Summary
Biolistisk omvandling är en metod som används för att generera en stabil integrering av DNA i genomet hos de opportunistiska patogenen Cryptococcus neoformans genom homolog rekombination. Vi kommer att visa biolistisk transformation av en konstruktion, som har den gen som kodar acetatkinas smält till den fluorescerande taggen mCherry in C. neoformans.
Abstract
Den basidiomycet Cryptococcus neoformans, en invasiv opportunistisk patogen av det centrala nervsystemet, är den vanligaste orsaken till svampmeningit globalt ledde till mer än 625.000 dödsfall per år i hela världen. Även elektroporering har utvecklats för omvandlingen av plasmider i Cryptococcus, ger bara biolistisk leverans ett effektivt medel för att omvandla linjära DNA som kan integreras i genomet genom homolog rekombination.
Acetat har visat sig vara en stor jäsningsprodukt under krypto infektion, men betydelsen av detta är ännu inte känt. En bakteriell väg bestående av enzymerna xylulos-5-fosfat / fruktos-6-fosfat phosphoketolase (Xfp) och acetatkinas (ACK) är en av tre möjliga vägar för acetat produktion i C. neoformans. Här visar vi den biolistiska transformationen av en konstruktion,som har den gen som kodar Ack fuserad till den fluorescerande taggen mCherry, in C. neoformans. Vi bekräfta sedan integrationen av ACK -mCherry fusion i ACK locus.
Protocol
OBS: Det övergripande system av det här protokollet beskrivs i figur 1.
1. C. neoformans Framställning
- För varje transformationsreaktion, växa en 2-3 ml O / N-kulturen av C. neoformans i YPD-medium vid 30 ° C under skakning vid 250 rpm.
- Centrifugera O / N-kulturen under 5 min vid 900 xg vid 10 ° C och kasta bort supernatanten.
- Resuspendera varje cell pelleten i 300 pl jäst, pepton dextros (YPD) medium.
- Användning av glaspärlor, sprids försiktigt 300 ul av den tvättade cellsuspension på YPD-agar innehållande 1 M sorbitol.
- Låt plattorna torka i rumstemperatur i 3-4 timmar.
2. Guld mikrobärare Framställning
- Resuspendera 0,25 g av 0,6 um guld pärlor i 1 ml DDH 2 O, att centrifugera i 1 min vid 900 xg pellet pärlorna och avlägsna supernatanten.
- Resuspendera guld pärlor i 1 ml 100% etanol. </ Li>
- Fördela pärlorna i fyra rör, 250 ul vardera, och tillsätt 750 | il av 100% etanol.
- Förvara guld pärla portioner vid 4 ° C.
3. DNA-preparation
- Förbered apelsin macrocarrier biolistiska skivor genom att sänka dem i 100% etanol med hjälp pincett. Placera skivor i en stor petriskål med drierit torka (se till drierit inte röra skivorna).
- När torr, pressa macrocarrier skivorna i silverskivhållare (tidigare torkas av med 100% etanol).
- Vortex guldpärlor (framställda som i steg 2) och alikvoter 12 | il i en 1,5 ml mikrocentrifugrör, ett rör per transformation.
- Lägg till varje rör i ordning: 2 ig DNA (företrädesvis 2 pl av 1 pg / pl av DNA), 10 | il 2,5 M CaCl2 och 2 | il 1 M spermidin fri bas.
- Inrätta en negativ kontroll som i steg 3.4 men utan DNA.
- Vortex varje rör och inkubera vid rumstemperatur under5 min. Flick försiktigt varje rör då och då för att resuspendera bosatte pärlorna under denna inkubation.
- Spin rören vid 225 xg under 30 sek för att pelletera DNA-belagda guldpärlor. Ta försiktigt bort supernatanten (genom pipettering eller aspiration) och kassera.
- Resuspendera pärlor helt i 600 pl 100% etanol genom långsamt pipettera upp och ned.
- Spin rören vid 225 xg under 30 sek till pellets pärlorna utan packning. Försiktigt bort och kassera supernatanten.
- Resuspendera DNA-belagda guldpärlor i 8 | il av 100% etanol genom att långsamt pipettera upp och ned.
- Pipet de DNA-belagda guldpärlor på mitten av den biolistiska skivan i en 1 cm diameter och låt torka.
