Summary
バイオリスティック形質転換は、相同組換えによる日和見病原体クリプトコッカス·ネオフォルマンスのゲノムへのDNAの安定な組み込みを生成するために使用される方法である。我々 は 、C。 ネオフォルマンスへの蛍光タグmCherryをに融合をコードする遺伝子の酢酸キナーゼを持つ構築物のバイオリスティック形質転換のデモンストレーションを行います。
Abstract
担子菌クリプトコッカスネオフォルマンス 、中枢神経系の侵襲的な日和見病原体は、世界的に全世界で年間以上の625000人が死亡、その結果、真菌性髄膜炎の最も頻繁な原因である。エレクトロポレーションは、 クリプトコッカスにおけるプラスミドの形質転換のために開発されてきたが、唯一のバイオリスティック送達は、相同組換えによりゲノム中に組み込むことができる直鎖状DNAを形質転換する有効な手段を提供する。
酢酸クリプトコッカス感染中の主要な発酵産物であることが示されているが、この重要性はまだ知られていない。酵素がキシルロース-5-リン酸/フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ（XFP）及び酢酸キナーゼ（肯定応答）からなる細菌の経路はC.で酢酸を製造するための3つの潜在的な経路の一つであるネオフォルマンス 。ここでは、構築物の微粒子銃形質転換を実証する、のAckをコードする遺伝子は、mCherryを蛍光タグに融合C.にしたネオフォルマンス 。次に、ACK座にACK -mCherry融合の統合を確認する。
Protocol
注：このプロトコルの全体的なスキームを図1に概説されている。
1. C.ネオフォルマンスの準備
- 各形質転換反応のために、C. 2〜3mlのO / N培養を成長さ250 rpmで振盪30℃でYPD培地でネオフォルマンス 。
- 10℃で900×gで5分間のO / N培養を遠心し、上清を捨てる。
- 酵母ペプトンデキストロース（YPD）培地300μlの各細胞ペレットを再懸濁します。
- ガラスビーズを用いて、穏やかに1 Mソルビトールを含むYPD寒天上に洗浄し、細胞懸濁液を300μlを広げる。
- プレートは3〜4時間、周囲温度で乾燥することができます。
2.ゴールドマイクロキャリアの準備
- ビーズをペレット、上清を除去してのddH 2 O、900×gで1分間遠心機の1ミリリットル中に0.6μmの金のビーズの0.25グラムを懸濁します。
- 100％エタノール1ml中の金ビーズを再懸濁する。</ LI>
- 4チューブ、250μlのそれぞれにビーズを配布し、100％エタノール750μlを添加する。
- 4℃で保存ゴールドビーズのアリコート。
3. DNAの準備
- 鉗子を用いて100％エタノールでそれらを浸漬することによってオレンジマクロキャリアバイオリスティックディスクを準備します。乾燥するDRIERITEを含む大きなペトリ皿に置きディスク（DRIERITEがディスクに接触していないことを確認してください）。
- 乾燥したら、（以前は100％エタノールで拭い）銀ディスクホルダーにマクロキャリアディスクを押してください。
- 渦ゴールドビーズ（ステップ2のように調製）とアリコート1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに12μlの、変態ごとに1つの管。
- 順番に各チューブに入れる：2μgのDNA（好ましくは1μgのDNA /μlと2μL）、10μlの2.5 MのCaCl 2、および2μlの1 Mスペルミジン遊離塩基。
- ステップ3.4のように、しかし、誰DNAと負の制御を設定します。
- 周囲温度でボルテックス各チューブとインキュベート5分。静かにこのインキュベーション中に定住ビーズを再懸濁し、時々各チューブをフリック。
- DNA被覆金ビーズをペレットに30秒間225×gでチューブをスピン。慎重に（ペッティングまたは吸引により）、上清を除去し、廃棄する。
- ゆっくり上下にピペッティングすることによって完全に100％エタノール600μlの再懸濁ビーズ。
- 梱包せずにビーズをペレットに30秒間225×gでチューブをスピン。慎重に取り外し、上清を捨てる。
- ゆっくり上下にピペッティングすることによって100％エタノールの8μlのDNA被覆金ビーズを再懸濁します。
- 直径1cmにおけるバイオリスティック、ディスクの中心上にDNA被覆金ビーズをピペット乾燥させます。
注：バイオリスティックディスクの中央に見える乾燥した金の円はゴールドビーズの十分な濃度が存在することを示す。
注：DNA被覆金ビーズでロードマクロキャリアディスクは現在、遺伝子銃で使用するための準備ができている。
4. O遺伝子銃をperating
- 真空ポンプの電源をオンにします。
