Summary
Баллистической трансформации является метод, используемый для генерации стабильной интеграции ДНК в геном оппортунистических neoformans Cryptococcus патоген через гомологичной рекомбинации. Покажем баллистической трансформации в конструкции, имеющей ацетат ген, кодирующий слитый киназы в флуоресцентной метки mCherry в C. neoformans.
Abstract
Базидиального Cryptococcus neoformans, инвазивных патогенных микроорганизмов центральной нервной системы, является наиболее частой причиной грибкового менингита во всем мире, в результате чего более 625 000 человек в год по всему миру. Хотя электропорации была разработана для преобразования плазмид в Cryptococcus, только биолистическую доставка обеспечивает эффективное средство для преобразования линейной ДНК, которые могут быть интегрированы в геном путем гомологичной рекомбинации.
Ацетат было показано, что основным продуктом ферментации при криптококковой инфекции, но значение этого, пока не известно. Бактериальные путь состоит из ферментов, ксилулозо-5-фосфат / фруктозо-6-фосфат phosphoketolase (Xfp) и ацетат киназа (ACK) является одним из трех возможных путей ацетата производства в С neoformans. Здесь мы демонстрируем баллистической трансформации в конструкции,,который ген, кодирующий Ack слит с флуоресцентной меткой mCherry, в С. neoformans. Мы затем подтвердите интеграции слияния ACK -mCherry в локус ACK.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема этого протокола указано на рисунке 1.
1. C. neoformans Подготовка
- Для каждой реакции трансформации, вырастить 2-3 мл O / N культуру C. neoformans в YPD среде при 30 ° С встряхивании при 250 оборотах в минуту.
- Центрифуга O / N культуру в течение 5 мин при 900 х г при 10 ° С и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют каждый осадок клеток в 300 мкл дрожжей пептон декстроза (YPD) среде.
- Используя стеклянные шарики, аккуратно распространяется 300 мкл промытой клеточной суспензии на YPD агаре, содержащем 1 М сорбит.
- Разрешить пластин высохнуть при комнатной температуре в течение 3-4 ч.
2. Золото микроносителю Подготовка
- Ресуспендируют 0,25 г 0,6 мкм золотым бисером в 1 мл DDh 2 O, центрифуги в течение 1 мин при 900 мкг для осаждения бусы, и удалить супернатант.
- Ресуспендируют золотые бусины в 1 мл 100% -ного этанола. </ Li>
- Распределить шарики в 4 пробирки, 250 мкл каждого из них и добавить 750 мкл 100% -ного этанола.
- Хранить золото шарик аликвоты при 4 ° С.
3. Подготовка ДНК
- Подготовка оранжевые диски macrocarrier биолистическую, погружая их в 100% этаноле с использованием щипцов. Место диски в большом чашку Петри, содержащую drierite высохнуть (убедитесь, что drierite не касается дисков).
- После высыхания, нажмите macrocarrier диски в держатели серебро дисков (ранее протирать 100% этанола).
- Vortex золотым бисером (полученного, как в шаге 2) и аликвоту 12 мкл в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, одну трубку в трансформации.
- Добавить в каждую пробирку с тем: 2 мкг ДНК (предпочтительно 2 мкл 1 мкг / мкл ДНК) 10 мкл 2,5 М CaCl 2, и 2 мкл 1 М спермидина свободного основания.
- Установка отрицательный контроль, как на стадии 3,4, но без ДНК.
- Vortex каждая трубка и инкубировать при комнатной температуре в течение5 мин. Аккуратно вылить каждую пробирку иногда ресуспендировать осевшие шарики во время инкубации.
- Побочные трубы на 225 мкг в течение 30 сек для осаждения ДНК-покрытием золотым бисером. Осторожно удалите супернатант (с помощью пипетки или аспирации) и выбросьте.
- Ресуспендируйте шарики полностью в 600 мкл 100% этанола, медленно пипетки вверх и вниз.
- Спин трубы на 225 мкг в течение 30 сек для осаждения шариков без упаковки. Осторожно снимите и выбросьте супернатант.
- Ресуспендируют ДНК покрытием золотые шарики в 8 мкл 100% этанола, медленно пипетированием вверх и вниз.
- Пипетки ДНК покрытием золотые шарики на центре баллистической диска диаметром в 1 см и дать высохнуть.
Примечание: сушили золотой круг видно на центре баллистической диска указывает, что достаточной концентрации золота шариков присутствует.
