Summary
Biolistic परिवर्तन मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से अवसरवादी रोगज़नक़ क्रिप्टोकोकस neoformans के जीनोम में डीएनए के स्थिर एकीकरण उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक विधि है। हम सी neoformans में फ्लोरोसेंट टैग mCherry के लिए जुड़े जीन एन्कोडिंग एसीटेट काइनेज है, जो एक निर्माण, के biolistic परिवर्तन प्रदर्शन करेंगे।
Abstract
basidiomycete क्रिप्टोकोकस neoformans, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए एक आक्रामक अवसरवादी रोगज़नक़, दुनिया भर में दुनिया भर में प्रति वर्ष से अधिक 625.000 मौतों का कारण फंगल दिमागी बुखार के सबसे लगातार कारण है। Electroporation के क्रिप्टोकोकस में plasmids के परिवर्तन के लिए विकसित किया गया है, केवल biolistic डिलीवरी मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा जीनोम में एकीकृत किया जा सकता है कि रैखिक डीएनए को बदलने के लिए एक प्रभावी साधन प्रदान करता है।
एसीटेट क्रिप्टोकोकल संक्रमण के दौरान एक प्रमुख किण्वन उत्पाद होना दिखाया गया है, लेकिन इस बात का महत्व अभी तक ज्ञात नहीं है। एंजाइमों xylulose-5-फॉस्फेट / फ्रुक्टोज-6-फॉस्फेट phosphoketolase (Xfp) और एसीटेट काइनेज (ACK) से बना एक बैक्टीरियल मार्ग सी में एसीटेट उत्पादन के लिए तीन संभावित रास्ते में से एक है neoformans। यहाँ, हम एक निर्माण के biolistic परिवर्तन का प्रदर्शन,Ack एन्कोडिंग जीन, mCherry फ्लोरोसेंट टैग के लिए जुड़े हुए सी में है जो neoformans। हम तो एसीके ठिकाना में एसीके -mCherry संलयन के एकीकरण की पुष्टि करें।
Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल की समग्र योजना चित्रा 1 में उल्लिखित है।
1. सी neoformans तैयारी
- प्रत्येक परिवर्तन प्रतिक्रिया के लिए, सी के 2-3 मिलीलीटर हे / एन संस्कृति विकसित 30 डिग्री सेल्सियस पर YPD मध्यम में neoformans 250 rpm पर मिलाते हुए।
- 10 डिग्री सेल्सियस पर 900 XG पर 5 मिनट के लिए हे / एन संस्कृति अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- खमीर peptone Dextrose (YPD) माध्यम के 300 μl में प्रत्येक सेल गोली Resuspend।
- कांच के मोती का प्रयोग, धीरे 1 एम सोर्बिटोल युक्त YPD अगर पर धोया सेल निलंबन के 300 μl फैल गया।
- प्लेटों में 3-4 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर सूखे की अनुमति दें।
2. गोल्ड microcarrier तैयारी
- DDH 2 ओ के 1 मिलीलीटर में 0.6 माइक्रोन सोने की माला के 0.25 छ Resuspend, 900 XG पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र मोती गोली, और सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए।
- 100% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में सोने की माला Resuspend। </ ली>
- 4 ट्यूबों, प्रत्येक μl 250 में मोती वितरित, और 100% इथेनॉल के 750 μl जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर सोने मनका aliquots।
3. डीएनए की तैयारी
- 100% इथेनॉल का उपयोग संदंश में उन्हें जलमग्न द्वारा नारंगी macrocarrier biolistic डिस्क तैयार करें। सूखे के लिए drierite युक्त एक बड़े पेट्री डिश में जगह डिस्क (drierite डिस्क स्पर्श नहीं करता है सुनिश्चित करें)।
- एक बार सूखा, (पहले 100% इथेनॉल के साथ नीचे साफ) चांदी डिस्क धारकों में macrocarrier डिस्क दबाएँ।
