Abstract
في كثير من الأحيان يتم ترجمة من mRNAs إلى محاور الفقارية ومطلوب ترجمة المحلية لالاستطلاعية محور عصبي أو المتفرعة خلال تطوير وصيانة وإصلاح أو التنكس العصبي في فترات تال للنماء. وقد كشفت التحاليل إنتاجية عالية مؤخرا أن محاور لها Transcriptome على أكثر ديناميكية وتعقيدا مما كان متوقعا في السابق. هذه التحليلات، ومع ذلك تم القيام به في الغالب في الخلايا العصبية مثقف حيث المحاور يمكن عزلها من مقصورات somato شجيري. يكاد يكون من المستحيل لتحقيق مثل هذه العزلة في الأنسجة كلها في الجسم الحي. وبالتالي، من أجل التحقق من تجنيد من mRNAs وأهميتها الوظيفية في الحيوان كله، ينبغي من الناحية المثالية يمكن الجمع بين التحليلات Transcriptome على مع التقنيات التي تسمح تصور من mRNAs في الموقع. مؤخرا، تم تطوير تكنولوجيات جديدة ISH التي تكشف عن الرنا على مستوى واحد جزيء. هذا مهم بشكل خاص عند تحليل توطين التحت خلوية من مرنا، وعادة ما وجدت الرنا المترجمة منذ عند مستويات منخفضة. نحن هنا وصف بروتوكولين للكشف عن من mRNAs المترجمة axonally-باستخدام تكنولوجيا فائقة الحساسية RNA ISH الرواية. جمعنا بين RNAscope ISH مع مباين المحاور باستخدام المناعية مضان أو الأصباغ النسيجية للتحقق من تجنيد Atf4 مرنا إلى المحاور في الجسم الحي في الماوس ناضجة والعقول البشرية.
Introduction
التوظيف مرنا محور عصبي والترجمة المحلية تمكن المحاور كي تستجيب للمثيرات خارج الخلية بطريقة زمنيا ومكانيا الحادة 1. وأفضل طريقة لفهم تخليق البروتين داخل محور عصبي في سياق النمو العصبي حيث أنه يلعب دورا حاسما في نمو السلوك مخروط 08/02، 11/09 ومحور عصبي الاستطلاعية إلى الوراء مما يشير إلى 12،13. ولكن أقل بكثير من المعروف عن أهمية وظيفية من تخليق البروتين في الخلايا العصبية محور عصبي بعد التنموية عندما يتم تخفيض مستويات مرنا والريبوسوم محور عصبي إلى حد كبير 14،15. منذ فترة طويلة كان يعتقد المحاور الفقارية ناضجة لتكون خاملة translationally 16. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن الترجمة المحلية وإعادة تنشيطها في محاور عصبية ناضجة في ظل ظروف مرضية. على سبيل المثال، تم تجنيد مجموعة فرعية من المحاور من mRNAs لتجديد التالية مطلوبة إصابة العصب وتخليق البروتين داخل محور عصبي لتجديد الصحيح لهذه المحاور 17. بالإضافة إلى ذلك، لدينا مجموعة هكتارأظهرت الصورة التي يتم تجنيدهم من mRNAs محددة لمحاور عصبية بعد مطلوب التعرض المحلي لمرض الزهايمر الببتيد Aβ 1-42، والترجمة المحلية للعامل النسخ ATF4 لنشر آثار العصبية من Aβ 1-42 من العصبونات إلى سوما الخلايا العصبية (18). أخيرا، كشفت التحليلات الإنتاجية العالية التي محاور عصبية ناضجة لديها Transcriptome على أكثر تعقيدا وديناميكية من المتوقع 18-21، خاصة في ظل الظروف المرضية. في ضوء هذه الدراسات، وهي طريقة حساسة للغاية ومحددة للكشف عن الحاجة من mRNAs محلية axonally في الجهاز العصبي الكبار.
