Summary
Humanen multiplen Myelom (MM) Zellen erfordern die Mikroumgebung, die von mesenchymalen Zellen und extrazellulären Matrixkomponenten für das Überleben und die Proliferation. Wir gründeten eine in vivo Hühnerembryo-Modell mit eingepflanzten menschlichen Myelom und mesenchymalen Zellen zu Wirkungen von Krebsmedikamenten auf das Tumorwachstum, Invasion und Angiogenese zu untersuchen.
Abstract
Das Multiple Myelom (MM), einem bösartigen Plasmazellerkrankung, nicht heilbar und neuartige Medikamente sind erforderlich, um die Prognose von Patienten zu verbessern. Durch das Fehlen der Knochenmikroumgebung und auto / parakrine Wachstumsfaktoren menschlichen MM-Zellen sind schwierig zu kultivieren. Es besteht daher ein dringender Bedarf in vitro und in vivo-Kultursystemen richtige, um festzustellen, um die Aktion neuartiger Therapeutika auf die menschliche MM-Zellen zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein Modell für die menschliche multiple Myelomzellen in einem komplexen 3D-Umgebung in vitro und in vivo zu wachsen. MM-Zelllinien OPM-2 und RPMI-8226 transfiziert wurden, um die GFP-Transgen exprimieren und wurden in Gegenwart von humanen mesenchymalen Zellen und Kollagen kultivierten Typ-I-Matrix als dreidimensionale Sphäroide. Zusätzlich wurden Sphäroide auf der Chorioallantoismembran (CAM) des Hühnerembryos gepfropft und das Tumorwachstum wurde durch Stereofluoreszenzmikroskopie überwacht. Beide Modelle ermöglichen die Untersuchung von neuartigen therapeutischen drugs in einer komplexen 3D-Umgebung und die Quantifizierung der Tumorzellmasse nach der Homogenisierung der Transplantate in einer Transgen-spezifischen GFP-ELISA. Außerdem kann angiogene Reaktionen des Wirtes und Invasion von Tumorzellen in das darunterliegende Wirtsgewebe täglich durch ein Stereomikroskop beobachtet und durch immunhistochemische Färbung gegen menschliche Tumorzellen (Ki-67, CD138, Vimentin) oder Host mural Zellen abdeckt Blutgefße analysierende (Desmin / ASMA).
Abschließend kann der Onplantat System studieren MM Zellwachstum und die Angiogenese in einem komplexen 3D-Umgebung und ermöglicht Screening nach neuen therapeutischen Verbindungen Targeting Überleben und die Proliferation von MM-Zellen.
Protocol
Gemäß dem österreichischen Recht, und das Amt des Laboratory Animal Welfare der US Public Health Service Vogelembryonen nicht als lebender Wirbeltiere betrachtet, bis hatching.The NIH Office of Laboratory Animal Welfare hat geschrieben Leitlinien in diesem Bereich (http vorgesehen: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm und NIH Publikation Nr .: 06-4515).
1. Zellkultur und Transfektion Lentivirale
- Kultur MM-Zelllinien OPM-2, RPMI-8226 und die menschliche mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark in RPMI1640-Medium, das mit 10% fötalem Rinderkalbsserum und 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM Glutamin in Gegenwart ergänzt von 5% CO 2 bei 37 ° C.
- Transfektion von 5 x 10 6 HEK 293FT Zellen mit viralen Verpackungsgemisch (9 ug) DNA und 3 ug pLenti6 / V5 dest eGFP-Vektor unter Verwendung von 30 ul liposomalen Transfektionsreagenz und Transfektionsmedium (10 ml). Entfernen Transfektionsmedium nach 12 h und10 ml DMEM-Medium mit 10% Kälberserum und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA).
- Nach 5 Tagen sammeln Ständen von HEK293FT Zellen nach Zentrifugation von Schwimmzellen (1000 · g, 5 min). Bestimmen Sie Virustiter durch Echtzeit-PCR, wie an anderer Stelle 28 beschrieben.
