Summary
人多发性骨髓瘤（MM）细胞需要间质细胞和细胞外基质成分为存活和增殖的支持性微环境。我们建立了与植入人类骨髓瘤和间质细胞体内鸡胚模型来研究癌症药物对肿瘤的生长，侵袭和血管生成作用。
Abstract
多发性骨髓瘤（MM），恶性浆细胞疾病，无法治愈的和新的药物都需要改善患者的预后。由于缺乏骨微环境和自动/旁分泌生长因子的人的MM细胞不易培养。因此，目前迫切需要建立适当的体外和体内培养系统来研究对人MM细胞新的治疗的作用。这里，我们提出一个模型，以在体外和体内生长的人类多发性骨髓瘤细胞在一个复杂的三维环境。 MM细胞系OPM-2和RPMI-8226被转染以表达该转基因GFP和培养在人类间质细胞和胶原的存在I型基质为三维球状体。此外，球状体接枝在鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和肿瘤生长通过立体声荧光显微镜监测。这两种型号允许新的治疗DRU研究GS在一个复杂的三维环境和肿瘤细胞块移植物在转基因特异性GFP-ELISA均化后进行量化处理。此外，主机和肿瘤细胞的侵袭进入下卧宿主组织的血管生成反应，可以每日通过立体显微镜监测和针对人肿瘤细胞（Ki-67的，CD138，波形蛋白）或宿主壁细胞覆盖血管免疫染色分析（结蛋白/ ASMA）。
总之，onplant系统允许研究在一个复杂的三维环境MM细胞生长和血管生成，使筛选靶向生存MM细胞的增殖和新的治疗的化合物。
Protocol
根据奥地利法律，美国公共卫生服务禽流胚胎实验室动物福利办公室不被视为活的脊椎动物，直到实验动物福利hatching.The NIH办公室在这方面（HTTP提供了书面指导：// www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm和NIH出版号：06-4515）。
1.细胞培养和慢病毒转染
- 培养的MM细胞系OPM-2，RPMI-8226，并从骨髓在RPMI1640培养基中的人类间质干细胞，补充有在存在10％牛胎儿小牛血清和100IU / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和2mM谷氨酰胺的5％的CO 2在37℃。
- 转染5×10 6的HEK 293FT细胞病毒包装结构（9微克）的DNA和3微克pLenti6 / V5 dest中eGFP的向量通过使用30微升脂质体转染试剂转染培养基（10毫升）中。 12小时后取出转染中，加入10 mL的DMEM培养基含10％小牛血清和1％非必需氨基酸（NEAA）。
- 5天后，游泳细胞（1000 XG，5分钟），离心后收集HEK293FT细胞的上清液。通过实时PCR测定病毒滴度为28别处描述。
- 转染1×10 6个MM细胞与eGFP的慢病毒颗粒（1×10 5个颗粒）在24孔板中的完全生长培养基。 3天后，加入2微克/毫升瘟到培养基开始选择过程。对于市售的eGFP慢病毒，使用500微克/ ml新霉素的。
- 2周选择后，eGFP的簇表达MM细胞会出现;通过离心（1,000×g离心，5分钟）收集细胞，并扩大其作为OPM-2 的eGFP和RPMI-8226 eGFP的亚系进行实验（第2和3）。
2. 3D-多发性骨髓瘤球体模型
- 寒意胶原I型解决方案和10×DMEMØñ冰。
- 混合1/10体积10×DMEM培养基进入胶原基质;添加NaOH水溶液（0.2 N），以中和酸性的胶原溶液以7.4的pH值;店胶原/冰介质溶液。
- 转基因混合MM细胞系（OPM-2或的eGFP RPMI-8226 绿色荧光蛋白 ; 250,000球体，）与人类间质细胞（50,000个细胞/球体， 即 30微升滴）。