وقد تم تنفيذ الكثير من العمل على تجنيد مرنا والترجمة المحلية في محاور عصبية ناضجة على الخلايا العصبية مثقف. هذا ينطبق بشكل خاص لTranscriptome على تحليلات منذ أساليب زراعة المتخصصة موجودة التي تسمح للعزلة محاور من-somato شجيري مقصورة 18-20. على الرغم من أن أعطت هذه الدراسات الإضافية القيمةآيت إلى دور الترجمة المحلية في محاور عصبية ناضجة، مسألة ما إذا كانت الخلايا العصبية مثقف تمثل بصدق الوضع في الجسم الحي أو إذا التوظيف مرنا هو استجابة تكيفية من المحاور لظروف زراعة لا يزال مفتوحا. وقد وفرت دراسات قليلة أدلة على تجنيد مرنا حتى تنضج المحاور في الجسم الحي. على سبيل المثال، تم الكشف عن نص الترميز للبروتين علامة حاسة الشم في محاور الخلايا العصبية الحسية في البالغين 22. ويتم نقل A التحوير الذي يحتوي على 'UTR 3 من-β أكتين مرنا لمحاور الخلايا العصبية في الجهاز العصبي الطرفية والمركزية في الفئران ويترجم محليا بعد فترات التنموية 23. المترجمة امين B2 مرنا إلى المحاور الشبكية في Xenopues المورق الضفادع الصغيرة ويؤثر نضوبها صيانة محور عصبي بعد تطوير محور عصبي 21. التدخل في نقل محور عصبي من الترميز مرنا لالسيتوكروم C أوكسيديز IV يغير سلوك الماوس 24. أخيرا، وجدت Atf4 مرنا في الكبار لxons من الفئران والعقول البشرية في سياق Aβ 1-42 يسببها التنكس العصبي 18.
وقد أثبتت التحليلات Transcriptome على الإنتاجية العالية ليكون من المفيد تحديد ملامح مرنا في المحاور معزولة في المختبر ولكن لديها قيود عليها في الدراسات المجراة منذ ذلك الحين في الأنسجة كلها تم العثور على محاور عصبية أبدا في عزلة بل تتداخل مع أجسام الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية وأنواع الخلايا الأخرى. وبالتالي، فإن هذه التحليلات يجب أن تكون جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير التي تؤكد توطين التحت خلوية من من mRNAs. RNA التهجين الموضعي (RNA ISH) في يتيح الكشف والتصور من تسلسل الحمض النووي الريبي محددة في الخلايا والأنسجة. ومع ذلك، كانت الأصلي فحوصات الحمض النووي الريبي ISH مناسبة فقط لتحديد الرنا وفيرة للغاية 25، وهو الحال بالنسبة ل mRNAs المترجمة axonally نادرا. على مدى العقود الماضية زيادة الجهود قد وضعت في تطوير تقنيات جديدة تسمح للكشف عن من mRNAs في مستوى واحد جزيء
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي IACUC من جامعة كولومبيا والمبادئ التوجيهية المطبقة على رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتلت. ملاحظة: تحضير جميع المخازن المستخدمة في إجراءات ISH في الماء ريبونوكلياز خالية أو المعالجة DEPC. هذه التوصية ليست ضرورية تماما بعد انتهائه ISH لكن يقترح أن مخازن لا تزال على استعداد في الماء المقطر المزدوج تعقيمها و / أو تعقيمها من خلال تصفية.
1. الكشف عن Atf4 مرنا المترجمة إلى الكوليني محاور عصبية في الدماغ باستخدام الماوس الكبار الإسفار في الموقع التهجين (FISH) تلاه المناعية
- إعداد نموذج لشرائح الدماغ المجمدة الثابتة امتصاص العرق
- على سبيل المثال التالي، وإعداد شرائح من أدمغة فئران المجمدة الثابتة.
- لفترة وجيزة، التضحية الفئران من العمر 9 أشهر قبل التخدير مع الكيتامين (100 ملغم كغم -1 وزن الجسم) وزيلازين (10 ملغ كغم -1 وزن الجسمحزب التحرير)، يليه ضخ transcardial من 4٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4).
- إزالة العقول وبعد الإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
- بعد التثبيت، وغسل العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وcryoprotect في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
- أدمغة تغرس في أكتوبر تجميد مجمع، قسم متسلسل في 20 ميكرون على ناظم البرد وجبل على بولي-D-يسين تعامل شرائح المجهر. الحفاظ على شرائح الدماغ عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إزالة شرائح الدماغ ثابتة امتصاص العرق من الفريزر والهواء الجاف لمدة 30 دقيقة في RT.
- يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- في غطاء الدخان، وإعادة الإصلاح في الدماغ شرائح 20 دقيقة مع 4٪ لامتصاص العرق في RT.
ملاحظة: تحذير: 4٪ امتصاص العرق هي سامة ويجب التعامل معها والتخلص منها بشكل مناسب التالية بروتوكولات السلامة. - يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- يذوى شرائح الدماغ.
- تجهيز 50٪، 75٪ و 100٪حلول الايثانول.
- تزج الشرائح في 50٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق على RT.
- تزج الشرائح في الايثانول 75٪ لمدة 5 دقائق على RT.
- تزج الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق على RT.
- تزج الشرائح في الطازجة الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق على RT. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن تخزين الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ عند درجة حرارة -20 درجة مئوية تصل إلى 1 في الشهر.