- Transfektion von 1 x 10 6 MM-Zellen mit eGFP Lentivirale Partikel (1 × 10 5 Teilchen) in einem 24-Well-Platte in komplettem Wachstumsmedium. Nach 3 Tagen beginnen Auswahlprozess durch Zugabe von 2 & mgr; g / ml zum Kulturmedium Blasticidin. Für die im Handel erhältlichen eGFP Lentivirus, verwenden 500 & mgr; g / ml Neomycin.
- Nach 2 Wochen der Auswahl werden Cluster von eGFP exprimierenden Zellen MM erscheinen; sammeln die Zellen durch Zentrifugation (1000 × g, 5 min) und erweitern sie als OPM-2 eGFP und RPMI-8226 eGFP Unterlinien für Experimente (Kapitel 2 und 3).
2. 3D-Multiple Myeloma Spheroid Modell
- Chill Kollagen Typ-I-Lösung und 10 x DMEM on Eis.
- Mix 1/10 Volumen 10 x DMEM-Medium in Kollagen-Matrix; hinzuzufügen NaOH (0,2 N) auf einen sauren Kollagenlösung mit einem pH-Wert von 7,4 zu neutralisieren; store Kollagen / Mittellösung auf Eis.
- Mischen Sie transgenen MM-Zelllinien (OPM-2 eGFP oder RPMI-8226 eGFP; 250.000 pro Sphäroid) mit humanen mesenchymalen Zellen (50.000 Zellen / Sphäroid, das heißt, 30 & mgr; drop).
- Centrifuge Zellgemisch in 15 ml-Röhrchen (1000 · g, 5 min), kaltes vorbereitet Kollagen-Gemisch (1 ml) zu dem Zellpellet und gut mischen (mit 1000 ul Spitze).
- Unmittelbar Je 30 ul der Kollagen / Zell-Mischung (100 ul Spitze) in einer 24 Well-Platte auf sterilem Paraffinfilm und lassen Zell / Kollagengemisch für 30 min bei 37 ° C (siehe 1A), zu polymerisieren.
- Overlay MM Sphäroide mit 1 ml Kulturmedium mit 1, 10 und 100 nM Bortezomib (siehe 1B).
- Nach 72 h Inkubation bei 37 ° C, Dokumenten SphäroidenFluoreszenz-Stereomikroskopie (siehe Abbildung 1C).
- Übertragen jedes Sphäroid durch die Verwendung von Zangen mit breiten flachen Backen in einem Reaktionsrohr zur Messung von GFP (siehe Figur 1D).
3. 3D-Myeloma-Xenograft-Modell in der CAM-
- Hühnereier Inkubieren in einem speziellen Inkubator für Vogeleiern bei 37 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit für drei Tage.
- Danach offenen Eier und Transfer-Embryonen mit Ethanol, quadratisch, 10 cm mit einem Gewicht von Kunststoffbooten mit Zellkulturplatte Deckel sterilisiert und Inkubation "ab ovo" für weitere sechs Tage, so dass die CAM ist in der Lage zu entwickeln (siehe Abbildung 2A).
- Chill Kollagen Typ-I-Lösung und 10 x DMEM auf Eis, Mischungs 1/10 Volumen 10 x DMEM Medium in Kollagenmatrix, In NaOH (0,2 N) auf einen sauren Kollagenlösung mit einem pH-Wert von 7,4 zu neutralisieren; store Kollagen / Mittellösung auf Eis.
- Mischen Sie transgenen MM-Zelllinien (OPM-2 eGFP oderRPMI-8226 eGFP; 250.000 pro Sphäroid) mit humanen mesenchymalen Zellen (50.000 Zellen / Sphäroid).
- Centrifuge Zellen in 15-ml-Röhrchen (1.000 × g, 5 min; für jede Testverbindung 1 Fläschchen), fügen Sie 1 ml kaltem vorbereitete Kollagenmischung mit Drogen (at gewünschte Arbeitskonzentration) zu dem Zellpellet und gut mischen (mit 1000 ul Spitze).