ANMÄRKNING: En torkad guld cirkel synlig på mitten av den biolistiska skivan indikerar att en tillräcklig koncentration av guldpärlor är närvarande.
OBS: De macrocarrier skivor som finns med DNA-belagda guldkulorna är nu redo för användning med genkanonen.
4. Oörelseresultatet genkanonen
- Slå på vakuumpumpen.
- Slå på heliumgas genom att vrida ratten moturs tills ett tryck på cirka 2.200 psi nås på manometern.
- Slå på genen pistol genom att bläddra den röda knappen till vänster.
- Se till att flödeshastigheter för vakuumet och ventilations justeras så vakuumet når 28 inches Hg inom 15 sek.
- Var noga med att avståndet mellan brottskivan och macrocarrier är ungefär 3/8 tum.
- Rengör hela kammaren genom att torka ner med etanol.
- Sänk Brytningen skivorna i 100% etanol. Låt torka på en steril yta (t.ex. petriskål).
- Använd en momentnyckel för att lossa sprängskivhållaren. Sätt i en ren sprängplatta i hållaren. Skruva sprängskivhållaren på plats och dra åt med momentnyckel genom att vrida den en gång åt höger.
OBS: Bristning skivor ersätts efter varje skott. - Sänk the mesh skärmar i 100% etanol. Låt torka på en steril yta (t.ex. petriskål).
- När torr, placera en tvättad mesh på den vita plastmonteringsplatta. Placera macrocarrier skivhållaren DNA sidan nedåt i skivkammaren. Skruva på silverlocket och placera monteringsplatta i högsta platsen.
OBS: Mask Skärmen kommer att ersättas efter varje skott. - Placera en YPD-agarplatta innehållande 1 M sorbitol på bottenplattan.
- Stäng kammardörren och låses på plats.
- Tryck och håll i mitten röda omkopplaren upp att engagera vakuum och låt vakuumet att nå 28 inches Hg. När lämplig vakuumnivån uppnås, flytta denna omkopplaren till det nedre läget. När du är klar, håll ned den röda brytaren till höger för att skjuta. När sprängplattan dyker omedelbart släppa elden knappen och tryck mitt röda omkopplaren till mittläget att ventilera kammaren till 0 psi.
- Rengör rupturskiva skräp och stäng av genen pistolen. Stäng sedan av helium gas genom att vrida ratten medurs, och slutligen stänga av vakuumpumpen.
5. Plating transformerade celler
- Låt transformationsplattorna för att sitta vid RT i 4 h för att tillåta cellerna att återhämta sig.
- Pipettera 700 pl YPD på plattan. Använd en cellskrapa för att försiktigt skrapa cellerna bort av agar och pipetten vätska i en steril 1,5 ml mikrofugrör. Upprepa detta steg för att säkerställa att alla celler har återhämtat sig från plattan.
- Pellets cellerna vid 225 xg under 30 sek. Avlägsna och kassera supernatanten.
- Suspendera pelleten i 500 l av YPD.
- Pipettera 100 | il av cellsuspensionen på mitten av YPD + antibiotiska plattor och sprids med hjälp av glaspärlor.
- Lämna inverterade plattorna vid RT under 3-4 dagar. Som kolonier visas plåstret på nytt YPD + antibiotikaplattor.
6. Genomisk DNA-isolering för PCR
OBS: Detta är en modifierad version med reagenss från en DNA-rening kit (Se tabell för material).
- Odla en 5 ml kultur av var och en av C. neoformans transformanter i flytande YPD vid 30 ° C under skakning vid 250 rpm O / N.
- Pellets 3 ml celler vid 900 xg, och återsuspendera i 600 l av kärnor lyslösning.
- Lägg suspensionen till en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör med 200 ^ il 0,5 mm syratvättade glaspärlor.
- Homogenisera under 45 sek i en mini beadbeater vid omgivande temperatur, kyler rör på is, och upprepa.
- Låt provet sätta sig på is i 2 min och överföra supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör. Tillsätt 200 pl proteinutfällning lösning till varje rör, (100 l för varje 600 pl supernatant återvinnas) och skaka kraftigt i 20 sekunder.
- Låt proven sedimentera på is under 5 min, och centrifugera vid 11000 xg under 3 min.