- परिवर्तन के प्रति एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, एक ट्यूब में (चरण 2 के रूप में तैयार) भंवर सोने की माला और विभाज्य 12 μl।
- क्रम में प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें: 2 डीएनए के माइक्रोग्राम प्रति (अधिमानतः एक माइक्रोग्राम प्रति डीएनए के / μl के 2 μl), 10 μl 2.5 एम 2 CaCl, और 2 μl 1 एम spermidine मुक्त आधार।
- 3.4 कदम के रूप में, लेकिन कोई डीएनए के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण स्थापित करें।
- भंवर प्रत्येक ट्यूब और के लिए परिवेश के तापमान पर सेते5 मिनट। धीरे इस ऊष्मायन के दौरान बसे मोती resuspend करने के लिए कभी कभी प्रत्येक ट्यूब झटका।
- 30 सेकंड के लिए 225 XG पर स्पिन ट्यूब डीएनए लेपित सोने की माला गोली। ध्यान से (pipetting या आकांक्षा से) सतह पर तैरनेवाला हटाने और त्यागें।
- धीरे-धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा पूरी तरह से 100% इथेनॉल के 600 μl में Resuspend मोती।
- पैकिंग के बिना मोती गोली के लिए 30 सेकंड के लिए 225 XG पर ट्यूब स्पिन। ध्यान हटाने के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- धीरे-धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 100% इथेनॉल के 8 μl में डीएनए लेपित सोने की माला Resuspend।
- एक 1 सेमी व्यास में biolistic डिस्क के केन्द्र पर डीएनए लेपित सोने की माला पिपेट और शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
नोट: biolistic डिस्क के केन्द्र पर दिखाई एक सूखे गोल्ड सर्किल सोने की माला की पर्याप्त एकाग्रता मौजूद है जो इंगित करता है।
नोट: डीएनए लेपित सोने की माला के साथ भरी हुई macrocarrier डिस्क अब जीन बंदूक के साथ प्रयोग के लिए तैयार कर रहे हैं।
4. हेजीन गन perating
- वैक्यूम पंप पर बारी।
- लगभग 2,200 साई के दबाव में जब तक वामावर्त घुंडी मोड़ से हीलियम गैस पर मुड़ें दबाव गेज पर पहुँच जाता है।
- बाईं तरफ लाल स्विच flipping द्वारा जीन बंदूक चालू करें।
- वैक्यूम 15 सेकंड के भीतर 28 इंच पारा पहुंच जाएगा ताकि निर्वात और बाहर निकलने के लिए प्रवाह दर को समायोजित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
- टूटना डिस्क और macrocarrier के बीच की दूरी लगभग 3/8 इंच है सुनिश्चित करें।
- इथेनॉल के साथ नीचे पोंछते द्वारा पूरे चैम्बर साफ करें।
- 100% इथेनॉल में टूटना डिस्क डूब। एक बाँझ सतह पर सूखे की अनुमति दें (जैसे, पेट्री डिश)।
- टूटना डिस्क धारक ढीला करने के लिए एक टोक़ रिंच का उपयोग करें। धारक में एक साफ टूटना डिस्क डालें। वापस जगह में टूटना डिस्क धारक पेंच और सही करने के लिए एक बार यह मोड़ से टोक़ रिंच के साथ कस लें।
नोट: टूटना डिस्क प्रत्येक गोली मार निम्नलिखित प्रतिस्थापित किया जाएगा। - वें डूब100% इथेनॉल में ई जाल स्क्रीन। एक बाँझ सतह पर सूखे की अनुमति दें (जैसे, पेट्री डिश)।
- एक बार सूखा, सफेद प्लास्टिक बढ़ते थाली पर एक धोया जाल स्क्रीन जगह है। डिस्क कक्ष में नीचे macrocarrier डिस्क धारक डीएनए की ओर रखें। चांदी टोपी पर पेंच, और उच्चतम स्लॉट में बढ़ते थाली जगह है।
नोट: जाल स्क्रीन प्रत्येक शूटिंग के बाद बदल दिया जाएगा। - नीचे की थाली पर एक एम सोर्बिटोल युक्त एक YPD अगर प्लेट रखें।
- चैम्बर दरवाजा बंद है और जगह में ताला।
