Summary
인간 다발성 골수종 (MM) 세포는 간엽 세포의 생존과 증식을위한 세포 외 매트릭스 성분의지지 미세 환경을 필요로한다. 우리는 종양의 성장, 침윤 및 혈관 신생에 항암제의 효과를 연구하기 위해 접목 인간 골수종 및 중간 엽 세포와 생체 내 닭 배아 모델을 설립했다.
Abstract
다발성 골수종 (MM), 악성 형질 세포 질환, 난치성 유지 및 신규 약물은 환자의 예후를 개선하기 위해 요구된다. 인해 골 미세 자동 / 분비 성장 인자의 부족으로 인간 MM 세포는 배양하기 어렵다. 따라서, 인간의 MM 세포에 새로운 치료제의 작용을 연구하기 위해 시험 관내 및 생체 내 배양 시스템에서 적절한 확립이 절실히 요구되고있다. 여기서 우리는 시험 관내 및 생체 내에서 복잡한 3D 환경에서 인간 다발성 골수종 세포를 성장 모델을 제시한다. MM 세포주 OPM-2 및 RPMI-8226를 형질 전환 유전자 GFP를 발현하는 형질 감염시키고 인간 중간 엽 세포와 콜라겐의 존재 하에서 배양 하였다 타입 I 입체 타원체로 매트릭스합니다. 더하여, 구 상체는 닭 배아 융모 막 (CAM)에 그래프트 된 종양 성장은 스테레오 형광 현미경에 의해 모니터 하였다. 두 모델 모두 새로운 치료 DRU의 연구를 허용복잡한 3D 환경 및 트랜스 특정 GFP-ELISA에서의 균질화 이식 후 종양 세포 질량의 정량화에 GS. 또한, 직하 숙주 조직으로 호스트 및 종양 세포의 침윤 혈관 신생 반응을 입체 현미경으로 매일 모니터링 및 인간 종양 세포 (기-67, CD138, 멘틴) 또는 호스트 벽화 세포 덮는 혈관에 대해 면역 조직 화학 염색에 의해 분석 될 수있다 (최근 desmin / ASMA).
결론적 onplant 시스템은 복잡한 3 차원 환경에서 MM 세포 성장 및 혈관 신생을 연구 할 수 있으며 MM 세포의 생존과 증식을 치료 표적 신규 화합물에 대한 스크리닝을 가능하게한다.
Protocol
실험 동물 복지의 hatching.The NIH 사무실이이 지역 (HTTP 작성 지침을 제공 할 때까지 오스트리아 법, 미국 공중 보건 서비스 조류 배아의 실험 동물 복지 사무소에 따르면 라이브 척추 동물로 간주되지 않습니다 // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm 및 NIH 출판 번호 : 06-4515).
1. 세포 배양 및 렌티 바이러스 형질
- 문화 MM 세포주 OPM-2, RPMI-8226 및 RPMI1640 배지에서 골수로부터 인간 중간 엽 줄기 세포의 존재에서 10 % 소 태아 혈청, 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM의 글루타민으로 보충 37 ℃에서 5 % CO 2.
- 형질 감염 5 × 30 μL 리포좀 형질 감염 시약과 형질 매체 (10 mL)을 이용하여 바이러스 포장 믹스 (9 μg의) 및 3 μg의 DNA pLenti6 / V5 DEST eGFP는 벡터 6 HEK 293FT 세포. 12 시간 후 형질 매체를 제거하고10 % 소 혈청 및 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA)과 10 ml의 DMEM 배지를 추가한다.
- 오일 후, 수영 세포 (1,000 XG, 5 분)의 원심 분리 후 HEK293FT 세포의 상층 액을 수집합니다. 다른 28 설명 된대로 실시간 PCR에 의해 바이러스 역가를 결정합니다.