- 在15ml试管（1000×g离心，5分钟）离心细胞混合物，冷制备胶原混合物（1mL）溶液加入到细胞沉淀拌匀（1,000微升尖）。
- 立即吸取30微升胶原/细胞混合物（用100μl尖端）在一个24孔板上无菌石蜡薄膜，并允许细胞/胶原混合物在37℃（ 见图1A）聚合30分钟。
- 覆盖的MM球体用含有1,10和100nM的硼替佐米1mL中培养基（参见图1B）。
- 之后，在37℃72小时温育的，文件球状体由荧光立体显微镜（ 见图1C）。
- 通过使用镊子具有宽扁钳口在反应管转移的每个球体的GFP的测量（ 见图1D）。
3. 3D多发性骨髓瘤异种移植模型中的CAM
- 孵化鸡蛋中为鸟卵的特别培养箱中在37℃和70％湿度下三天。
- 此后，打开蛋和转移胚胎灭菌用乙醇，方形，10厘米的塑料称量船与细胞培养板盖和孵化“ 前卵 ”用于进一步六天，使得CAM是能够开发（参见图2A）。
- 寒意胶原I型溶液和10×DMEM在冰上，混合1/10体积10×DMEM培养基到胶原基质，添加氢氧化钠（0.2 N），以中和酸性的胶原溶液以7.4的pH值;店胶原/冰介质溶液。
- 混合转基因MM细胞系（OPM-2 的eGFP或RPMI-8226 绿色荧光蛋白 ; 250,000球体，）与人类间质细胞（50,000个细胞/球体）。
- 离心细胞在15ml试管（1000×g离心，5分钟;对于每个试验化合物1小瓶），药物添加1mL中冷制备胶原混合物（在所需的工作浓度）的细胞沉淀并充分混合（1,000微升尖）。
- 放置胶原滴在6孔颈部30分钟上的封口膜（各30微升），以允许细胞外基质的聚合在37℃。
- 转移“onplants”来自步骤3.6与使用镊子到CAM的未处理表面（2厘米的距离胚胎）的9日龄鸡胚（4- onplants每个鸡胚，参见图2B）
- 经过5天的体内生长在蛋孵化器在37℃和70％的湿度，文件异种移植物通过荧光立体显微镜（ 见图2C）。受低温的冰箱5小时安乐死鸡胚胎在4℃。
- 由眼科剪刀取出移植与下层组织CAM和镊子与宽阔平坦的下颌。它们用于GFP的测量（第4节， 见图2D）或血管和/或侵入的肿瘤细胞（第5）免疫组化分析。
通过ELISA 4.绿色荧光蛋白定量的蛋白质
- 传送每个MM球体或切除异种移植入0.5毫升RIPA缓冲液含有200微克/毫升蛋白酶抑制剂。
- 均质球体/异种移植物在冰上组织匀浆器。
- 执行三个冷冻/解冻周期在液氮和37℃水浴中。
- 离心机匀浆在4℃下20分钟（12,000克）和存储上清液。
- 稀释样品中的ELISA试剂盒的测定缓冲液（200微升）1:20。测量GFP的水平通过使用生物素化抗GFP抗体商业GFP ELISA试剂盒，根据制造商的协议。
5. Immunohi对血管和入侵肿瘤细胞stochemical分析
- 切除修复与移植CAM面积在4％多聚甲醛O / N在4℃。
- 放置固定异种移植到嵌入盒，并将它们与增加的梯度醇系（50％，70％，80％，95％的乙醇，二甲苯和石蜡;每个步骤60分钟）转移至组织包埋站。
- 部异种移植物（5微米）通过使用台式旋转切片机。烘烤在56℃下在载玻片O / N石蜡切片。
- Deparaffinize部分由递减梯度酒精串联双蒸水（混合二甲苯，95％，80％，70％，50％的乙醇，双蒸水;每个步骤10分钟）。
- 在水浴（95℃，20分钟）与抗原修复液进行抗原修复（柠檬酸盐缓冲液; pH值7.0;体积100微升）。
- 阻断内源性过氧化物酶活性用100μl3％的H 2 O 2 /甲醇30分钟。
- 在含PBS块段10％胎牛血清45分钟（体积100微升）。
- 染色1小时，用100μl初级抗体（1微克/毫升）稀释在含有1％胎牛血清在RT PBS中。
- 洗涤3次在PBS中后，孵育1与生物素化第二抗体（0.1微克/毫升）在含有1％胎牛血清在RT PBS中。