- Platzieren Kollagen Tropfen (30 & mgr; l jeweils) auf Parafilm in einem 6 für 30 min gut Pastete, um die Polymerisation der extrazellulären Matrix bei 37 ° C zu ermöglichen.
- Transfer "onplants" aus Schritt 3.6 mit der Verwendung von Zangen, um die unbehandelte Oberfläche des Nockens (2 cm vom Embryo) von 9 Tage alten Hühnerembryonen (4 onplants je Hühnerembryo, siehe 2B)
- Nach 5 Tagen in vivo Wachstum in einem Eierbrutschrank bei 37 ° C und 70% Luftfeuchte, Dokumenten Xenotransplantate durch Fluoreszenz-Stereomikroskopie (siehe 2C). Euthanize Hühnerembryonen durch Unterkühlung bei 4 ° C im Kühlschrank 5h.
- Xenotransplantate mit darunter liegenden CAM Gewebe zu entfernen, indem eine ophthalmische Schere und Zange mit breiten, flachen Backen. Verwenden Sie sie für die Messung der GFP (Abschnitt 4, siehe Abbildung 2D) oder für immunhistochemische Analyse von Blutgefäßen und / oder Invasion von Tumorzellen (Abschnitt 5).
4. Quantifizierung der eGFP Protein durch ELISA
- Übertragen Sie jede MM Sphäroid oder ausgeschnitten Xenotransplantat in 0,5 ml RIPA-Puffer, enthaltend 200 ug / ml Protease-Inhibitoren.
- Homogenisieren Sphäroid / Xenotransplantats mit einem Gewebe-Homogenisator auf Eis.
- Führen Sie drei Gefrier / Tau-Zyklen in flüssigem Stickstoff und 37 ° C Wasserbad.
- Zentrifuge Homogenisat bei 4 ° C für 20 min (12.000 g) und Speicher-Überstände.
- Verdünnte Proben 1:20 mit Assay-Puffer (200 ul) des ELISA-Kits. Messen GFP-Niveaus durch einen kommerziellen ELISA-Kit GFP unter Verwendung von biotinyliertem anti-GFP-Antikörper, entsprechend dem Protokoll des Herstellers.
5. Immunohistochemical Analyse von Blutgefäßen und eindringenden Tumorzellen
- Fix herausgeschnitten Xenotransplantate mit CAM-Bereich in 4% Paraformaldehyd O / N bei 4 ° C.
- Fixiert Xenotransplantaten in Einbettkassetten und sie in einer Gewebeeinbettung Station mit einer zunehmenden abgestuften Alkoholreihe (50%, 70%, 80%, 95% Ethanol, Xylol und Paraffin; jeder Schritt 60 Minuten).
- Abschnitt Xenotransplantaten (5 um) unter Verwendung eines stationären Rotationsmikrotom. Bake Paraffinschnitten auf Objektträgern O / N bei 56 ° C.
- Entparaffinieren Abschnitte durch eine abnehmende abgestufte Alkoholreihe bis zweifach destilliertem Wasser (Xylol, 95%, 80%, 70%, 50% Ethanol, doppelt destilliertem Wasser; jeder Schritt 10 min).
- Antigen-Retrieval durchzuführen in einem Wasserbad (95 ° C, 20 min) mit einem Antigen-Retrieval-Lösung (Citrat-Puffer, pH 7,0; Volumen 100 ul).
- Block endogene Peroxidaseaktivität mit 100 ul 3% H 2 O 2 / Methanol 30 min.
- Blockabschnitte in PBS,10% fötalem Kälberserum für 45 min (Volumen 100 ul).
- Fleck 1 Stunde mit 100 ul des primären Antikörpers (1 ug / ml) in PBS, das 1% fötales Kälberserum bei RT verdünnt.
- Nach dem Waschen 3-mal in PBS, inkubiert für 1 h mit biotinylierten sekundären Antikörpers (0,1 ug / ml) in PBS, das 1% fötales Kälberserum bei RT.