- 완전한 성장 배지에서 24 웰 플레이트에 eGFP는 렌티 바이러스 입자 (1 × 10 5 입자) 1 × 10 6 MM 세포를 형질. 삼일 후, 2 μg의가 / ml로 배양 배지에 첨가하여 블라스트 선택 프로세스를 시작한다. 시중에서 판매하는 eGFP는의 렌티 바이러스를 들어, 500 μg의 / ㎖ 네오 마이신을 사용합니다.
- 선택 2 주 후, MM 세포를 표현 eGFP는 클러스터가 나타납니다; 원심 분리 (1,000 XG, 5 분)에 의해 세포를 수집하고 실험 영업 이익률-2 eGFP는 및 RPMI-8226 eGFP는의 서브 라인으로 그들을 확장 (제 2, 3).
2. 3D-다발성 골수종 회전 타원체 모델
- 침착 콜라겐 타입 I 용액 및 10 × DMEM 오N 얼음.
- 콜라겐 매트릭스로 10 × DMEM 배지 1/10 볼륨 믹스; 7.4의 pH 값에 콜라겐 산성 용액을 중화시키기에 NaOH (0.2 N)을 추가; 저장 콜라겐 / 얼음 매체 솔루션입니다.
- 형질 전환 MM 세포주 (영업 이익률-2 eGFP는 또는 RPMI-8226 eGFP는을, 회전 타원체 당 25 만) 혼합 인간 중간 엽 세포 (50,000 세포 / 회전 타원체, 즉, 30 μL 드롭)에 있습니다.
- 15ml의 튜브 (1000 XG, 5 분)에서 원심 분리 세포 혼합물, 세포 펠렛을 차가운 제조 콜라겐 혼합물 (1 ㎖)를 첨가하고, (1000 μL 팁으로) 잘 섞는다.
- 즉시 멸균 파라핀 필름에 24 웰 플레이트 (100 ㎕의 팁)와 콜라겐 / 세포 혼합액 30 μL 피펫 세포 / 콜라겐 혼합물을 37 ℃ (도 1a 참조)에서 30 분 동안 중합 할 수있다.
- 1, 10 및 100 nM의 볼테 조미 브를 포함하는 1 ㎖의 배지와 오버레이 MM의 스페 로이드 (도 1b 참조).
- 37 ° C에서 배양 72 시간 후, 문서 회전 타원체로형광 실체 현미경 (도 1C 참조).
- GFP의 측정에 반응 튜브 내의 넓은 플랫 턱 겸자를 이용하여 각각의 회전 타원체로 이동 (도 1d 참조).
CAM 3. 3D 다발성 골수종 이종 이식 모델
- 3 일 동안 특별한 37 ° C에서 조류 계란 인큐베이터와 70 %의 습도에서 계란을 품어.
- 그 후, 열려있는 계란과 전송 배아는 세포 배양 접시의 뚜껑 에탄올, 광장, 10-CM 플라스틱 무게 보트와 함께 소독하고 캠 (그림 2A 참조) 개발할 수 있도록, 더 육일은 "전 비켜"를 품어.
- 침착 콜라겐 타입 I 용액 및 얼음에 10 × DMEM 7.4의 pH 값으로 산성 콜라겐 용액을 중화 (N 0.2) NaOH를 추가 콜라겐 매트릭스로 10 × DMEM 배지의 1/10 양을 혼합; 저장 콜라겐 / 얼음 매체 솔루션입니다.
- 형질 전환 MM 세포주 (영업 이익률-2 eGFP는 또는 혼합RPMI-8226 eGFP는; 인간 중간 엽 세포와 회전 타원체) 당 250,000 (50,000 세포 / 회전 타원체).
- 15ml의 튜브에서 원심 셀 (1000 XG, 5 분, 각 시험 화합물 1 바이알 용) 세포 펠릿을, (목표 작업 농도) 약물을 1 ㎖를 차가운 준비된 콜라겐 혼합물을 넣고 잘 섞어 (1000 μL의 끝).
- 37 ° C에서 세포 외 기질을 중합 할 수 있도록 30 분 동안 잘 페이트 6 콜라겐 방울 파라 필름에 (30 μL 각)을 놓는다.