- 洗涤3次在PBS中后由抗生物素蛋白/生物素复合物（ABC）和二氨基联苯胺（DAB）底物溶液，根据制造商的说明进行显色反应。
- 5.11。停止反应通过转移部分，以双蒸水，染液用苏木精和安装部分用合成封固剂。
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Representative Results
在目标化合物的3D多发性骨髓瘤球体测定体外分析
由于在体外原代人MM细胞培养的限制，我们建立了新的三维体外培养模型为人类MM细胞系，利用细胞外生长基质和支持原代人骨髓间充质细胞从骨髓的（ 图1A，B）。 EGFP转基因MM细胞系允许可视化和MM肿瘤块的量化的三维生长球状体之后。两个MM细胞系OPM-2 的eGFP和RPMI-8226 的eGFP中培养3天，在增加浓度的硼替佐米和肿瘤（1- 100纳米）的存在下通过GFP的上立体荧光显微镜的表达进行观察（ 图1C） 。肿瘤细胞团由GFP-ELISA（ 图1球体的同质化和测量绿色荧光蛋白含量量化后D）。
在目标化合物的鸡胚中多发性骨髓瘤异种移植物的体内分析
三日龄鸡胚胎中培养前卵 6天，并在用于MM细胞（ 图2A）的接枝天9。 EGFP转基因骨髓瘤细胞（OPM-2 EGFP）与人骨髓间充质细胞嵌入到胶原蛋白I型细胞外基质成分。目标物质的硼替佐米的混合物在1纳摩尔（ 图2B）局部施用。每个动物4“onplants”接枝于鸡胚的绒毛膜尿囊膜（CAM）。经过5天的MM异种移植物形成，可以通过EGFP的表达被可视化的肿瘤。与对照组相比，MM细胞的异种移植物中的硼替佐米抑制生长。移植物显示较少绿色的MM肿瘤细胞块（ 图2C）。从单次移植的MM稀土元素不同的动物（N = 12）切下，均质化之后，由绿色荧光蛋白ELISA测量。在直接比较对照硼替佐米处理的异种移植物有一个显著降低骨髓瘤细胞块（ 图2D）。
在血管生成反应和骨髓瘤侵异种移植在鸡胚体内分析
周围onplants的血管生成反应可通过立体显微镜进行观察。异种移植物的血管形成在药物处理的异种移植物（1纳摩尔Plitidepsin， 图3）中的显著降低。血管生成应答通过如由Ribatti 等人 21所述的用于明胶海绵测定计数血管出芽成onplant量化。
对于入侵分析，异种移植物被切除与相邻的CAM区。异种移植物固定，石蜡包埋和切片制备（ 图4 图4）的抗体。
图1. 3D多发性骨髓瘤细胞球体。 OPM-2 的eGFP和RPMI-8226 eGFP的球状体与原代人骨髓间充质细胞和胶原I型作为细胞外基质组分（B）的球体（A）的代培养用培养基和硼替佐米的各浓度（1- 100纳米）。（C）的 MM球状体生长3天并通过立体荧光显微镜拍照。横道500微米。（D）单SPHeroids在裂解缓冲液之后，测定GFP的ELISA分析。单个球体的绿色荧光蛋白的浓度，计算（5例，平均值±SEM）。星号表示P值<0.05;公司=控制; BZB =硼替佐米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.多发性骨髓瘤异种移植模型。 （一）在发育9天前OVO鸡胚胎用于移植实验。（B）OPM-2 EGFP和RPMI-8226 EGFP的混合与原代人骨髓间充质细胞，胶原蛋白I型是细胞外基质成分， 1纳米硼替佐米。后凝固球状体（n = 4时的）被移植对鸡胚的绒毛膜尿囊膜第（℃）5天后的MM移植在CAM可以通过EGFP的表达被可视化。异种移植可以每天通过立体荧光显微镜拍照。横道500微米。（D）的单MM异种移植物被切除与下层的CAM组织，在裂解缓冲液，并在绿色荧光蛋白ELISA测量。单个肿瘤的GFP浓度计算（12例，平均值±SEM）。星号表示P值<0.05; BZB =硼替佐米。 请点击此处查看该图的放大版本。