- Nach dem Waschen 3-mal in PBS auszuführen Farbreaktion durch das Avidin / Biotin-Komplex (ABC) und Diaminobenzidin (DAB) Substratlösung nach den Anweisungen des Herstellers.
- 5.11. Stopp-Reaktion durch die Übertragung von Abschnitten zu doppelt destilliertem Wasser, Gegenfärbung mit Hämatoxylin und montieren Abschnitte mit einem Kunst Eindeckmedium.
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Representative Results
In-vitro-Analyse von Zielverbindungen in 3D multiplem Myelom Sphäroid Assays
Durch die Begrenzung des Kultivierens primären menschlichen Myelomzellen in vitro etablierten wir neue 3D in vitro Kulturmodelle für menschliche MM-Zelllinien unter Verwendung einer extrazellulären Matrix und das Wachstum unterstützenden primären humanen mesenchymalen Zellen aus Knochenmark (1A, B). EGFP transgenen MM Zelllinien ermöglichen die Visualisierung und Quantifizierung von MM Tumormasse nach der 3D-Wachstums in Sphäroiden. Beide MM-Zelllinien OPM-2 eGFP und RPMI-8226 eGFP wurden für 3 Tage in Gegenwart von steigenden Konzentrationen (1- 100 nm) von Bortezomib und Tumoren gezüchtet wurden durch die Expression von GFP auf einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht (Figur 1C) . Tumorzellmasse wurde nach Homogenisierung von Sphäroiden und Mess eGFP Inhalte durch eine GFP-ELISA (Abbildung 1 quantifiziertD).
In vivo Analyse der Zielverbindungen in multiplem Myelom Xenotransplantate in Hühnerembryonen
Drei Tage alten Hühnerembryonen wurden ex ovo für 6 Tage und für die Transplantation von MM-Zellen (2A) verwendet Tag 9 kultiviert. EGFP transgenen Myelomzellen (OPM-2 eGFP) zusammen mit menschlichen Knochenmark mesenchymale Zellen wurden in Kollagen Typ-I als Bestandteil der extrazellulären Matrix eingebettet sind. Die Zielsubstanz Bortezomib wurde topisch auf 1 nMol (2B) aufgebracht ist. Für jedes Tier 4 "onplants" wurden auf der Chorioallantoismembran (CAM) von Hühnerembryonen gepfropft. Nach 5 Tagen gebildet MM Xenotransplantate Tumoren, die durch die Expression des eGFP visualisiert werden konnte. Im Vergleich zu Kontrollen, Bortezomib gehemmt Wachstum von MM-Zellen in Xenotransplantaten. Grafts angezeigt weniger grün MM Tumorzellmasse (2C). Einzel MM Xenotransplantate von threie verschiedenen Tieren (n = 12) wurden herausgeschnitten, homogenisiert und danach durch GFP ELISA gemessen. Im direkten Vergleich zu den Kontrollen hatten Bortezomib behandelten Xenotransplantaten eine deutlich reduzierte Myelom-Zellmasse (2D).
In vivo Analyse der angiogenen Antworten und Invasion von Myelom-Xenotransplantaten in Hühnerembryonen
Angiogene Antworten rund onplants kann durch Stereomikroskopie beobachtet werden. Vaskularisierung Xenotransplantaten wurde Medikament behandelten Heterotransplantate (1 nMol Plitidepsin, Abbildung 3) deutlich reduziert. Angiogene Antworten wurden durch Zählen der Blutgefäße sprießen in Onplantat wie für die Gelatineschwamm Assay durch Ribatti et al. 21 beschrieben, quantifiziert.
Für die Analyse der Invasion wurden Xenotransplantate mit dem benachbarten CAM Bereich ausgeschnitten. Xenografts wurden fixiert, in Paraffin eingebettet und Schnitte hergestellt (Abbildung 4 (Figur 4) erkennen gefärbt.