- 約2200 PSIの圧力は圧力計に到達するまで反時計回りにノブを回して、ヘリウムガスをオンにします。
- 左側の赤いスイッチを切り替えることにより、遺伝子銃をオンにします。
- 真空が15秒以内に28インチHgのに到達しますので、真空ベントのための流量が調整されていることを確認してください。
- 破裂板とマクロキャリアとの間の距離が約3/8インチであることを確認してください。
- エタノールでダウン拭いてチャンバ全体を清掃してください。
- 100％エタノール中に破裂ディスクを沈める。無菌の表面（ 例えば 、ペトリ皿）上で乾燥することができます。
- ラプチャーディスクホルダーを緩めトルクレンチを使用してください。ホルダーにきれいな破裂ディスクを挿入します。元の位置に戻しラプチャーディスクホルダーをねじ込み、右に一度に回してトルクレンチで締めます。
注：破断ディスクは、各シュート以下の置換されます。 - 目を沈める100％エタノールで電子メッシュスクリーン。無菌の表面（ 例えば 、ペトリ皿）上で乾燥することができます。
- 乾燥したら、白いプラスチック取り付けプレート上で洗浄メッシュのスクリーンを配置。ダウンディスク室へのマクロキャリアディスクホルダのDNA側に配置します。銀キャップのネジ、そして最高のスロットに取り付けプレートを配置。
注：メッシュスクリーンは、それぞれの撮影の後に置き換えられます。 - 底板上の1Mソルビトールを含むYPD寒天プレートを置きます。
- 室のドアをシャットダウンして、所定の位置に固定。
- 真空に係合し、真空28インチHgに達することができるように真ん中の赤いスイッチを押して、保持します。適切な真空レベルに達すると、上下の位置にこのスイッチを移動させる。準備ができたら、火に右側の赤いスイッチを押したままにします。ラプチャーディスクが表示されたら、すぐに発射ボタンを離すと0 PSIにチャンバーを排気する中間位置にミドル赤いスイッチを押してください。
- 破裂板の破片を一掃し、遺伝子銃をオフにしてください。その後heliuをオフにするノブを時計回りに回し、最後に、真空ポンプをオフにすることで、Mガス。
5.めっき形質転換細胞
- 形質転換プレートは、細胞が回復できるように4時間室温で静置する。
- プレート上YPDのピペットで700μlの。優しく無菌1.5mlマイクロチューブに寒天とピペット液体のオフ細胞をこすり取るために、セルスクレーパーを使用してください。すべての細胞がプレートから回収されたことを確認するために、この手順を繰り返します。
- 30秒間225×gで細胞をペレット。上清を除去し、廃棄する。
- YPD500μlにペレットを再懸濁。
- YPD +抗生物質プレートの中心への細胞懸濁液をピペットで100μlのガラスビーズを用いて広げた。
- 3-4日室温で反転プレートのままにしておきます。コロニーが出現すると、新しいYPD +抗生物質プレート上にパッチ。
PCR用6.ゲノムDNAの単離
注：これは、試薬を使用して修正バージョンですDNA精製キット（材料の表を参照してください）からのS。
- Cの各5mlの文化を育てる30℃でYPD液体におけるネオフォルマンス形質転換体を 250 rpmでO / Nで振盪。
- 900×gで細胞の3ミリリットルをペレット、および核溶解液の600μlの中で再懸濁します。
- 0.5ミリメートル酸200μlで新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにサスペンションを追加したガラスビーズを洗浄した。
- 氷の上で周囲温度、クールチューブでのミニビードビーターで45秒間ホモジナイズし、繰り返します。
- サンプルは2分間氷上に落ち着くと新しい1.5mlチューブに上清を転送することができます。 20秒間激しくボルテックス（上清回復のすべての600μlの100μl）を、各チューブにタンパク質沈殿溶液200μlを追加します。
- サンプルは5分間氷上で落ち着く、と3分間11000×gで遠心分離することを許可する。
- RTイソプロパノール300μlのを含む新しい1.5 mlチューブに上清を移し。緩やかに転倒混和します。
- 2分間11000×gで遠心サンプルは、注意深く上清を除去し、ペーパータオルの上にチューブを排出。
- 各チューブに、RTの70％エタノール300μlを加え、ゆっくりペレットを洗浄する反転。
- 遠心2分間11000×gでサンプル、慎重にエタノールをすべて削除する。
- 清潔なペーパータオルの上にチューブを逆さにし、10〜15分間空気乾燥ペレットを許可する。
- DNAの再水和溶液50μlと各ペレットと渦へのRNase溶液1.5mlを添加する。
- 5秒間遠心分離したサンプルは、キャップから液体のすべてを削除します。