记录在案移植对鸡胚的CAM五天后血管瘤图3.分析。MM异种移植物（OPM-2 EGFP）。相比于对照移植物，treatm耳鼻喉科与plitidepsin（1nMol，N = 10）导致表面上生长的肿瘤是由CAM组织血管少。血管生长到onplants（红色）被计为在血管类型的图形模型描绘。横道1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
骨髓瘤细胞浸润图4.分析。MM异种移植物（OPM-2 EGFP）与下层CAM宿主组织（硼替佐米治疗与控制）的免疫组化分析。增殖人MM细胞染色阳性，Ki-67的，CD138和波形和入侵的细胞群宿主组织。鸡血管沾满壁画细胞标记阿斯玛（大血管和动脉）和结（毛细血管）。 Magnificati200X上，星号表示凸轮的血管。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
的新的治疗剂用于难治性MM的发展需要较少耗时且昂贵的体内系统评估人类MM细胞的对药物的敏感性。迄今为止，只有少数的体内系统可用于新的抗骨髓瘤治疗的临床前评价。他们都有自己的化合物库29的大规模筛选的限制。
目前最好的模型为人类MM细胞是高度免疫缺陷小鼠7,13,30和火鸡胚胎29。既SCID小鼠和禽流胚胎异种移植模型可用于研究的MM的生物学和测试新的治疗的化合物。但是，鼠系统有一些局限性，包括自交系基因型，技术要求高的程序，长周期的观察，成本高。
在这项研究中，一种新的三维球体和禽流异种移植模型，提出研究人类MM细胞生物学，涉及人类MES的存在enchymal干细胞和细胞外基质作为支持部件。 MM细胞强烈地依赖于它们各自的微环境，即间质来源的生长因子，细胞因子和ECM成分的存在下存活和增殖31-33。此外，药物可能是低效或显示改变的活性时的骨髓瘤细胞是由它们的局部微环境31,34的保护。
相较于鼠模型中，所描述的三维体外和体内模型系统并不昂贵，快速，容易处理。此外，3D的MM移植球状体到鸡胚允许骨髓瘤诱导的血管生成的分析。我们的系统的一个限制是MM细胞生长的时间短，因此，转移的分析禽流骨头是不可能的。我们的模型的另一个局限性是我们与药物可能没有反映全身应用和药品营业额/修改肝酶CAM局部应用工作。在此外，约50％的存活率，直到接枝观察由于前卵鸡胚胎的生长条件。关于内皮标志为IHC分析，在人类和小鼠部用于染色的内皮细胞标记物最不特定于血管鸡。因此，我们建议染色壁画细胞标志物结蛋白/ ASMA或凝集素注射到鸡胚35。并不是所有可用人骨髓瘤细胞系将增长到侵入鸡宿主组织并显示肤浅的增长。这将导致损坏的组织切割切片在切片机之后。此外，特别照顾（选择抗生素），应采取转染的细胞没有时间内失去了绿色荧光蛋白转基因表达，由于永久遗传重组或DNA甲基化过程。
总之，人类的MM细胞我们的鸡胚胎移植瘤模型与基质的支持提供了一个可重复和可预测的体内模型STU镝MM细胞生长和血管生成。这说明MM模型可以促进体内的抗MM药物筛选过程更快，有助于缩短开发时间和新药的成本。随着进一步的改进步骤，例如骨替代材料，复杂的ECM基质和细胞因子系统可能用于测试治疗剂还对患者样品得到改善。这是个性化癌症医学和个体难治MM患者药敏试验的先决条件。
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Disclosures
作者有没有竞争经济利益
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
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