Abbildung 1. 3D Multiple Myeloma Spheroids. (A) Erzeugung von OPM-2 eGFP und RPMI-8226 eGFP Sphäroide mit primären humanen Knochenmark mesenchymale Zellen und Kollagen-Typ-I als extrazelluläre Matrixkomponente. (B) Sphäroide wurden mit Kulturmedium und die jeweilige Konzentration Bortezomib (1- inkubiert 100 nM). (C) MM Sphäroide wurden für 3 Tage wachsen gelassen und durch eine stereoFluoreszenzMikroskop photographiert. Balken zeigen die 500 & mgr; m. (D) Einzel spheroids wurden in Lysepuffer homogenisiert und danach in einem GFP-ELISA gemessen. GFP Konzentrationen von einzelnen Sphäroiden wurden berechnet (n = 5, Mittelwert ± SEM). Sterne zeigen, p-Werte <0,05; Co. = Kontrolle; Bzb = Bortezomib. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Multiple Myeloma Xenograftmodell. (A) auf die Entwicklungs 9. Tag ex ovo-Hühnerembryonen wurden zum Pfropfen Experimente verwendet. (B) OPM-2 eGFP und RPMI-8226 eGFP wurden primäre humane Knochenmark mesenchymale Zellen gemischt, Kollagen-Typ-I als extrazelluläre Matrixkomponente, und mit 1 nM von Bortezomib. Nach dem Erstarren Sphäroide (n = 4) wurden auf der Chorioallantoismembran Hühnerembryo gepfropftens. (C) Nach 5 Tagen MM Transplantate in dem CAM kann durch die Expression des eGFP visualisiert werden. Xenotransplantate kann täglich durch eine stereoFluoreszenzMikroskop fotografiert werden. Balken zeigen die 500 & mgr; m. (D) Einzel MM Xenotransplantate wurden mit darunter liegenden CAM Gewebe herausgeschnitten, in Lysepuffer homogenisiert und in einem GFP ELISA gemessen. GFP Konzentrationen von einzelnen Tumoren wurden berechnet (n = 12, Mittelwert ± SEM). Sterne zeigen, p-Werte <0,05; Bzb = Bortezomib. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Analyse der Myelom Angiogenese. MM Xenotransplantaten (OPM-2 eGFP) wurden fünf Tage nach der Transplantation auf der CAM des Hühnerembryos dokumentiert. Im Vergleich zu Transplantaten zu kontrollieren, treatment mit plitidepsin (1 nmol, n = 10) ergab oberflächlich wachsenden Tumoren, die von CAM Gewebe weniger vaskularisiert waren. Blutgefße wachsen den onplants (rot) wurden gezählt, wie in der grafischen Modell der Blutgefäßtypen dargestellt. Balken zeigen die 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Analyse der Myelom-Zellinvasion. Immunhistochemische Analyse der MM-Xenotransplantaten (OPM-2 eGFP) mit darunter liegenden CAM Wirtsgewebe (Bortezomib behandelten gegenüber den Kontrollen). Proliferierenden menschlichen MM Zellen zu färben positiv für Ki-67, CD138 und Vimentin und dringen als Zellhaufen Wirtsgewebe. Hühnerblutgefäße sind mit Wandzellmarker ASMA (größere Gefäße und Arterien) und Desmin (Kapillaren) gefärbt. Magnificatiauf 200x, Sternchen zeigen Blutgefäße des CAM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Entwicklung neuer therapeutischer Mittel zur feuerfesten MM erfordert weniger zeitaufwendig und teuer in-vivo-Systemen, um die Empfindlichkeit des menschlichen Myelomzellen, um Medikamente zu bewerten. Bisher sind nur wenige in-vivo-Systeme für die präklinische Evaluierung neuer anti-Myelom-Therapien zur Verfügung. Alle von ihnen haben ihre Grenzen für große Screening von Substanzbibliotheken 29.