ПРИМЕЧАНИЕ: macrocarrier загруженных дисков с помощью ДНК-покрытием золотым бисером готовы для использования с генной пушки.
4. Operating в генной пушки
- Включите вакуумный насос.
- Включите газообразного гелия, повернув ручку против часовой стрелки до давления примерно 2200 фунтов на квадратный дюйм достигается на манометр.
- Включите генной пушки, щелкая красный выключатель слева.
- Будьте уверены, что скорость потока для вакуума и вентиляционных настраиваются таким образом вакуум достигнет 28 дюймов ртутного столба в течение 15 сек.
- Будьте уверены, расстояние между разрывным диском и macrocarrier примерно 3/8 дюйма.
- Очистите всю камеру, вытирая с этанолом.
- Погрузите разрывные мембраны в 100% этанола. Дайте высохнуть на стерильную поверхность (например, чашка Петри).
- Используйте динамометрический ключ, чтобы ослабить фиксатор разрыв диска. Вставьте чистую разрывного диска в держатель. Винт держателя разрывной диск на место и затяните динамометрическим ключом, поворачивая его один раз вправо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрыв диски будут заменены после каждого выстрела. - Погрузитесь-йе сетка фильтра в 100% -ном этаноле. Дайте высохнуть на стерильную поверхность (например, чашка Петри).
- После высыхания, поместите экран мыть сетки на белый пластик с монтажной панелью. Поместите macrocarrier диска сторону держатель ДНК вниз в диск камеры. Винт на серебряной крышкой и поместите монтажную пластину в высоком слот.
ПРИМЕЧАНИЕ: сетчатый экран будет заменен после каждого выстрела. - Поместите YPD агаровую пластину, содержащую 1 М сорбит на нижней пластине.
- Завершение отсека и зафиксируйте на месте.
- Нажмите и удерживайте среднюю красный переключатель вверх заниматься вакуум и позволить вакуум, чтобы достигнуть 28 дюймов ртутного столба. После того, как надлежащий уровень вакуума достигается, переместите этот переключатель в нижнее положение. Когда все будет готово, нажмите и удерживайте красную кнопку справа, чтобы стрелять. Когда разрыв диска появляется, сразу же отпустите кнопку пожара и нажмите среднюю красный переключатель в среднем положении, чтобы выразить камеру до 0 фунтов на квадратный дюйм.
- Очистите разрыв диска мусор и выключите генной пушки. Затем выключите heliuм газа, повернув ручку по часовой стрелке и, наконец, выключите вакуумный насос.
5. Покрытие трансформированных клеток
- Разрешить преобразование пластины, чтобы сидеть при комнатной температуре в течение 4 часов, чтобы клетки для восстановления.
- Пипеток 700 мкл YPD на тарелку. Используйте сотовый скребок, чтобы мягко очистить клетки прочь агара и пипетки жидкости в стерильный 1,5 мл пробирке. Повторите этот шаг, чтобы убедиться, что все клетки были извлечены из пластины.
- Гранул клетки при 225 мкг в течение 30 сек. Снимите и выбросьте супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 500 мкл YPD.
- Внесите 100 мкл клеточной суспензии на центре + плит YPD антибиотиков и распространяется, используя стеклянные бусы.
- Оставьте перевернутые тарелки при комнатной температуре в течение 3-4 дней. Как появляются колонии, патч на новой YPD + антибиотиков пластин.
6. Геномная выделения ДНК для ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Это модифицированная версия с использованием реагентас из комплекта очистки ДНК (табл материалов).
- Выращивают культуры в 5 мл каждого из С neoformans трансформанты в YPD жидкости при 30 ° C встряхивании при 250 оборотах в минуту O / N.
- Гранул 3 мл клеток при 900 мкг, и ресуспендируют в 600 мкл ядер решения лизиса.
- Добавить суспензии в новой 1,5 мл микроцентрифужных трубки с 200 мкл 0,5 мм кислоты промывают стеклянные шарики.
- Однородный в течение 45 секунд в мини beadbeater при температуре окружающей среды, прохладном трубки на льду, и повторить.
- Разрешить образца оседать на льду в течение 2 мин и передавать супернатант в новую пробирку 1,5 мл. Добавить 200 мкл раствора осаждения белка в каждую пробирку, (100 мкл на каждые 600 мкл супернатанта восстановленного) и вихрь энергично в течение 20 сек.
- Разрешить образцы поселиться на льду в течение 5 мин и центрифуге при 11000 мкг в течение 3 мин.