- على سبيل المثال التالي، وإعداد شرائح من أدمغة فئران المجمدة الثابتة.
- وجاء FISH فحص من قبل المناعية باستخدام الناجم عن الحرارة مستضد / RNA إماطة اللثام
- قبل البدء في إعداد جميع المواد المطلوبة:
- تسخين الفرن التهجين إلى 40 درجة مئوية ووضع علبة تحتوي على الماء المقطر في الفرن لخلق بيئة مرطب.
- اتخاذ مربع الشريحة ووضع المناشف الورقية غارقة في الماء المقطر داخل لترطيب مربع الشريحة. وضع مربع الشريحة في الفرن التهجين.
- إزالة المسابير (كلا تحقيقات السلبية والهدف) من الثلاجة وتسخينها في فرن التهجين لمدة 10 دقيقة. السماح للتحقيقات بارد داون في RT.
- تتوازن الكواشف التضخيم AMP 1-4 (المدرجة في أدوات نيون متعددة الكاشف) في RT.
- إعداد مستضد حل استرجاع: 10 ملي سيترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6)، 0.05٪ توين 20. ملاحظة: يمكن تخزين الحل في RT لأجل غير مسمى ويمكن استخدامها لتلطيخ المستقبل.
- يعد غسل العازلة 1X تمييع الحل 50X الأسهم (المدرجة في أدوات نيون متعددة الكاشف) في الماء ريبونوكلياز خالية أو المعالجة DEPC.
ملاحظة: غسل العازلة 1X يمكن تخزينها في RT لمدة 1 شهر و تستعمل لأجل تلطيخ المستقبل. 50X غسل العازلة قد يعجل. إذا كان الأمر كذلك، الحرارة 50X غسل العازلة في 40 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل إعداد حل 1X.
- إزالة الشرائح من الإيثانول بنسبة 100٪ والهواء الجاف لمدة 5 دقائق على RT.
- إعداد جرة coplin التي تحتوي على 50 مل من محلول استرجاع مستضد. تزج الشرائح في مستضد حل استرجاعها وسلقها لمدة 10 دقيقة في فرن الميكروويف.
ملاحظة: بدلا من مكان الشرائح أفقيا في 100 ممصحن قطره الزجاج المستديرة التي تحتوي على 100 مل من محلول استرجاع.- ملء كوب 1 L مع الماء المقطر ووضعه في الميكروويف.
ملاحظة: إن المياه "العازلة" الحرارة عند تنفيذ إماطة اللثام. - وضع الشرائح في حل مستضد استرجاع داخل الميكروويف. يغلي الشرائح في عالية الطاقة لمدة 5 دقائق. على الفور بعد أن توقف عينات المغلي، والشرائح الحرارة مرة أخرى في عالية الطاقة لمدة 5 دقائق إضافية.
- تهدئة الشرائح في RT.
ملاحظة: يجب أن تحدد مدة الغليان والإجراءات من قبل المستخدم، وهذا يتوقف على خصائص الموجات الدقيقة: حرجة STEP. يبدأ أسرع الغليان وارتفاع فرص حل التبخر. في هذه الحالة فمن المستحسن أن العينات المغلي لفترات زمنية أقصر أكثر من مرتين لإكمال مجموع وقت إماطة اللثام عن 10 دقيقة. على العكس من ذلك، إذا تم تنفيذ التدفئة في قوة متوسطة أو منخفضة، وإماطة اللثام يمكن أن يؤديها مرة واحدة لمدة 10 دقيقة. ومع ذلك، إذا العينات لا تغلي continuouslY ليصبح المجموع حوالي 10 دقيقة، وهذا قد يؤدي إلى فضح الجزئي لكل من RNA والبروتين المستهدف أن يتم الكشف عنها.
- ملء كوب 1 L مع الماء المقطر ووضعه في الميكروويف.
- غسل الشرائح ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 2-3 قطرات (~ 100 ميكرولتر) لجنة التحقيق dapB المقرر أن تلك شرائح المخ تستخدم لتقييم تلوين الخلفية. ملاحظة: لجنة التحقيق مجموعة dapB يستهدف الجينات البكتيرية، وينبغي ألا تعترف بأي RNA الثدييات.
- إضافة 2-3 قطرات من التحقيق استهداف المقرر أن تلك شرائح المخ تستخدم للكشف عن الحمض النووي الريبي في المصالح. ملاحظة: مجموعة التحقيق تستهدف بقايا 20 - 1381 من الفأرة يستخدم Atf4 مرنا في هذا المثال.