- 15分間37℃でサンプルをインキュベートする。
- 1時間65℃でサンプルをインキュベートすることによってDNAを再水和する。
- 260nmでの吸光度を測定することによって分光光度的にDNAを定量（1.0のA 260読み取りが〜50μg/ mlの二本鎖DNAと同等である）、各PCR反応には200ngまで使用。
7. RNA単離のために転写酵素PCRリバース。
- RNA精製キット（材料の表を参照してください）を使用し、minibeadbeaterを使用して酵母細胞からRNAを単離するために、メーカーの指示に従ってください。
- （1.0のA 260読み取りが約40 / mlの一本鎖RNAと等価である）260nmの吸光度を測定することにより、RNAの濃度を定量する。
- RT-PCRキット（材料の表を参照してください）を使用し、約1μgのRNAのでRT-PCR反応をセットアップするために、製造元の指示に従ってください。この研究で得られた結果は、 表1に列挙されたプライマーを使用する。
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Representative Results
C.の成功バイオリスティック変換ネオフォルマンス、このプロトコル方式（ 図1）に従って求めることができる。 DNAは（ 図2A）撮影された後にバイオリスティック形質転換と、コーティングされた金のビーズの成功したシュートは、プレート上に見えるゴールドリングで示されている。選択培地上にYPD + 1Mソルビトールプレートから回収した細胞をプレーティングした後、室温で放置するとコロニーが4から5日以内に表示されます。 2μgのDNAを変換すると、20から30個のコロニー（ 図2B）をもたらすべきである。コロニーが表示されたら、それらは個々のコロニーを選択培地上で再ストリークする必要があります。
個々のコロニーをYPD培地中で成長させることができ、両方のDNAおよびRNAをこれらの細胞から単離し、適切な組込みおよび発現を確認するために、PCRおよびRT-PCRで分析することができる。このプロトコルは、タグ付けされた遺伝子融合のために使用される場合、この例のように、プライマーは、トンを必要とする目的の遺伝子（プライマー2）のコード領域内に目的の遺伝子（プライマー4）（ 図3A）の3 '非コード領域内のOアニール。この構築物を用いて、PCR反応からの増幅されたDNAは、mCherryをタグがACK遺伝子にインフレームで融合した別の確認のために配列決定した。陽性のPCR確認は、野生型細胞から単離されたDNAと比較して形質転換された細胞から単離されたDNAから大きなPCR産物であろう。別のPCR反応はまた、一方のプライマーは、表内の所望の遺伝子座（プライマー7に正しい組換えを確認するために、構築物の外側および周囲のゲノム（プライマー5）内にアニールするプライマーセット（プライマー2および5）を利用して行われる必要がある1）（図3B）。 RT-PCR（ 図3C）、目的の遺伝子とタグの両方が共に発現していることを確認するために使用される。 RT-PCR融合産物INDIの配列タグが適切にRNAレベルでの遺伝子に融合されていることをケイツ。
このプロトコルは、目的の遺伝子をノックアウトするために利用される場合、PCRのためのプライマーセットは、一方のプライマーは、構築物がゲノムに再結合する場所の外のゲノム配列にアニールし、他方のプライマーのいずれかアニーリングするコード領域であるように設計されるべきである遺伝子のまたは選択マーカーで。構築物は成功し、正しくゲノムに再結合されている正の確認がマーカーの中ではなく、目的の遺伝子にアニールするプライマーセットでアニールするプライマーセットのための正しいサイズの産物の存在だろう。別のプライマーセットは、組換え事象が正しい遺伝子座で起こったことを確認するためにPCRで使用されるように設計構築物の外側にアニールつのプライマーを有するなされるべきである。ノックアウトを作成する同じ設計では、RNAは、形質転換細胞および野生型（WT）細胞の両方から単離し、RT-PCRである目的の遺伝子の発現は形質転換された細胞から観察されないことを確認するために行った。
蛍光タグはACK遺伝子に融合されたため、再結合が必要な遺伝子座に成功したと、そのRNAがタンパク質に翻訳されていることを別の確認は、蛍光顕微鏡（ 図4）を介して行われます。それは、目的のタンパク質が発現されていることが知られている場合に理想的な条件は、既に確立されている。蛍光シグナルを観察するには低すぎる場合は、そこに成功した再結合が依然として発生している可能性があるが、成長条件を最適な条件は、低蛍光性につながる十分な発現のために満たされていないことを偶然に変更する必要が信号。これは、ウェスタンブロットなどの他の方法によって確認される必要がある。