- (2cm 떨어진 배아에서) 9 일 된 닭 배아의 캠의 치료 표면에 집게의 사용과 단계 3.6에서 전송 "onplants"(각 닭 배아 4 onplants, 그림 2B 참조)
- 형광 실체 현미경에 의해 생체 내 37 ° C에서 계란 인큐베이터에서 성장과 70 %의 습도, 문서 이종 이식 5 일 후 (그림 2C 참조). 5 시간 동안 냉장고에 4 ° C에서 저체온증으로 닭 배아를 안락사.
- 안과 가위에 의해 바로 아래 CAM 조직과 이종 이식을 제거하고 넓은 평면 턱과 포셉. GFP의 측정을 사용합니다 (제 4 장, 2D 그림 참조) 또는 혈관 및 / 또는 침입 종양 세포 (섹션 5)의 면역 조직 화학 분석.
ELISA에 의해 eGFP는 단백질의 정량 4.
- 0.5 ㎖의 RIPA 버퍼가 200 μg의 / ㎖ 프로테아제 억제제를 포함에 각 MM은 회전 타원체 또는 절제 이종 이식을 전송합니다.
- 얼음에 조직 균질로 회전 타원체 / 이종 이식 균질화.
- 액체 질소에 세 동결 / 해동 사이클 및 37 ° C의 물을 욕조를 수행합니다.
- 20 분 (12,000g) 및 저장 상층 액을 4 ℃에서 원심 분리기 균질.
- 샘플을 ELISA 키트의 분석 버퍼 (200 μL)에 1:20 희석. 제조사의 프로토콜에 따라, 비 오티 닐화 항 GFP 항체를 이용한 ELISA 키트 상업적 GFP-GFP에 의해 레벨을 측정한다.
5. Immunohi혈관에 침입 종양 세포의 stochemical 분석
- 4 ° C에서 / 4 % 파라 포름 알데히드 O에서 N을 CAM 지역과 절제 이종 이식을 수정합니다.
- 매립 카세트에 고정 이종 놓고 증가 등급 알코올 시리즈 (50 %, 70 %, 80 %, 95 % 에탄올, 크 실롤 파라핀 각각 단계 60 분)으로 매립 조직 스테이션에 전송할.
- 벤치 탑 로터리 마이크로톰의 사용에 의해 섹션 이종 이식 (5 μm의). 56 ° C에서 유리 슬라이드의 O / N에 파라핀 섹션 굽는다.
- 이중 증류수 감소 등급 알코올 시리즈 의한 Deparaffinize 섹션 (크 실롤, 95 %, 80 %, 70 %, 50 % 에탄올, 이중 증류수, 각 단계에서 10 분).
- 항원 검색 용액 수조 (95 ° C, 20 분간)에 항원 검색을 수행하여 (버퍼 citrate-하여 pH 7.0, 100 μL 부피 참조).
- 30 분 동안 100 ㎕의 3 % H 2 O 2 / 메탄올 내인성 퍼 옥시 데이즈 활성을 차단.
- PBS를 함유하는 차단 부45 분 (부피 100 μL) 10 % 소 태아 혈청.
- PBS는 RT에서 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 희석 차 항체 (1μg / ㎖) 100 ㎕와 함께 1 시간 동안 얼룩.
- PBS로 3 회 세척 후, PBS는 RT에서 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 비오틴 이차 항체 (0.1 μg의 / mL)로 1 시간 동안 배양.
- PBS로 3 회 세척 한 후 제조자의 지시에 따라 아비딘 / 비오틴 - 복합체 (ABC) 및 디아 미노 벤지딘 (DAB) 기질 용액에 의해 발색 반응을 수행한다.
- 5.11. 헤 마톡 실린으로 두 번 증류수, Counterstain과에 섹션을 전송하여 반응을 중지하고 합성 설치 매체 섹션을 탑재합니다.