- الشرائح غطاء مع parafilm لتجنب التحقيق التبخر، ووضعها في خانة الشريحة مرطب داخل الفرن التهجين واحتضان لهم عند 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: اختياري: يمكن تهجين شرائح الدماغ إضافية مع مجموعة التحقيق التي تستهدف الماوس Polr2A واستخدامها كأداة الضوابط الإيجابية. - غسل سليدي مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 2-3 قطرات من التضخيم كاشف AMP 1-FL إلى كل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 2-3 قطرات من التضخيم كاشف AMP 2-FL إلى كل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 2-3 قطرات من التضخيم كاشف AMP 3-FL إلى كل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 2-3 قطرات من التضخيم كاشف AMP 4-FL إلى كل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها فيمربع الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT ومرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 100-200 ميكرولتر (أو حجم ما يكفي لتغطية كامل شرائح) لعرقلة الحل تحتوي على 3 ملغ / مل BSA، و 100 ملي الجلايسين و 0.25٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى الشرائح، وتغطيتها مع parafilm و احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
- إضافة 100-200 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة دردشة مخففة في عرقلة الحل (1/100) إلى الشرائح، وتغطيتها مع parafilm واحتضان لمدة 2 أيام في 4 درجة مئوية. تأكد من أن شرائح الدماغ لا تجف. إذا لزم الأمر، وإعادة تطبيق حل الأجسام المضادة لمكافحة دردشة لشرائح الدماغ 24 ساعة بعد الحضانة.
- غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق على RT.
- إضافة 100-200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية اليكسا مترافق المناسب (. على سبيل المثال، اليكسا-594 حمار المضادة للماعز لهذا المثال بالذات) إلى شرائح، وتغطي مع parafilm وincubأكل لمدة 1 ساعة على RT.
- غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق على RT.
- غسل الشرائح مرة واحدة مع الماء المقطر.
- جبل الشرائح مع المحتوية على دابي المتوسطة المتزايدة.
- تصور شرائح الدماغ تحت المجهر مضان.
- قبل البدء في إعداد جميع المواد المطلوبة:
2. الكشف عن Atf4 مرنا المترجمة إلى محاور عصبية في الدماغ البشري باستخدام العينات اللونية في الموقع التهجين (CISH) تلاه Luxol سريع الأزرق والبنفسجي الكريزيل Counterstaining
- إعداد نموذج للعينات الدماغ البشري جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين
- شرائح الخبز في الفرن الجاف في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- شرائح الدماغ Deparaffinize في غطاء الدخان.
ملاحظة: تنبيه: الكواشف سامة ويجب التعامل والتخلص منها باتباع الإرشادات الأمنية المناسبة- تزج الشرائح في الزيلين وكيل المقاصة البديل مرتين لمدة 10 دقيقة.
- تزج الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ مرتين لمدة 1 دقيقة.
- Aالأشعة تحت الحمراء الجافة شرائح 5 دقائق على RT. ملاحظة: يمكن أن تجفف العينات بدلا من ذلك في RT O / N ولكن يجب استخدامه في غضون 24 ساعة.
- Diaminobenzidine (DAB) القائم مولد اللون فحص ISH تليها luxol سريعة زرقاء وبنفسجية الكريزيل وصمة عار باستخدام الناجم عن الحرارة والبروتياز التي يسببها RNA إماطة اللثام
- قبل البدء في إعداد المواد المطلوبة:
- تسخين الفرن التهجين إلى 40 درجة مئوية ووضع علبة تحتوي على الماء المقطر لخلق بيئة مرطب.
- اتخاذ مربع الشريحة ووضع المناشف الورقية غارقة في الماء المقطر داخل لترطيب مربع الشريحة. وضع مربع الشريحة في الفرن التهجين.
- إعداد 1X يمهد للمعالجة 2 عن طريق تمييع الحل 10X الأسهم (المدرجة في أدوات CISH الكاشف) في الماء ريبونوكلياز خالية أو المعالجة DEPC. إذا يتم تنفيذ المعالجة على طبق ساخن، إضافة 100 مل من محلول يمهد للمعالجة إلى 100 ملم صحن من الزجاج قطر لزيادة سطح التماس بين طبق وطبق ساخن (إن المعالجةيتم تنفيذ في الميكروويف، جرة coplin يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك على النحو المحدد في 1.2.3). الحل الحرارة إلى 100 درجة مئوية والحفاظ على أنه لم يعد من 30 دقيقة المغلي قبل غمر العينات.
- الحرارة تحقيقات السلبية والإيجابية مدة 10 دقيقة في 40 درجة مئوية ويبرد في RT.
