (50000 celler / spheroid).
- Sentrifuger cellene i 15 ml rør (1000 xg, 5 min, for hver testforbindelse 1 ampulle), tilsett 1 ml kald forberedt collagen blanding med medikamentet (i ønsket arbeidskonsentrasjon) til cellepelleten og bland godt (med 1000 mL spiss).
- Plasser kollagen dråper (30 ul hver) på parafilm i en 6 brønners pate i 30 min for å tillate polymerisering av den ekstracellulære matriks ved 37 ° C.
- Transfer "onplants" fra trinn 3.6 ved bruk av pinsett til den ubehandlede overflaten av CAM (2 cm vekk fra embryo) i 9 dager gamle kyllingembryoer (4 onplants for hver kylling embryo, se figur 2B)
- Etter 5 dagers vekst in vivo i en egg-inkubator ved 37 ° C og 70% fuktighet, dokument xenotransplantater ved fluorescens stereomikroskopi (se Figur 2C). Avlive kylling embryoer ved hypotermi ved 4 ° C i kjøleskapet i 5 timer.
- Fjern xenografts med underliggende CAM vev av en oftalmisk sakse og tang med brede flate kjever. Bruk dem for måling av GFP (§ 4, se figur 2D) eller for immunhistokjemisk analyse av blodårer og / eller invaderende tumorceller (seksjon 5).
4. Kvantifisering av EGFP Protein av ELISA
- Overfør hver MM sfæroide eller eksisert xenograft i 0,5 ml RIPA-buffer inneholdende 200 pg / ml protease inhibitorer.
- Homogen spheroid / xenotransplantat med en vevshomogenisator på is.
- Utføre tre frysing / tining-sykler i flytende nitrogen og 37 ° C vannbad.
- Sentrifuger homogenat ved 4 ° C i 20 minutter (12.000 g), og lagre supernatanter.
- Fortynn 1:20 prøvene i analysebuffer (200 ul) av ELISA-kit. Mål GFP-nivåer av en kommersiell GFP ELISA Kit bruker biotinylerte anti-GFP antistoffer, i henhold til produsentens protokoll.
5. Immunohistochemical Analyse av blodårer og Invaderende tumorceller
- Fix skåret xenografts med CAM-området i 4% paraformaldehyde O / N ved 4 ° C.
- Plasser faste xenografts inn innebygging kassetter og overføre dem til en vev embedding stasjon med et økende gradert alkohol serien (50%, 70%, 80%, 95% etanol, xylen og parafin; hvert trinn 60 min).
- § xenotransplantater (5 um) ved bruk av en bord- roterende mikrotom. Bake parafinsnitt på glassplater O / N på 56 ° C.
- Deparaffinize seksjoner fra en avtagende gradert alkohol serie til dobbeltdestillert vann (xylol, 95%, 80%, 70%, 50% ethanol, dobbeltdestillert vann; hvert trinn 10 min).
- Utføre antigen gjenfinning i et vannbad (95 ° C, 20 min) med et antigen henting løsning (citrate- buffer; pH 7,0; volum 100 ul).
- Blokkere endogen peroksidase aktivitet med 100 ul 3% H 2 O 2 / metanol i 30 min.
- Blokkseksjoner i PBS innehold10% føtalt kalveserum i 45 min (volum 100 ul).
- Stain i 1 time med 100 ul av primære antistoff (1 ug / ml) fortynnet i PBS inneholdende 1% føtalt kalveserum ved RT.
- Etter vasking tre ganger i PBS, inkuberes i 1 time med biotinylert sekundært antistoff (0,1 ug / ml) i PBS inneholdende 1% føtalt kalveserum ved RT.
- Etter vasking tre ganger i PBS utføre fargereaksjon med avidin / biotin-kompleks (ABC) og diaminobenzidin (DAB) substratløsning i henhold til produsentens instruksjoner.
- 5.11. Stopp reaksjonen ved å overføre deler til dobbel-destillert vann, counterstain med hematoxylin og montere deler med en syntetisk monteringsmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro analyse av målforbindelsene i 3D multippel myelom sfæroide analyser
På grunn av den begrensning av dyrking av primære humane mm celler in vitro vi etablert nye 3D in vitro kulturmodeller for humane MM cellelinjer som gjør bruk av en ekstracellulær matriks og vekst støttende primære humane mesenchymale celler fra benmarg (figur 1 A, B). EGFP transgen MM cellelinjer tillater visualisering og kvantifisering av MM tumormasse etter 3D vekst i sfæroider. Begge cellelinjene OPM MM-2 EGFP og RPMI-8226 EGFP ble dyrket i 3 dager i nærvær av økende konsentrasjoner (1- 100 nm) av bortezomib, og tumorene ble visualisert ved ekspresjon av GFP i et stereo fluorescens mikroskop (figur 1C) . Tumorcellemassen ble kvantifisert etter homogenisering av kuler og måle EGFP innholdet av en GFP-ELISA (Figur 1D).