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1.プロトコルスキーム図。
図2A。 DNA被覆金ビーズが正常にYPD + 1Mソルビトールプレート上に撮影しました。YPD + 1Mソルビトールプレートの中央に見られるオレンジ色のパッチは、DNA被覆金ビーズによるものであり、適切な金の準備を示すだけでなく、成功したシュートとして。 図2B。プレートあたり20〜30個のコロニー内のDNAの結果2μgの変革。プロトコルで述べたように、細胞を希釈した場合、約20〜30個のコロニーが選択培地上にプレーティングする前に期待されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3A。 ACKの概略：mCherryを：。。ネオ構築物およびプライマーの設計図3B PCRが成功した相同組換えを確認するために使用。レーン1および2：PCR産物は、野生型C.からのゲノムDNAとプライマー2および5（表1）を用いて得られたネオフォルマンスの H99（レーン1）およびACKは：mCherryを（レーン2）、菌株を形質転換した。予想サイズはそれぞれ、1511年と5622 bpのである。レーン3および4は、CのDNA生成物であるネオホルマンス H99（予想サイズ1443塩基対）及びACK：それぞれmCherryを（予想サイズ5552 bp）の株、1レーン5および6は、CのDNA生成物である表プライマー2および4を使用してネオフォルマンスの H99（アニールすべきでない）とACK：プライマー1と3 図3Cを使用して、それぞれ、mCherryを（予想されるサイズ3016 bp）の菌株mCherryをタグの発現のRT-PCRの確認。トップレーンはC.から増幅ACKmCherry融合産物（予想されるサイズ683 bp）ののcDNA産物であるネオフォルマンスH99およびACK：mCherryを表1に、プライマー2および3を使用して菌株アクチン遺伝子を対照として含めた表1に、プライマー6および7を使用してACKmCherry（予想サイズは567 bp）を同様の条件で増幅した。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
mCherryを図4.蛍光はACKをタグ付け 。 587 nmでの励起最適と610 nmでの放射最適とmCherryをタグに融合ACKを産生株の顕微鏡分析。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 1 | KI003 | 5 ' - GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'- GCT TTG GCC GGT ACT ACC AAC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'- GAC AGC TTC AAGタグTCG GGG -3 ' |
| 4 | KI004 | 5 ' - GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 ' - CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | アクチン1 | 5'- CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 ' |
| 7 | アクチン2 | 5'- CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 ' |
表1. PCRおよびRT-PCRプライマー。
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Acknowledgments
この作品は、国立科学財団（賞＃0920274）とサウスカロライナ州の試験場プロジェクトSC-1700340からの賞によってサポートされていました。クレムソン大学試験場の本論文isTechnical貢献号6283。著者は、原稿の彼らの重要な読書のためのこの最後のプロトコルおよび博士シェリルイングラム·スミス、ケイティグレン、とグレースKisirkoiの開発に彼の有益な助言のために博士はLukasz Kozubowskiに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
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