- Передача супернатант в чистую пробирку, содержащую 1,5 мл 300 мкл RT изопропанола. Аккуратно перемешать инверсии.
- Центрифуга образцы на 11000 мкг в течение 2 мин, осторожно удалить супернатант, и слейте трубы на бумажные полотенца.
- Добавить 300 мкл RT 70% этанола в каждую пробирку и осторожно инвертируют, чтобы промыть осадок.
- Центрифуга образцов при 11000 мкг в течение 2 мин и осторожно удалите всю этанола.
- Слейте трубки на чистые бумажные полотенца, и позволяют гранулы высохнуть на воздухе в течение 10-15 мин.
- Добавить 50 мкл регидратации ДНК раствора и 1,5 мкл раствора РНКазы на каждую гранулу и вихря.
- Центрифуга образцы в течение 5 секунд, чтобы удалить всю жидкость из колпачка.
- Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение 15 мин.
- Увлажняет ДНК путем инкубации образцов при 65 ° С в течение 1 часа.
- Количественная ДНК спектрофотометрически путем измерения оптической плотности при 260 нм (260 считывания 1,0 эквивалентно ~ 50 мкг / мл двухцепочечной ДНК), и использовать до 200 нг в каждой реакции ПЦР.
7. РНК Изоляция дляРевертазам-ПЦР.
- Использование очистки РНК комплект (смотрите таблицу материалов), следовать инструкциям производителя, чтобы изолировать РНК из клеток дрожжей при использовании minibeadbeater.
- Количественная концентрации РНК путем измерения оптической плотности при 260 нм (260 считывания 1,0 эквивалентно ~ 40 мкг / мл одноцепочечной РНК).
- Использование комплекта RT-PCR (смотрите таблицу материалов), следовать инструкциям производителя, чтобы установить RT-PCR реакции с примерно 1 мкг РНК. Для результатов, полученных в этом исследовании, использование праймеров, перечисленных в таблице 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешный баллистической трансформации С. neoformans можно получить, пройдя по этой схеме протокола (рисунок 1). С баллистической трансформации, успешно стрелять из покрытых золотом шариков обозначено золотое кольцо видимой на пластине после выстрела ДНК (Фигура 2А). Колонии должны появляться пределах от 4 до 5 дней, когда оставляют при комнатной температуре после посева клеток восстановленные из сорбита пластин YPD + 1M на селективной среде. Преобразование 2 мкг ДНК должно привести к 20 до 30 колоний (фиг.2В). При появлении колонии, они должны быть пересевали штрихом на селективных средах для отдельных колоний.
Отдельные колонии могут быть выращены в YPD массовой информации, а как ДНК и РНК может быть выделена из этих клеток и анализировали с помощью ПЦР и ОТ-ПЦР, чтобы подтвердить правильность интеграции и экспрессии. Если этот протокол используется для помеченной слияния генов, как в этом примере, праймеры потребуется тO отжиг в кодирующей области гена, представляющего интерес (праймер 2) и в некодирующей области 3'-части гена (грунтовки) 4 (фиг.3А). С этой конструкции ДНК амплифицировали из ПЦР секвенировали для подтверждения того, что другой тег mCherry был слит в рамке с геном ACK. Положительное подтверждение ПЦР будет больше, ПЦР-продукт из ДНК, выделенной из трансформированных клеток по сравнению с ДНК, выделенной из клеток дикого типа. Другой ПЦР также должны быть проведены с использованием набора праймеров (праймеры 2 и 5), где один праймер гибридизуется пределами конструкции, так и в окружающей генома (5) праймеров для подтверждения правильного рекомбинации в желаемом локусе (7 праймеров в таблице 1) (фиг.3В). ОТ-ПЦР будет использоваться, чтобы убедиться, что и интересующий ген и тег оба выражены (фиг.3С). Секвенирование продукт слияния инди RT-PCRняет, что тег правильно, слитый с геном на уровне РНК.
Если этот протокол используется, чтобы выбить интерес ген, наборов праймеров для ПЦР должны быть сконструированы таким образом, что один праймер гибридизуется с последовательностью геномной пределами, где конструкция должна рекомбинируют в геном, а другой праймер гибридизуется либо в кодирующей области гена или селективного маркера. Положительное подтверждение того, что конструкция успешно и правильно рекомбинации в геном была бы присутствие корректного продукта размера для набора праймеров, которые отжигается пределах маркера, но не с набором праймеров, которые отжигается с интересующего гена. Другой набор праймеров следует, что имеет один праймер, который гибридизуется пределами предназначенной конструкции, которая используется при ПЦР, чтобы подтвердить, что событие рекомбинации происходит при правильном локуса. В той же конструкции, чтобы создать нокаут, РНК выделяют из обоих трансформированных клеток и дикого типа (WT) клеток, и ОТ-ПЦР является выполнены, чтобы подтвердить, что не выражение гена не наблюдается из трансформированных клеток.