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Representative Results
3D 다발성 골수종 타원체 내 분석 대상 화합물의 시험 관내 분석에서
때문에 체외에서 일차 인간 MM 세포 배양의 한계로는 골수에서 세포 성장 매트릭스 및지지 차 인간 중간 엽 세포 이용하게 인간 MM 세포 라인에 대한 새로운 3D 체외 배양 모델을 확립 (도 1a를, B). EGFP 유전자 MM 셀 라인은 회전 타원체의 3D 성장 후 시각화 및 MM 종양 질량의 정량화 할 수 있습니다. 두 MM 세포주 OPM -2- eGFP는 및 RPMI-8226 eGFP는 스테레오 형광 현미경에 GFP의 발현에 의해 가시화 하였다 볼테 조미 브 및 종양의 증가 농도 (1~100 ㎚)의 존재하에 3 일간 배양 하였다 (도 1C) . 종양 세포 덩어리 GFP-ELISA (도 1에 의해 회전 타원체의 균질화 및 측정 eGFP는 콘텐츠 후 정량 하였다D).
닭의 배아에서 다발성 골수종의 이종 이식의 대상 화합물의 생체 분석
세 일된 닭의 배아 6 일 동안과 MM 세포 (그림 2A)의 이식에 사용되는 일 9시 예를 비켜을 배양 하였다. 함께 인간 골수 간엽 세포 EGFP 유전자 골수종 세포 (OPM eGFP는-2)의 세포 외 기질 성분으로 콜라겐 타입 I에 포함 하였다. 표적 물질의 1 nmol의 볼테 조미 브 (도 2B)에서 국소 적으로 도포 하였다. 각 동물 사 "onplants"에 대한 닭 배아의 융모 막 (CAM)에 이식했다. 오일 후, MM은 이종 이식은 eGFP는의 식으로 시각화 할 수있는 종양을 형성했다. 컨트롤, 이종 이식에 MM 세포의 보르테 조미 브 억제 성장에 비해. 이식 적은 녹색 MM 종양 세포 질량 (도 2C)를 표시. 일에서 단일 MM은 이종 이식REE 다른 동물 (N = 12)는 균질화, 적출 한 후, GFP ELISA로 측정 하였다. 컨트롤 직접 비교 볼테 조미 브 처리 이종 이식편은 상당히 감소 골수종 세포 질량 (도 2d)를 가지고 있었다.
혈관 반응과 닭의 배아에서 골수종 이종 이식의 침략의 생체 분석
onplants 주위 혈관 응답은 실체 현미경으로 관찰 할 수있다. 이종 이식의 혈관은 크게 약물 치료 이종 이식 (1 nmol의 Plitidepsin, 그림 3)에서 감소 하였다. 혈관 신생 반응은 Ribatti 외. (21)에 의해 젤라틴 스폰지 분석에 상술 onplant로 돋 혈관을 계수함으로써 정량화되었다.
침윤 분석을 위해, 이종 인접 CAM 면적 적출. 이종 이식은, 고정 된 파라핀과 절 (그림 4를 제조 하였다 (도 4)을 검출하는 인간의 기-67, 비 멘틴 및 CD138에 대한 항체로 염색 하였다.