- पुश और वैक्यूम संलग्न हैं और वैक्यूम 28 इंच पारा तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए मध्य लाल स्विच को पकड़। उचित निर्वात स्तर पर पहुंच गया है, एक बार नीचे की स्थिति के लिए इस स्विच चाल है। जब तैयार है, आग करने के लिए सही पर लाल स्विच दबाए रखें। टूटना डिस्क चबूतरे करते हैं, तो तुरंत आग बटन जारी है और 0 साई चैम्बर बाहर निकलने के लिए मध्यम स्थिति को मध्यम लाल स्विच धक्का।
- टूटना डिस्क मलबे को साफ करें और जीन बंदूक बंद कर देते हैं। तब heliu बंद कर देते हैंघुंडी दक्षिणावर्त मोड़, और अंत में, वैक्यूम पंप बंद कर देते द्वारा एम गैस।
5. चढ़ाना बदल कोशिकाओं
- परिवर्तन प्लेटों कोशिकाओं को ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए चार घंटे के लिए आरटी पर बैठने की अनुमति।
- थाली पर YPD के पिपेट 700 μl। धीरे एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में अगर और पिपेट तरल के बंद कोशिकाओं परिमार्जन करने के लिए एक सेल खुरचनी का प्रयोग करें। सभी कोशिकाओं थाली से बरामद किया गया है सुनिश्चित करने के लिए इस चरण को दोहराएँ।
- 30 सेकंड के लिए 225 XG पर गोली कोशिकाओं। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- YPD के 500 μl में गोली resuspend।
- पिपेट 100 YPD + एंटीबायोटिक प्लेटों के केन्द्र पर सेल निलंबन के μl और ग्लास मनकों का उपयोग फैल गया।
- 3-4 दिनों के लिए आरटी पर औंधा प्लेटों छोड़ दें। कालोनियों दिखाई देते हैं के रूप में, नए YPD + एंटीबायोटिक प्लेटों पर पैच।
पीसीआर के लिए 6. जीनोमिक डीएनए अलगाव
नोट: यह अभिकर्मक का उपयोग करते हुए एक संशोधित संस्करण हैएक डीएनए शुद्धि किट से एस (सामग्री की तालिका देखें)।
- सी में से प्रत्येक के एक 5 मिलीलीटर संस्कृति विकसित 30 डिग्री सेल्सियस पर YPD तरल में neoformans transformants 250 आरपीएम हे / एन पर मिलाते हुए।
- 900 XG पर कोशिकाओं के 3 मिलीलीटर गोली, और नाभिक lysis समाधान के 600 μl में Resuspend।
- 0.5 मिमी एसिड के 200 μl के साथ एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब निलंबन जोड़ें कांच के मोती धोया।
- बर्फ पर परिवेश के तापमान, शांत ट्यूब पर एक मिनी beadbeater में 45 सेकंड के लिए homogenize, और दोहराएँ।
- नमूना दो मिनट के लिए बर्फ पर बसा है और एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण करने की अनुमति दें। 20 सेकंड के लिए सख्ती और भंवर (सतह पर तैरनेवाला बरामद की हर 600 μl के लिए 100 μl), प्रत्येक ट्यूब प्रोटीन तेज़ी समाधान के 200 μl जोड़ें।
- नमूने 5 मिनट के लिए बर्फ पर बसा है, और 3 मिनट के लिए 11,000 XG पर अपकेंद्रित्र करने की अनुमति दें।
- आरटी isopropanol के 300 μl युक्त एक साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। धीरे उलटा द्वारा मिश्रण।
- नमूने अपकेंद्रित्र 2 मिनट के लिए 11,000 XG पर, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने, और कागज तौलिए पर ट्यूब नाली।
- प्रत्येक ट्यूब आर टी 70% इथेनॉल के 300 μl जोड़ें, और धीरे गोली धोने के लिए पलटना।
- ध्यान से 11,000 2 मिनट के लिए XG, और कम से नमूने अपकेंद्रित्र इथेनॉल के सभी को हटा दें।
- साफ कागज तौलिए पर ट्यूब नाली, और 10-15 मिनट के लिए शुष्क हवा की गोली अनुमति देते हैं।