- Överför supernatanten till ett rent 1,5 ml rör innehållande 300 ^ il RT-isopropanol. Blanda försiktigt genom inversion.
- Centrifugera proverna vid 11.000 xg under 2 min, försiktigt bort supernatanten och töm rören på hushållspapper.
- Lägg 300 ul av RT 70% etanol till varje rör, och vänd försiktigt att tvätta pelleten.
- Centrifugera proverna vid 11000 x g under 2 min och noggrant avlägsna allt av etanolen.
- Töm röret på rena pappershanddukar, och tillåta pelleten lufttorka i 10 till 15 minuter.
- Lägg 50 pl DNA vätskeersättning och 1,5 pl RNas lösning till varje pellet och virvel.
- Centrifugera prover för 5 sek för att avlägsna all vätska från locket.
- Inkubera proverna vid 37 ° C i 15 min.
- Rehydrera DNA genom inkubation av proverna vid 65 ° C under 1 h.
- Kvantifiera DNA spektrofotometriskt genom mätning av absorbansen vid 260 nm (ett A 260 läsning av 1,0 är ekvivalent med ~ 50 ^ g / ml dubbelsträngat DNA), och använda upp till 200 ng i varje PCR-reaktion.
7. RNA Isolation förOmvänd transkriptas-PCR.
- Med hjälp av en RNA-reningssats (Se tabell för material), följ tillverkarens instruktioner för att isolera RNA från jästceller med hjälp av en minibeadbeater.
- Kvantifiera koncentrationen av RNA genom att mäta absorbansen vid 260 nm (ett A 260 läsning av 1,0 är ekvivalent med ~ 40 ^ g / ml enkelsträngat RNA).
- Använda en RT-PCR kit (Se tabell för material), följ tillverkarens instruktioner för att ställa in RT-PCR-reaktioner med cirka 1 pg av RNA. För de resultat som erhållits i denna studie, använder primers som anges i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En framgångsrik biolistisk omvandlingen av C. neoformans kan erhållas genom att följa detta protokoll schema (figur 1). Med biolistisk transformation är en framgångsrik skjuta av de belagda guldpärlor indikeras av en guldring synlig på plattan efter DNA är skjuten (Figur 2A). Kolonier bör visas inom 4 till 5 dagar när de lämnas i rumstemperatur efter plätering de återvunna cellerna från YPD + 1M sorbitol plattor på selektiva medier. Transforming 2 ig DNA bör resultera i 20-30 kolonier (Figur 2B). När kolonier visas, bör de ströks på selektiva medier för enskilda kolonier.
De enskilda kolonier kan odlas i YPD media, och både DNA och RNA kan isoleras från dessa celler och analyseras genom PCR och RT-PCR för att bekräfta korrekt integration och yttrandefrihet. Om detta protokoll används för taggad genfusionen, som i detta exempel, skulle primers behöver to glödgning inom den kodande regionen av genen av intresse (primer 2) och inom 3 'icke-kodande regionen av genen av intresse (primer 4) (figur 3A). Med denna konstruktion ades DNA amplifierades från PCR-reaktionen sekvenser för en bekräftelse på att den mCherry-markör fuserad i ram till ACK-genen. En positiv PCR bekräftelse skulle vara en större PCR-produkten från det DNA som isolerats från de transformerade celler jämfört med den DNA som isolerats från de vildtypsceller. En annan PCR-reaktion skulle också behöva genomföras utnyttja primeruppsättningen (primers 2 & 5), där en primer hybridiserar utanför konstruktionen och inom den omgivande genomet (primer 5) för att bekräfta den korrekta rekombination in önskad locus (primer 7 i tabell 1) (Figur 3B). RT-PCR kommer att användas för att se till att både genen av intresse och taggen är båda uttryckta (Figur 3C). Sekvensering av RT-PCR-fusionsprodukten indikerar att etiketten är korrekt fuserad till genen på RNA-nivå.