그림 1. 3D 다발성 골수종 회전 타원체. OPM -2- eGFP는 및 RPMI-8226 세포 외 매트릭스 성분으로서 일차 인간 골수 간엽 세포와 콜라겐 타입 I과 eGFP는의 타원체. (B) 회전 타원체의 (A) 생성은 배양 배지 및 볼테 조미 브의 각 농도 (1- 함께 배양 하였다 100 ㎚). (C)의 회전 타원체 MM 3 일 동안 성장 및 스테레오 형광 현미경으로 촬영 하였다. 바는 500 μm의를 나타냅니다. (D) 단일 SPHeroids 용균 완충액에서 균질화 한 후, GFP ELISA로 측정 하였다. 하나의 타원체의 GFP 농도 (N = 5, ± SEM 평균)을 계산 하였다. 별은 P 값이 0.05 <표시; (주) = 제어; Bzb = 보르테 조미 브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 다발성 골수종 이종 이식 모델을 그림. 9 전 오보 닭 배아 실험 이식에 사용 하였다 발달 날 (A). (B) OPM -2- eGFP는 및 RPMI-8226 eGFP는 1 차 인간 골수 간엽 세포와 혼합 한 후, 콜라겐 타입 I 외 매트릭스 성분으로서 및 보르테 조미 브의 1 nM의과. 응고 타원체는 (N = 4) 닭 배아 융모 막에 그래프트시킨 후S. (C) 캠 오일 MM 이식 후에는 eGFP는의 식으로 시각화 할 수 있습니다. 이종 이식은 스테레오 형광 현미경으로 매일 촬영 될 수있다. 바는 500 μm의. (D) 단일 MM은 이종 이식이 용해 버퍼에 균질화 및 GFP ELISA로 측정, 바로 아래 CAM 조직으로 적출을 나타냅니다. 단일 종양 GFP 농도 (N = 12, ± SEM을 평균)을 계산 하였다. 별은 P 값이 0.05 <표시; Bzb = 보르테 조미 브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
골수종 혈관 신생의 그림 3. 분석. MM은 이종 이식 (영업 이익률-2 eGFP는)은 오일 닭 배아의 CAM에 이식 후 설명했다. 이식편을 제어하는 비교 treatm에서plitidepsin와 ENT (1nMol, N = 10) CAM 조직 미만 혈관했다 피상적으로 성장하는 종양을 발생했습니다. 혈관 유형의 그래픽 모델에 나타낸 바와 같이 onplants (적색)으로 성장하는 혈관 계수 하였다. 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
골수종 세포 침공 그림 4. 분석. 바로 아래 CAM 호스트 조직 (제어 대 볼테 조미 브가 처리)와 MM의 이종 이식 (영업 이익률-2 eGFP는)의 면역 조직 화학적 분석. 증식 인간의 MM 셀은 기-67, CD138 및 멘틴에 대한 긍정적 인 얼룩 세포 클러스터 조직을 호스트로 침입. 닭 혈관 벽화 세포 마커 ASMA (큰 혈관과 동맥)과 최근 desmin (모세 혈관)로 염색한다. Magnificati200X에 별표 (*)는 CAM의 혈관을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
내화성 MM에 대한 새로운 치료제의 개발은 약물에 대한 인간 MM 세포 민감도를 평가하는 데 시간이 덜 소요되고 비용이 생체 시스템을 필요로한다. 지금까지, 단 몇 생체 시스템은 새로운 항 골수종 치료의 임상 평가에 사용할 수 있습니다. 그들 모두는 화합물 라이브러리 (29)의 대규모 스크리닝에 대한 자신의 한계를 가지고있다.
인간의 MM 셀에 대한 가장 좋은 현재의 모델은 높은 면역 결핍 쥐 7,13,30, 터키의 배아 (29)이다. SCID 마우스 및 조류 배아 이종 이식 모델 모두 MM의 생물학을 연구 및 신규 치료 화합물을 시험하기 위해 사용될 수있다. 그러나 쥐의 시스템은 근친 유전자형, 기술적으로 까다로운 절차, 긴 관찰 기간과 높은 비용 등 여러 가지 한계를 가지고있다.
본 연구에서는, 신규 한 3D 타원체 조류 및 이종 이식 모델은 인간 MES의 존재를 포함 인간 MM 세포 생물학 연구를 위해 제시세포와 세포 외 기질로 지원 구성 요소를 줄기 enchymal. MM 세포 강하게 각 미세 환경에 의존 생존 31-33 증식 기질 - 유래 성장 인자, 사이토 카인 및 ECM 성분의 존재, 즉. 또한, 약물은 비효율적 일 또는 골수종 세포가 자신의 로컬 미세 31,34에 의해 보호되는 경우 변경된 활동을 표시 할 수 있습니다.