In vivo analyse av målforbindelsene i myelomatose xenografter i kyllingembryoer
Tre dagers gamle kyllingembryoer ble dyrket ex ovo for 6 dager og på dag 9 brukes til poding av MM celler (Figur 2A). EGFP transgene myelomcellene (OPM-2 EGFP) sammen med humane benmargs mesenchymalceller ble innebygd i kollagen type-I som ekstracellulære matrise komponent. Målet stoffet bortezomib ble påføres lokalt på en nmol (figur 2B). For hvert dyr 4 "onplants" ble podet på chorioallantoic membran (CAM) av kylling embryoer. Etter 5 dager, MM xenotransplantater dannet tumorer som kan bli visualisert ved ekspresjon av EGFP. Sammenlignet med kontrollene, bortezomib hemmet veksten av MM-celler i xenotransplantater. Grafts vises mindre grønn MM tumorcellemasse (figur 2C). Enkelt MM xenografter fra thRee forskjellige dyr (n = 12) ble skåret ut, homogenisert og deretter målt med ELISA GFP. I direkte sammenligning med kontroller bortezomib-behandlede xenotransplantater hadde en signifikant redusert myelom cellemasse (figur 2D).
In vivo analyse av angiogeniske svar og invasjon av myelom xenografter i kylling embryoer
Angiogenetiske svar rundt onplants kan observeres ved stereomikros. Vaskularisering av xenotransplantater ble betydelig redusert i narkotika-behandlet xenografts (1 nmol Plitidepsin, figur 3). Angiogene responser ble kvantifisert ved telling av blodårer inn i spirende onplant som beskrevet for gelatin-analysen av svampen Ribatti et al., 21.
For analyse av invasjon, ble skåret ut xenografter med det tilstøtende CAM-området. Xenotransplantater ble løst, i parafin og seksjoner forberedt (figur 4 (figur 4).
Figur 1. 3D myelomatose Spheroids. (A) Generering av OPM-2 EGFP og RPMI-8226 EGFP kuler med primære humane benmargs mesenchymale celler og kollagen type-I som ekstracellulære matrise komponent. (B) Spheroids ble inkubert med kulturmedium og respektive konsentrasjonen av bortezomib (1- 100 nM). (C) MM sfæroider ble dyrket i 3 dager og fotografert med et stereo-fluorescens mikroskop. Linjene indikerer 500 mikrometer. (D) Enkelt spheroids ble homogenisert i lyseringsbuffer og deretter måles i en ELISA-GFP. GFP konsentrasjoner av enkelt kuler ble beregnet (n = 5, Mean ± SEM). Stjernene viser p-verdier <0,05; Co = kontroll; BZB = bortezomib. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. multippelt myelom Xenotransplantat Model. (A) på utviklings dag 9 ex-ovo kyllingembryoer ble anvendt for å pode eksperimenter. (B) OPM-2 EGFP og RPMI-8226 EGFP ble blandet med primære humane benmarg mesenchymale celler, kollagen type-I som ekstracellulære matriks-komponenten og med en nM av bortezomib. Etter størkning kulene (n = 4) ble podet på chorioallantoic membranen av kylling embryos. (C) etter 5 dager mm implantater i CAM kan visualiseres ved ekspresjon av EGFP. Xenografts kan bli fotografert daglig av en stereo-fluorescens mikroskop. Linjene indikerer 500 mikrometer. (D) Enkelt MM xenografter ble skåret ut med underliggende CAM vev, homogenisert i lysisbuffer og måles på en GFP ELISA. GFP konsentrasjoner av enkelt svulster ble beregnet (n = 12, Mean ± SEM). Stjernene viser p-verdier <0,05; BZB = bortezomib. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Analyse av myelom angiogenese. MM xenografts (OPM-2 EGFP) ble dokumentert fem dager etter transplantasjonen på CAM av kylling embryoer. I forhold til å kontrollere grafts, treatment med plitidepsin (1nMol, n = 10) resulterte i overfladisk voksende svulster som var mindre vascularized av CAM vev. Blodkar vokser til de onplants (røde) ble tellet som vist i den grafiske modell av blodkartyper. Linjene indikerer en mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Analyse av myelomcelle invasjon. Immunohistokjemisk analyse av MM xenografter (OPM-2 EGFP) med underliggende CAM verten vev (bortezomib-behandlede versus kontroller). Prolifererende menneske MM celler flekken positive for Ki-67, CD138 og vimentin og invadere som cellegrupper vert vev. Chicken blodkar er farget med veggmaleri cellemarkører Asma (større fartøy og arterier) og desmin (kapillærer). Magnificatipå 200x, stjernetegn indikere blodkarene i CAM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av nye terapeutiske midler for ildfast MM krever mindre tidkrevende og kostbare in vivo system for å evaluere følsomheten av humane mm celler til medikamenter. Hittil har bare noen få in vivo systemer er tilgjengelig for den prekliniske evalueringen av nye anti-myelom-terapi. Alle av dem har sine begrensninger for storskala screening av sammensatte bibliotekene 29.