- डीएनए पुनर्जलीकरण समाधान के 50 μl और प्रत्येक गोली और भंवर RNase समाधान के 1.5 μl जोड़ें।
- 5 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र नमूने टोपी से तरल के सभी हटाने के लिए।
- 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
- 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूने incubating द्वारा डीएनए rehydrate।
- 260 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा spectrophotometrically डीएनए यों (1.0 की एक एक 260 पढ़ने ~ 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / डबल असहाय डीएनए के बराबर है), और प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में एनजी 200 अप करने के लिए इस्तेमाल करते हैं।
7. आरएनए अलगाव के लिएट्रांसक्रिपटेस पीसीआर उल्टा।
- एक आरएनए शुद्धि किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करना, एक minibeadbeater उपयोग खमीर कोशिकाओं से शाही सेना को अलग करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
- 260 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा शाही सेना की एकाग्रता यों (1.0 की एक एक 260 पढ़ने के बराबर है मिलीलीटर ~ 40 माइक्रोग्राम प्रति / एकल असहाय आरएनए)।
- एक आरटी पीसीआर किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करना, लगभग एक माइक्रोग्राम प्रति शाही सेना के साथ आरटी पीसीआर प्रतिक्रियाओं सेट करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। इस अध्ययन में प्राप्त परिणामों के लिए, 1 टेबल में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग करें।
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Representative Results
सी का एक सफल biolistic परिवर्तन neoformans इस प्रोटोकॉल योजना (चित्रा 1) का पालन करके प्राप्त किया जा सकता है। डीएनए शॉट (2A चित्रा) के बाद biolistic परिवर्तन के साथ, लेपित सोने की माला का एक सफल गोली मार थाली पर दिखाई एक सोने की अंगूठी ने संकेत दिया है। चयनात्मक मीडिया पर YPD + 1 एम सोर्बिटोल प्लेटों से बरामद कोशिकाओं चढ़ाना के बाद कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जब कालोनियों 4 से 5 दिनों के भीतर दिखाई देनी चाहिए। डीएनए के दो माइक्रोग्राम प्रति बदलने 20 से 30 कालोनियों (चित्रा 2B) में परिणाम चाहिए। कालोनियों दिखाई देते हैं, वे अलग-अलग कालोनियों के लिए चयनात्मक मीडिया पर restreaked किया जाना चाहिए।
अलग-अलग कालोनियों YPD मीडिया में उगाया जा सकता है, और डीएनए और आरएनए दोनों उचित एकीकरण और अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए पीसीआर और आरटी पीसीआर के माध्यम से इन कोशिकाओं से अलग और विश्लेषण किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में चिह्नित जीन संलयन के लिए प्रयोग किया जाता है, तो इस उदाहरण के रूप में, प्राइमरों टी की आवश्यकता होगीब्याज (प्राइमर 2) के जीन की कोडिंग क्षेत्र के भीतर और ब्याज (प्राइमर 4) (चित्रा 3A) के जीन के 3 'noncoding क्षेत्र के भीतर ओ पानी रखना। इस निर्माण के साथ, पीसीआर प्रतिक्रिया से परिलक्षित डीएनए mCherry टैग एसीके जीन को फ्रेम में जुड़े हुए किया गया था कि एक और पुष्टि के लिए अनुक्रम किया गया था। एक सकारात्मक पीसीआर पुष्टि जंगली प्रकार की कोशिकाओं से अलग डीएनए की तुलना में तब्दील कोशिकाओं से अलग डीएनए