뮤린 모델은 시험 관내에서 설명한 3D 모델 및 생체 내 시스템에 비해, 고가의 신속하고 취급이 용이하지 않다. 또한, 3D MM의 이식 된 닭 배아에 타원체 골수종 - 유도 혈관 형성의 분석을 허용한다. 우리 시스템 제한 MM 세포 성장의 짧은 시간이며, 따라서, 조류 뼈 전이 분석은 불가능하다. 우리의 모델의 또 다른 한계는 우리가 간 효소에 의해 전신 응용 프로그램 및 약물 매출 / 수정을 반영하지 않을 수 있습니다 캠 약물의 국소 응용 프로그램과 함께 작동한다는 것입니다. 에첨가는, 그 래프팅까지 약 50 %의 생존율 때문에 닭 배아의 성장 조건 오보 EX 관찰되었다. IHC 분석을위한 내피 마커에 대해서는, 내피 세포를 얼룩 인간 및 마우스 절에서 사용되는 대부분의 마커는 닭의 혈관에 특정하지 않습니다. 따라서, 우리는 벽화 세포 마커 최근 desmin / ASMA 또는 닭 배아 (35)에 렉틴의 주입을 위해 염색을 권장합니다. 모든 가능한 인간 골수종 세포주는 닭 호스트 조직으로 침습적 성장하고 피상적 인 성장을 표시합니다. 이 마이크로톰에 대한 부분을 절단 한 후 파괴 된 조직에 발생합니다. 또한, 특별한주의 (선택 항생제) 형질 감염된 세포 때문에 영구적 인 유전자 재 배열 또는 DNA 메틸화 과정에, 시간 내에 GFP의 유전자 발현을 잃지 않도록주의해야한다.
결론적으로, 간질을 지원하는 인간의 MM 세포의 우리 닭 배아 이종 이식 모델은 STU하는 생체 모델 재현 및 예측을 제공합니다DY 인간 MM 세포 성장 및 혈관 신생. 이것은 MM 모델 개발 시간 및 신규 한 약품의 비용을 줄일 수 있도록 빠른 생체 내 항 - MM 약물 스크리닝 프로세스 용이하게 할 수있다 기재. 이러한 뼈 대체 물질, 복합 ECM 행렬로서 더욱 개선 단계와 상기 시스템이 환자의 샘플에 대해 또한 치료제를 시험하기위한 개선 될 수 사이토킨. 이 맞춤 암 의학 및 개인 내화 MM 환자에서 약물 민감도 테스트를위한 전제 조건입니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 금융 이익이 없다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
- Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
- Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
- Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv.Hematol. 2014, 864058 (2014).
- Chauhan, D., et al. A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma. Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).
- Kuehl, W. M. Mouse models can predict cancer therapy. Blood. 120 (2), 238-240 (2012).
- Nefedova, Y., Gabrilovich, D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies. Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).
- Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations. Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).
- Dazzi, F., et al. Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation. Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).
- Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
- Feuring-Buske, M., et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).
- Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
- Li, M., et al. Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect. Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).
- Tassone, P., et al. A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma. Blood. 106 (2), 713-716 (2005).
- Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Drug discovery through stem cell-based organoid models. Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).
- Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).
- Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds). Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J.Vis.Exp. (41), (2010).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Kern, J., et al. GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib. Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp.Cell Res. , (2014).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J.Vis.Exp. (33), (2009).
- Kobayashi, T., et al. A chick embryo model for metastatic human prostate cancer. Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).
- Koop, S., et al. Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate. Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).
- Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines. BMC.Cancer. 12, 501 (2012).
- Martowicz, A., et al. EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth. Mol.Cancer. 12, 56 (2013).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. 6, 34 (2006).
- Farnoushi, Y., et al. Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos. Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).
- Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability. Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).
- Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets. Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).
- Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies. J.Vis.Exp. (85), (2014).
- Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal. Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).
- Jilani, S. M., et al. Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature. J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).