Die derzeit besten Modelle für menschliche MM-Zellen sind sehr immun-defizienten Mäusen 7,13,30 und Truthahnembryonen 29. Sowohl die SCID-Maus und Vogelembryo Xenograft-Modellen verwendet werden, um die Biologie von MM zu studieren und neue therapeutische Verbindungen zu testen. Allerdings haben murine Systeme mehrere Einschränkungen, einschließlich Inzucht Genotyp, technisch anspruchsvolle Verfahren, lange Beobachtungszeiträume und hohe Kosten.
In dieser Studie wird ein neuartiges 3D-Sphäroid und Vogel Xenograft Modell für die Untersuchung menschlichen MM Zellbiologie, die die Anwesenheit des menschlichen mes beinhaltet vorgestelltenchymal Stammzellen und der extrazellulären Matrix als unterstützende Komponenten. MM-Zellen sind stark abhängig von den jeweiligen Mikroumgebung, dh die Anwesenheit von Stroma-abgeleitete Wachstumsfaktoren, Zytokine und ECM-Komponenten, um zu überleben und sich vermehren 31-33. Darüber hinaus könnten Medikamente ineffizient sein oder zeigen veränderte Aktivität bei Myelom-Zellen zeichnen sich durch ihre lokalen Mikroumgebung 31,34 geschützt.
Im Vergleich zum murinen Modellen der beschriebenen 3D in vitro und in vivo-Modellsystemen nicht teuer sind, schnell und leicht zu handhaben. Darüber hinaus ist die Transplantation von 3D MM Sphäroide an Hühnerembryonen ermöglicht die Analyse der Myelom-induzierte Angiogenese. Eine Beschränkung unseres Systems ist die kurze Zeit von MM-Zellwachstum, und somit ist keine Analyse der Metastasierung in avian Knochen möglich ist. Eine weitere Einschränkung unserer Modelle ist, dass wir mit topischen Applikation von Medikamenten in der CAM-Anwendungen, die systemischen und Drogenumsatz / Änderung durch Leberenzyme nicht abträglich sein. InZusätzlich kann eine ca. 50% Überlebensrate bis zum Pfropfen wurde durch ex ovo Wachstumsbedingungen von Hühnerembryonen beobachtet. Bezug endothelialen Marker für IHC-Analyse, die meisten Marker in Mensch und Maus Abschnitt verwendet, um Endothelzellen zu färben sind nicht spezifisch für Blutgefäße im Huhn. Wir empfehlen daher, Färbung für den Wandzellmarker Desmin / ASMA oder die Injektion von Lektine in Hühnerembryonen 35. Nicht alle verfügbaren menschlichen Myelom-Zelllinien werden invasiv in Hühnerwirtsgewebe wachsen und zeigen oberflächliche Wachstum. Dies wird in zerstörtem Gewebe nach dem Schneiden Abschnitte am Mikrotom führen. Darüber hinaus sollten besondere Sorgfalt (Auswahl Antibiotika) geachtet werden, dass transfizierte Zellen nicht die GFP Transgen-Expression in der Zeit verlieren, aufgrund eines dauerhaften genetischen Umlagerungen oder DNA-Methylierungs-Prozesse werden.
Abschließend bietet unseren Hühnerembryo-Xenograft-Modell der menschlichen MM-Zellen mit Stroma-Unterstützung eine reproduzierbare und vorhersagbare in-vivo-Modell Study menschliche MM-Zellwachstum und die Angiogenese. Diese beschriebenen MM-Modell kann schneller in-vivo-Screening-Verfahren der Anti-MM Medikamente erleichtern und helfen, Entwicklungszeiten und -kosten für neue Medikamente zu reduzieren. Mit weiteren Verbesserung Schritte, wie Knochenersatzmaterial, komplex ECM Matrix und Zytokine könnte das System zum Testen Therapeutika auch gegen Patientenproben verbessert werden. Dies ist eine Voraussetzung für die personalisierte Krebsmedizin und Prüfung der Arzneimittelempfindlichkeit in einzelnen feuerfesten MM-Patienten.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
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