- تتوازن الكواشف التضخيم AMP 1-6 (المدرجة في أدوات CISH الكاشف) في RT.
- يعد غسل العازلة 1X تمييع الحل 50X الأسهم (المدرجة في CISH الكاشف كيت) في الماء المقطر. ملاحظة: يمكن تخزين 1X غسل العازلة في RT لمدة 1 شهر و تستعمل لأجل تلطيخ المستقبل.
- إضافة 4 قطرات ~ (~ 120 ميكرولتر) من يمهد للمعالجة من 1 إلى كل شريحة الدماغ، وتغطي مع parafilm واحتضان في RT لمدة 10 دقيقة.
- يغسل 3-5 مرات في الماء المقطر النقي.
- أداء الناجم عن الحرارة إماطة اللثام:
- الشرائح نقل إلى حار يمهد للمعالجة 2 (المدرجة في CISH الكاشف كيت) حل ويغلي لمدة 15 دقيقة. ملاحظة: الغليان لا يمكن أن يؤديها على طبق ساخن ضماناستمرار الغليان أو في الميكروويف التالية الخطوات الحاسمة المحددة في 1.2.3).
- نقل على الفور إلى الشرائح الماء المقطر، ويغسل 3-5 مرات.
- غسل الشرائح 3-5 مرات في جديدة الإيثانول بنسبة 100٪.
- شرائح الهواء الجاف 5 دقائق على RT. ملاحظة: O بدلا من شرائح يمكن أن تجفف / N.
- أداء الناجم عن البروتيني إماطة اللثام:
- إضافة 4 قطرات من يمهد للمعالجة 3 (المدرجة في CISH الكاشف كيت)، وتغطي مع parafilm واحتضان 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح 3-5 مرات في الماء المقطر النقي.
- إضافة 4 قطرات من التحقيق dapB المقرر أن تلك شرائح المخ تستخدم لتقييم تلوين الخلفية.
- إضافة 4 قطرات من لجنة التحقيق التي تستهدف المقرر أن تلك شرائح المخ تستخدم للكشف عن الحمض النووي الريبي في المصالح.
يستخدم 1256 من ATF4 مرنا البشري في هذا المثال - مجموعة التحقيق التي تستهدف بقايا 15: ملاحظة. اختياري: يمكن شرائح الدماغ إضافية تكون HYBridized مع مجموعة التحقيق التي تستهدف PPIB البشري وتستخدم الضوابط الإيجابية. - وضع الشرائح في مربع الشريحة واحتضان لمدة 2 ساعة. في 40 درجة مئوية في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 4 قطرات من AMP 1 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 4 قطرات من AMP 2 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 4 قطرات من AMP 3 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح مرتين مع و1Xح عازلة لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 4 قطرات من AMP 4 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 4 قطرات من AMP 5 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm واحتضان 30 دقيقة في RT.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- إضافة 4 قطرات من AMP 6 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm واحتضان 15 دقيقة في RT.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
- مزيج حجم مساو من BROWN-1 وBROWN-2 الكواشف (المدرجة في CISH الكاشف كيت)، إضافة ~ 120 ميكرولتر من حل كل شريحة الدماغ، وتغطي مع parafilm واحتضان 10 دقيقة في RT.
- غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT وشطف مرة واحدة في الماء المقطر.
ملاحظة: الخطوات الحاسمة: الخطوات التالية حاسمة لالحصول على مباين المحاور الأمثل دون إخفاء وجود حبيبات RNA. - قبل تنفيذ مباين تحقق من وجود مرنا من الفائدة تحت المجهر brightfield. تحديد المناطق المرجعية في عينات الدماغ الذي لرصد وجود نقاط وجميع أنحاء الداخلي مباين.
- luxol سخن بسرعة حل الأزرق في 60 درجة مئوية.
- مكان الشرائح في luxol الأزرق سريع واحتضان 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
- شطف عدة مرات في الماء المقطر.
- تراجع الشرائح عدة مرات في 0.05٪ محلول كربونات الليثيوم لبدء التمايز.
- تراجع الشرائح مرتين في جديدة الايثانول 75٪.
- شطف في الماء المقطر.
- تحقق شرائح الدماغ تحت المجهر brightfield. لاحظ أن المادة الرمادية والبيضاء وينبغي أن تبدأ لتكون حبيبات مميزة وRNA لا تزال مرئية كما الأزرق الداكن / نقاط وسوداء. تحقق من المحاور تبدأ في الظهور كما الألياف اللون الأزرق الفاتح.