Поскольку флуоресцентной метки был слит с геном ACK, еще одним подтверждением, что рекомбинации был успешным в желаемом локусе и что РНК переводится в белок через флуоресцентной микроскопии (фиг.4). В идеале, условия уже были созданы, где известно, что белок, представляющий интерес, выражается. Однако, если флуоресцентный сигнал слишком слаб, чтобы наблюдать, есть вероятность того, что успешный рекомбинации еще произошло, но условия роста, должны быть изменены в случайно, что оптимальные условия не были соблюдены в течение достаточного выражения, которое привело бы к низкой флуоресцентной сигнал. Это должны быть подтверждены с помощью других способов, таких как вестерн-блоттинга.
"/>
Рисунок 1. Схема протокола.
2А. ДНК-покрытием золото шарики успешно выстрел на сорбит пластины YPD + 1М. Оранжевый патч видно в центре пластины сорбита YPD + 1М обусловлено, покрытых ДНК золотой бисер, указывающий надлежащей подготовки золота, а также успешного побега . 2В. Преобразование 2 мкг ДНК приводит к 20-30 колоний на чашку. Если клетки разводили, как указано в протоколе, примерно 20-30 колоний, как ожидается, до высева на селективной среде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
3А. Схема ACK: mCherry:.. Neo конструкция и праймеров 3В ПЦР используется для подтверждения успешного гомологичной рекомбинации. Полосы 1 и 2: ПЦР-продукты получали с использованием праймеров, 2 и 5 (таблица 1) с геномной ДНК из дикого типа С neoformans H99 (дорожка 1) и ACK: mCherry трансформированный штамм, (дорожка 2). Ожидаемые размеры 1511 и 5622 б.п., соответственно. Дорожки 3 и 4 ДНК продукты С neoformans H99 (ожидается размер 1443 п.о.) и АСК: mCherry (ожидается размер 5552 п.о.) штаммы, соответственно, с использованием праймеров, 2 и 4 в таблице 1. Дорожки 5 и 6 являются ДНК продукты С neoformans H99 (не должна отжигать) и АСК: mCherry (ожидаемого размера 3016 п.н.) штаммы, соответственно, с использованием праймеров 1 и 3. Фигура 3С RT-PCR подтверждение экспрессии тега mCherry.. Лучшие переулки кДНК продукты продукта слияния ACKmCherry (ожидаемый размер 683 п.н.) усиливается от С. neoformansH99 и АСК:. Штаммы mCherry с использованием праймеров, 2 и 3 в таблице 1 гена актина был включен в качестве контроля, и амплифицировали в таких же условиях, как ACKmCherry (ожидается размер 567 п.н.) с использованием праймеров, 6 и 7 в таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. флуоресценции mCherry тегами ACK. Микроскопический анализ штаммы, продуцирующие Ack слиты с тегом mCherry с оптимальным возбуждения при 587 нм и оптимальное излучения на длине волны 610 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| 1 | КI003 | 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC САС - 3 " |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'-GCT ТТГ GCC GGT ACT ACC AAC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'-GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG 3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC ТТГ GGG AAG AGG AAT TC - 3 " |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC УВД AAT AAA AGC TTT СТТ CAC TCC - 3 " |
| 6 | Актина 1 | 5'-CGC ТАТ CCT CCG ТАТ CGA TCT ТГК-3 ' |
| 7 | Актина 2 | 5'-CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC-3 ' |
Таблица 1. ПЦР и ОТ-ПЦР-праймеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана награды от Национального научного фонда (премии # 0920274) и Южная Каролина опытная станция проекта SC-1700340. Эта статья isTechnical Вклад No. 6283 из опытной станции Университет Клемсона. Авторы благодарят доктора Лукаш Kozubowski за полезные советы в развитии этого итогового протокола и д-р Шерил Ingram-Смит, Кэти Гленн, и Грейс Kisirkoi их критическое прочтение рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
- Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
- Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
- Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
- Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
- Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
- Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
- Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
- McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).