Om detta protokoll utnyttjas för att slå ut en gen av intresse, bör primeruppsättningar för PCR vara utformad så att en primer hybridiserar till en genomsekvens utanför där konstruktet bör rekombinera i genomet, och den andra primersekvensen hybridiseras antingen i den kodande regionen av genen eller i den selektiva markören. En positiv bekräftelse att konstruktionen framgångsrikt och korrekt har rekombinerat in i genomet skulle vara närvaron av korrekt storlek produkt för primeruppsättningen som hybridiserar inom markören men inte med den primeruppsättning som hybridiserar till genen av intresse. En annan primer set bör göras som har en primer som hybridiserar utanför utformade konstruktionen, som används med PCR för att bekräfta att rekombination inträffade vid rätt ställe. I samma design för att skapa en knockout, är RNA isolerat från både de transformerade cellerna och vildtyp (WT) celler, och RT-PCR är utföras för att bekräfta att ingen expression av genen av intresse observeras från de transformerade cellerna.
Eftersom en fluorescerande tagg fuserades till ACK-genen, en bekräftelse på att rekombination var en framgång i det önskade stället och att RNA översätts till protein är genom fluorescensmikroskopi (figur 4). Helst har förutsättningar redan etablerats där det är känt att proteinet av intresse uttrycks. Men om den fluorescerande signalen är för låg för att observera, finns det en möjlighet att framgångsrik rekombination fortfarande förekom, men tillväxtförhållanden måste ändras i chansen att optimala förhållanden inte har uppfyllts i tillräckligt uttryck, vilket skulle leda till en låg fluorescerande signalen. Detta skulle behöva bekräftas genom andra metoder såsom en western blöt.
"/>
Figur 1. Protokoll system.
Figur 2A. DNA-belagda guldpärlor framgångsrikt skjutit på en YPD + 1M sorbitol platta. En orange lapp ses i mitten av YPD + 1M sorbitol plattan beror på DNA-belagda guldpärlor, vilket indikerar korrekt guld förberedelse, samt en lyckad shoot . Figur 2B. Transforming 2 pg av DNA-resultat i 20-30 kolonier per platta. Om cellerna späddes som nämns i protokollet, är ca 20-30 kolonier väntas före plätering på selektiva medier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3A. Skiss över ACK: mCherry:.. Neo konstruktion och primer design Figur 3B PCR används för att bekräfta framgångsrik homolog rekombination. Spår 1 och 2: PCR-produkter som erhållits med användning av primrarna 2 och 5 (tabell 1) med genomiskt DNA från vild typ C. neoformans H99 (lane 1) och ACK: mCherry transformerad stam, (spår 2). Förväntade storlekar är 1511 och 5622 bp, respektive. Raderna 3 och 4 är de DNA-produkterna från C. neoformans H99 (förväntad storlek 1443 bp) och ACK: mCherry (förväntad storlek 5552 bp) stammar, respektive, med användning av primrarna 2 och 4 i tabell 1. Spår 5 och 6 är de DNA-produkterna från C. neoformans H99 (bör inte glödga) och ACK: mCherry (förväntade storleken 3016 bp) stammar, respektive, med användning av primers 1 och 3. Figur 3C RT-PCR-bekräftelse av uttryck av mCherry taggen.. Den översta körfält är cDNA produkter av ACKmCherry fusionsprodukten (förväntad storlek 683 bp) förstärks från C. neoformansH99 och ACK:. MCherry stammar använder primers 2 och 3 i tabell 1 aktingenen ingick som en kontroll och förstärktes under samma förhållanden som ACKmCherry (förväntad storlek 567 bp) använder primers 6 och 7 i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Fluorescens av mCherry taggade Ack. Mikroskopisk analys av stammar som producerar Ack smält till en mCherry tagg med en excitation optimum vid 587 nm och en emissions optimalt vid 610 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1 | KI003 | 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'- GCT TTG GCC GGT ACT ACC AAC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 " |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | Aktin 1 | 5'CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 " |
| 7 | Actin 2 | 5'CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 " |
Tabell 1. PCR och RT-PCR-primrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av utmärkelser från National Science Foundation (Award # 0.920.274) och South Carolina Experiment Station Project SC-1.700.340. Denna uppsats isTechnical bidrag nr 6283 i Clemson University Experiment Station. Författarna tackar Dr Lukasz Kozubowski för hans goda råd i utvecklingen av denna slutliga protokollet och Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, och Grace Kisirkoi för deras kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
- Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
- Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
- Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
- Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
- Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
- Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
- Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
- McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).