- كرر الخطوات من 2.2.28 الى 2.2.32. ادائهام حضانات مع luxol حل سريع الأزرق في 10-20 دقيقة الخطوات، ومراقبة بعناية مباين وجود حبيبات RNA. ملاحظة: عادة، يتم الحصول عليها مباين الأمثل في 60-90 دقيقة (مجموع فترة حضانة) ولكن الوقت يمكن اختصارها إذا كان يشتبه في أن حبيبات RNA يمكن أن تقنع من خلال luxol وصمة عار الزرقاء السريعة (انظر الشكل 2 للحصول على أمثلة).
- احتضان الشرائح في الكريزيل حل البنفسجي لمدة 10 دقيقة في RT.
- شطف الشرائح في الماء المقطر.
- تراجع الشرائح 5 إلى 10 مرات في 70٪ من الإيثانول.
- يذوى شرائح الدماغ خلال 3 تغييرات سريعة من الإيثانول بنسبة 100٪.
- في غطاء الدخان، شرائح الدماغ واضحة التي يحتضنها مرتين في زيلين كيل المقاصة بديل لمدة 2 دقيقة ومرة ثالثة لمدة 5 دقائق على RT.
- شرائح جبل الدماغ في القائم زيلين دائم المتوسطة المتزايدة.
- تحليل العينات تحت المجهر brightfield.
- قبل البدء في إعداد المواد المطلوبة:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد ملخص موجز للإجراءات المذكورة أعلاه في الشكل 1.
كشف الأمثل للAtf4 مرنا حبيبات في المحاور كوليني باستخدام الناجم عن الحرارة إماطة اللثام
عند تقييم توطين محور عصبي من mRNAs، فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على تحديد المحاور وأن تكون قادرة على تصور الرنا وفيرة منخفضة. التكنولوجيا RNA ISH الموصوفة هنا يمكن من اكتشاف الرنا في قرار واحد جزيء. البروتوكولات القياسية باستخدام هذه التكنولوجيا تشير مزيج من اثنين من إجراءات رفع القناع للكشف عن كفاءة الرنا الهدف: والحرارة الناجمة عن إماطة اللثام 28 الناجم عن البروتيني. ومع ذلك، عندما يتم الجمع ISH مع المناعية لتحديد محاور، قد لا يؤدي الناجم عن البروتيني إماطة اللثام في الأمثل كشف مستضد 29.
في البروتوكول الأول هو موضح هنا، وتجنب البروتيني الهضم، منذ فشل الأجسام المضادة المستخدمة للاعتراف جأسيتيل holine (الدردشة) التي توجد عادة في المحاور من التلفيف المسنن الناشئة عن مسار septohippocampal (الشكل 2A و B)، على الرغم من أن تم الكشف عن حبيبات مرنا إيجابية. استرجاع مع 10 ملي العازلة سيترات (الرقم الهيدروجيني 6) الناجم عن الحرارة، من ناحية أخرى، ضمان سلامة حاتمة معترف بها من قبل الأجسام المضادة لمكافحة دردشة وتستهدف تم الكشف عن مرنا بكفاءة في المحاور الملطخة الدردشة (الشكل 2C وD). النتائج المعروضة هنا (الشكل 2) تبين وجود Atf4 في التلفيف المسنن من فئران بالغة حيث تم يسببها مرنا التوظيف والترجمة المحلية عن طريق ضخ Aβ 1-42 oligomers في قرن آمون. وتشير الأدلة السابقة التي Atf4 مرنا لم يتم الكشف في محاور عصبية في المختبر أو في الجسم الحي في ظل ظروف القاعدية 18، وبالتالي لا يظهر مثل هذا النموذج التجريبي.
كشف الأمثل للATF4حبيبات مرنا في محاور باستخدام كل من إماطة اللثام الناجم عن الحرارة والتي يسببها البروتيني
في حين أن النتائج المذكورة أعلاه إلى أن الأجسام المضادة تستند كشف عن البروتين متوافق مع تقنية RNA ISH عند تنفيذ الحرارة الناجم عن إماطة اللثام أنه قد لا يكون مفيدا إذا كان مطلوبا البروتيني ما قبل المعالجة. يصف القسم 2 الكشف عن ATF4 مرنا ضمن المحاور التالية الإجراءات التي تم نشرها مسبقا 28،30 جنبا إلى جنب مع البقع النسيجية التي تستخدم عادة لعينات الدماغ 31،32.