De beste dagens modeller for menneske MM celler er svært immun-mangelfull mus 7,13,30 og kalkun embryoer 29. Både SCID mus og avian embryo xenograft modeller kan brukes til å studere biologi MM og for å teste nye terapeutiske forbindelser. Men murine systemer har flere begrensninger, inkludert innavlet genotype, teknisk krevende prosedyrer, lange observasjonsperioder og høye kostnader.
I denne studien er en ny 3D sfæroide og avian xenotransplantasjonsmodell presentert for å studere human MM cellebiologi som innebærer tilstedeværelse av humane mesenchymal stamceller og ekstracellulære matrise som støttende komponenter. Mm celler sterkt avhengig av deres respektive mikromiljøet, dvs. tilstedeværelse av stroma-avledede vekstfaktorer, cytokiner og ECM-komponenter for å overleve og formere 31-33. I tillegg kan stoffene være ineffektive eller viser endret aktivitet når myelomceller er beskyttet av deres lokale mikromiljøet 31,34.
I forhold til murine modeller, den beskrevne 3D-in vitro- og in vivo-modellsystemer er dyre, rask og lett å håndtere. I tillegg er transplantasjon av 3D-MM sfæroider til kyllingembryoer muliggjør analyse av myelom-indusert angiogenese. En begrensning av systemet vårt er den korte tiden av MM cellevekst og dermed er det ikke mulig analyse av metastaser til avian bein. En ytterligere begrensning av våre modeller er at vi jobber med lokal applikasjon av narkotika i CAM som kanskje ikke nødvendigvis den systemiske applikasjoner og narkotika omsetning / modifikasjon av leverenzymer. IDessuten ble en tilnærmet 50% overlevelsesrate til poding observert på grunn av ex ovo vekstbetingelser kyllingembryoer. Når det gjelder endoteliale markører for IHC analyse, mest markører som brukes i human og mus delen for å flekke endotelcellene er ikke spesifikke for blodårer i kylling. Derfor anbefaler vi farging for de freske cellemarkører desmin / Asma eller injeksjon av lektiner i kylling embryoer 35. Ikke alle tilgjengelige menneskelige myelomcellelinjer vil vokse seg ned i kylling verten vev og vise overfladisk vekst. Dette vil resultere i ødelagt vev etter å kutte deler av mikrotom. Dessuten bør forsiktighet (seleksjons antibiotika) tas som transfekterte celler ikke mister GFP transgene uttrykk innen tid, på grunn av permanente genetiske rearrangements eller DNA metylering prosesser.
Som konklusjon, vår kylling embryo xenograft modell for menneskelig mm celler med stromal støtte gir en reproduserbar og forutsigbar in vivo-modell for å STUdy MM human cellevekst og angiogenese. Dette er beskrevet MM modellen kan lette raskere in-vivo screening prosesser av anti-MM narkotika, bidrar til å redusere utviklingstiden og kostnadene for nye legemidler. Med ytterligere forbedre trinn, slik som ben-erstatning materiale, kompleks ECM matrise og cytokiner systemet kan bli forbedret for testing av terapeutiske midler også mot pasientprøver. Dette er en forutsetning for personlig kreft medisin og prøving av medikamentsensitivitet i enkelte ildfaste MM pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
- Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
- Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
- Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv.Hematol. 2014, 864058 (2014).
- Chauhan, D., et al. A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma. Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).
- Kuehl, W. M. Mouse models can predict cancer therapy. Blood. 120 (2), 238-240 (2012).
- Nefedova, Y., Gabrilovich, D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies. Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).
- Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations. Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).
- Dazzi, F., et al. Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation. Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).
- Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
- Feuring-Buske, M., et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).
- Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
- Li, M., et al. Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect. Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).
- Tassone, P., et al. A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma. Blood. 106 (2), 713-716 (2005).
- Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Drug discovery through stem cell-based organoid models. Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).
- Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).
- Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds). Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J.Vis.Exp. (41), (2010).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Kern, J., et al. GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib. Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp.Cell Res. , (2014).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J.Vis.Exp. (33), (2009).
- Kobayashi, T., et al. A chick embryo model for metastatic human prostate cancer. Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).
- Koop, S., et al. Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate. Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).
- Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines. BMC.Cancer. 12, 501 (2012).
- Martowicz, A., et al. EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth. Mol.Cancer. 12, 56 (2013).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. 6, 34 (2006).
- Farnoushi, Y., et al. Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos. Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).
- Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability. Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).
- Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets. Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).
- Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies. J.Vis.Exp. (85), (2014).
- Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal. Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).
- Jilani, S. M., et al. Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature. J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).