से एक बड़ा पीसीआर उत्पाद होगा। एक अन्य पीसीआर प्रतिक्रिया भी तालिका में वांछित ठिकाना (प्राइमर 7 में सही पुनर्संयोजन पुष्टि करने के लिए प्राइमर सेट (प्राइमरों 2 और 5) एक प्राइमर निर्माण के बाहर और आसपास के जीनोम (प्राइमर 5) के भीतर anneals जहां उपयोग आयोजित करने की आवश्यकता होगी 1) (3B चित्रा)। आरटी पीसीआर ब्याज की जीन और टैग दोनों दोनों (चित्रा -3 सी) व्यक्त की जा रही है कि सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। आरटी पीसीआर संलयन उत्पाद भारतीयों का अनुक्रमणटैग ठीक से शाही सेना के स्तर पर जीन से जुड़े हुए है कि मोहनभोग।
इस प्रोटोकॉल ब्याज की एक जीन बाहर दस्तक करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो पीसीआर के लिए प्राइमर सेट एक प्राइमर का निर्माण जीनोम में recombine चाहिए जहां के बाहर एक जीनोम अनुक्रम को anneals है कि इस तरह तैयार है, और अन्य प्राइमर anneals या तो कोडिंग क्षेत्र में होना चाहिए जीन की या चयनात्मक मार्कर में। निर्माण सफलतापूर्वक और सही ढंग से जीनोम में recombined गया है कि एक सकारात्मक पुष्टि मार्कर के भीतर नहीं बल्कि ब्याज की जीन को anneals कि प्राइमर सेट के साथ anneals कि प्राइमर सेट के लिए सही आकार उत्पाद की उपस्थिति होगी। एक अन्य प्राइमर सेट पुनर्संयोजन घटना सही ठिकाना पर हुआ है कि पुष्टि करने के लिए पीसीआर के साथ प्रयोग किया जाता है, जो डिजाइन किए निर्माण, के बाहर anneals कि एक प्राइमर है कि किया जाना चाहिए। एक पीटा बनाने के लिए ही डिजाइन में, आरएनए बदल कोशिकाओं और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) कोशिकाओं दोनों से अलग है, और आरटी पीसीआर है ब्याज की जीन का कोई अभिव्यक्ति बदल कोशिकाओं से मनाया जाता है कि पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया।
एक फ्लोरोसेंट टैग एसीके जीन से जुड़े हुए किया गया था, क्योंकि पुनर्संयोजन अन्य पुष्टि वांछित ठिकाना में एक सफलता थी और कहा कि शाही सेना फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से (चित्रा 4) है प्रोटीन में अनुवाद किया जा रहा है। यह ब्याज की प्रोटीन व्यक्त की जा रही है कि जाना जाता है, जहां आदर्श रूप में, स्थिति पहले से ही स्थापित किया गया है। फ्लोरोसेंट संकेत निरीक्षण करने के लिए बहुत कम है हालांकि, अगर वहाँ एक संभावना सफल पुनर्संयोजन अभी भी हुआ है कि है, लेकिन विकास की स्थिति एक कम फ्लोरोसेंट के लिए नेतृत्व करेंगे जो इष्टतम स्थितियों पर्याप्त अभिव्यक्ति के लिए मुलाकात नहीं किया गया है कि मौका है, में परिवर्तित किया जा करने की जरूरत है संकेत। यह एक ऐसी पश्चिमी धब्बा रूप में अन्य विधियों के माध्यम से इस बात की पुष्टि करने की जरूरत होगी।
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1. प्रोटोकॉल योजना चित्रा।
2A चित्रा। डीएनए लेपित सोने की माला सफलतापूर्वक एक YPD + 1 एम सोर्बिटोल थाली पर गोली मार दी। YPD + 1 एम सोर्बिटोल थाली के केंद्र में देखा एक नारंगी पैच डीएनए लेपित सोने की माला की वजह से है, उचित सोने की तैयारी का संकेत है, साथ ही एक सफल शूटिंग के रूप में । चित्रा 2B। प्लेट प्रति 20-30 कालोनियों में डीएनए के परिणाम के 2 माइक्रोग्राम प्रति बदलते। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को पतला कर रहे थे, लगभग 20-30 कालोनियों चयनात्मक मीडिया पर चढ़ाना करने से पहले होने की उम्मीद कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3 ए। MCherry: एसीके के योजनाबद्ध।। नव निर्माण और प्रथम डिजाइन 3B चित्रा पीसीआर सफल मुताबिक़ पुनर्संयोजन पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 1 गलियों और 2: पीसीआर उत्पादों जंगली प्रकार सी से जीनोमिक डीएनए के साथ प्राइमरों 2 और 5 (1 टेबल) का उपयोग कर प्राप्त neoformans H99 (लेन 1) और एसीके: mCherry तब्दील तनाव, (2 लेन)। अपेक्षित आकार क्रमश: 1511 और 5622 बीपी हैं। गलियों 3 और 4 सी के डीएनए उत्पादों रहे हैं neoformans H99 (उम्मीद आकार 1443 बीपी) और एसीके: क्रमश mCherry (उम्मीद आकार 5552 बीपी) उपभेदों, 1. लेन 5 और 6 सी के डीएनए उत्पादों रहे हैं तालिका में प्राइमरों 2 और 4 का उपयोग neoformans H99 (पानी रखना नहीं होना चाहिए) और एसीके: mCherry (उम्मीद आकार 3016 बीपी) उपभेदों, क्रमशः, प्राइमरों एक और mCherry टैग की अभिव्यक्ति की 3. चित्रा -3 सी आर टी पीसीआर पुष्टि के प्रयोग से।। शीर्ष गलियों सी से परिलक्षित ACKmCherry संलयन उत्पाद (उम्मीद आकार 683 बीपी) के सीडीएनए उत्पादों रहे हैं neoformansH99 और एसीके:। तालिका 1 में प्राइमरों 2 और 3 का उपयोग mCherry उपभेदों actin के जीन एक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था और ACKmCherry (उम्मीद आकार 567 बीपी) का उपयोग प्राइमरों 6 और 1 टेबल में 7 के रूप में एक ही परिस्थितियों में परिलक्षित किया गया था। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
MCherry के चित्रा 4. प्रतिदीप्ति Ack टैग किया। 587 एनएम पर एक उत्तेजना इष्टतम और 610 एनएम पर एक उत्सर्जन इष्टतम के साथ एक mCherry टैग के लिए जुड़े हुए Ack उत्पादन उपभेदों का सूक्ष्म विश्लेषण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| 1 | कश्मीरI003 | 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA एजीसी सीएसी - 3' |
| 2 | ACKmChRT-एफ | 5'- GCT टीटीजी जीसीसी GGT अधिनियम एसीसी एएसी -3 |
| 3 | ACKmChRT-आर | GAC एजीसी टीटीसी आग टैग टीसीजी GGG 5'- -3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC टीटीजी GGG आग AGG AAT टीसी - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- सीजीजी GGT एसीसी एटीसी AAT एएए एजीसी TTT सीटीटी सीएसी टीसीसी - 3' |
| 6 | Actin 1 | 5'- CGC बुनना सी सी टी CCG बुनना सीजीए TCT टी जी सी -3 ' |
| 7 | Actin 2 | 5'- कैग CTG GAA GGT आगा CAA से आगा GGC -3 ' |
तालिका 1. पीसीआर और आरटी पीसीआर प्राइमरों।
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Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (पुरस्कार # 0,920,274) और दक्षिण कैरोलिना प्रयोग स्टेशन परियोजना अनुसूचित जाति-1,700,340 से पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया। Clemson विश्वविद्यालय प्रयोग स्टेशन के इस पत्र isTechnical योगदान नं 6283। लेखकों के लिए इस अंतिम प्रोटोकॉल और पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ चेरिल इनग्राम स्मिथ, केटी ग्लेन, और अनुग्रह Kisirkoi के विकास में उनके लिए मददगार सलाह के लिए डा लुकाज़ Kozubowski धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
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