A خطوة حاسمة في هذا الإجراء هو مباين الأمثل من الألياف مياليني باستخدام luxol الأزرق سريع (LFB) من دون اخفاء وجود حبيبات مرنا في المحاور ملطخة CISH. الكواشف المستخدمة لهذا الغرض تسمح مباين الأمثل مع LFB التالية مرات حضانة تتراوح بين 60 و 90 دقيقة. قد تفشل مباين عندما انخفضت درجة الحرارة وحضانة مرات (3A الشكل وأقحم، والبيانات لا تظهر) لالثاني على الرغم من حبيبات مرنا ستظل مرئية، لا يمكن التحقق توطين بهم المحاور. من ناحية أخرى، احتضان عينات الدماغ لمدة 60 دقيقة أو أكثر في 60 درجة مئوية دون رصد وجود حبيبات إيجابية بشكل دوري قد يؤدي إلى إخفاء النهائي لمرنا من الفائدة من قبل صبغ (الشكل 3B وأقحم). وهكذا المستحسن أن يتم تحضين العينات في LFB لمدة 30 دقيقة ويتم تنفيذ هذا حضانة مزيد من التدرجي فحص العينات كل 10 إلى 20 دقيقة للحصول على تلطيخ الأمثل لكل من محاور عصبية وحبيبات RNA (الشكل 3D-F). باتباع هذه المبادئ التوجيهية حبيبات إيجابية Atf4 يمكن الكشف عن اضح في كل من سيطرة (الشكل 3D) ومرض (الشكل 3F) عينات المخ الزهايمر.
العمل الرقم 1. تلخيصمن RNA ISH تليها مباين المحاور. خطوات يصور باللون الأسود شائعة للإجراءات اثنين مثال. خطوات سلط الضوء باللون الأزرق هي محددة لعينات ثابتة امتصاص العرق الملون التي ISH الفلورسنت في حين أن أولئك باللون الأحمر هي محددة لعينات جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين ملطخة ISH مولد اللون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. FISH لAtf4 مرنا المترجمة إلى محاور كوليني في التلفيف المسنن من الفئران البالغة. وقد أجريت FISH باستخدام الناجم عن البروتيني (ل وحة EFT) أو من صنع الحرارة (اللوحة اليمنى) إماطة اللثام تليها الكشف عن الأجسام المضادة لمادة الكولين أسيتيل (دردشة) . وantibفشل ODY الاعتراف دردشة عندما تم إجراء العلاج البروتيني. وترد أمثلة على النتائج التي تم الحصول عليها مع لجنة التحقيق عدم استهداف (dapB) والتحقيق في Atf4 -targeting باستخدام إعدادات المجهر وتعديلات الصورة نفسها. يشار إلى Atf4 حبيبات -positive مع التعريب محور عصبي واضح مع علامات استفهام في حين يتم وضع علامة حبيبات المحلية بأنها " حسنا ". مقياس شريط 20μm. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. CISH لATF4 مرنا المترجمة إلى myelinated محاور عصبية في تشكيل الحصين البشري. وبعد فرط ضغط الدم، وcounterstained المحاور مع luxol الأزرق سريع (LFB)، وكان counterstained somata الخلايا العصبية مع الكريزيل البنفسجي. دون المستوى الأمثل LFB تلطيخ قد يؤدي إذا كان كل من درجة الحرارة (A وأقحم تمثل عينات ملطخة LFB في 40 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.) وفترة حضانة (لا يظهر) وانخفضت، أو عندما لا يتم فحص مباين بعد فترات حضانة قصيرة (B وأقحم ). وترد أمثلة الأمثل تلطيخ LFB جنبا إلى جنب مع ISH باستخدام المسبار عدم استهداف (dapB) أو ATF4 -targeting التحقيق (CF والأشكال). تم تعديل الحصول على الصور تلقائيا للحصول على أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء. ATF4 حبيبات -positive مع التعريب محور عصبي واضح بالرمز علامات استفهام في حين يتم وضع علامة حبيبات محلية باسم "موافق". شريط نطاق 50 ميكرون، إدراجات 10 ميكرون. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا التقرير وصفنا استخدام التكنولوجيا ISH عالية الدقة في الكشف عن مترجم axonally Atf4 مرنا. تظهر هذه والسابقة الدراسات المنشورة أن هذه التقنية متوافقة مع القائم على الأجسام المضادة الكشف عن البروتين في الأنسجة أو حتى الأجنة كلها 33. الأهم من ذلك أنها استخدمت مؤخرا للكشف عن قوس مرنا في التشعبات من الخلايا العصبية الحصين 34. ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع الأصباغ النسيجية لتلطيخ الأنسجة. أخيرا، وهي مناسبة للكشف في وقت واحد من الهدف متعددة الرنا 28،30،33. هذه النتائج تجسد براعة عالية الدقة التقنيات RNA فرط ضغط الدم، وتعديلات طفيفة على البروتوكولات الأصلية لا يقلل من حساسية هذا الأسلوب.
بروتوكولات الأصلية واصفا استخدام تحقيقات Z-هيكل للكشف عن من mRNAs من الاهتمام في الأنسجة في قرار واحد جزيء تشير خطوتين للمرنا فضح التي تنطويالهضم البروتيني وعينة يغلي 30،35. نحن هنا تظهر كيف يؤثر سلبا على فضح التي يسببها البروتيني الناجح كشف القائم على الضد من الدردشة في المحاور كوليني الناشئة عن مسار-septo الحصين (الشكل 2A و B). وبالتالي، قررنا أن تستبعد هذه الخطوة وأداء الوحيد فضح الناجم عن الحرارة إذا تضمن counterstaining المحاور استخدام الأجسام المضادة. كما هو موضح (الشكل 2C وD)، يمكن تصور المحاور كوليني مع الأجسام المضادة لمكافحة الدردشة وكانت حبيبات Atf4 مرنا للكشف تجنب البروتيني الهضم. لاحظ أن الكشف الإيجابي للAtf4 مرنا يقوم على أساس مضان الخلفية التي تم الحصول عليها من لجنة التحقيق سلبي. يمكن إدراج عنصر تحكم إضافية في هذه المرحلة من خلال معالجة عينات الدماغ مع RNases وتحقق لهم تحقيقات الماوس Atf4 من أجل اختبار خصوصيتها. ولكن لم تدرج هذه الخطوة في إجراءات مناقشتها هنا منذتظهر الأدلة السابقة، وذلك باستخدام هذه التكنولوجيا نفسها، استنزاف كامل لAtf4 مرنا في المحاور التالية سيرنا الحقن في الحصين الماوس 18. هذه النتائج تدل على خصوصية تحقيقات ISH المستخدمة هنا. يجب أن يتم تقييم استخدام ضوابط، وغيرها من تحقيقات السلبية على أساس معينة المسائل العلمية. أخيرا، يمكن أن تكون بديلا استرجاع الناجم عن الحرارة أو جنبا إلى جنب مع الناجم عن البروتيني إماطة اللثام تبعا لمتطلبات الجسم المضاد يستخدم لمحور عصبي counterstaining. خيار استخدام واحد أو إجراء آخر أو مزيج من الاثنين معا ينبغي أن تحدد تجريبيا من قبل المستخدم.
عند تنفيذ protease- والناجم عن الحرارة إماطة اللثام في عينات الدماغ البشري، ويمكن الأصباغ النسيجية بديلا على الأضداد counterstaining المحاور. على الرغم من أن البروتوكول الأصلي هنا يتبع يوحي استخدام الهيماتوكسيلين لأنسجة counterstaining 30، هذا الصبغة ليست مناسبة للمحور عصبي تلطيخ. وبالتالي، luxol فاسوقد استخدم ر الأزرق وصمة عار myelinated محاور عصبية، وكان يستخدم الكريزيل البنفسجي لتصور أجسام الخلايا العصبية. وقد تم اختيار LFB، التي وضعتها Kluever وباريرا 31، أكثر من البقع الأخرى لأنها يمكن أن تكتمل في أقل من 2 ساعة، وإذا تم تحسين التمايز (الشكل 3C-F) لا تتدخل وصمة عار الضوء الأزرق مع حبيبات مرنا التي تظهر الظلام، النقاط البني والأسود. كما هو موضح (الشكل 3)، الأمثل LFB counterstaining يمكن أن يتحقق عندما يحتضنها العينات عند 60 درجة مئوية لمدة 60-90 دقيقة. ولكن وأوصت بأن الحضانة يتم تنفيذ تدريجي بحيث التمايز يمكن رصدها بعناية وحبيبات مرنا هي دائما واضحة. التقنيات النسيجية الأخرى مثل الفضة تلطيخ العائد الرمادي والأسود محور عصبي Bielchowsky أو بوديان في تلطيخ 36 التي قد لا تكون متوافقة مع رد الفعل القائم على DAB مولد اللون المختار في هذا التقرير. وينبغي أن يقترن المحتملة، مثل هذه التقنيات تلطيخ مع RNA CISH المقايسات التي تسمح باستخدام الأصباغ البديلة مثل بسرعة الأحمر أو الأخضر HRP 30. اختيار توليفة مناسبة من الحمض النووي الريبي ISH المقايسات والبقع محور عصبي وينبغي أن تحدد تجريبيا من قبل المستخدم.
واحد الحد من الإجراء الأول هو موضح في هذا التقرير هو الكشف عن بروتين غير ناجحة من قبل المناعية إذا تم تنفيذ البروتيني الهضم. هذا القيد لا يمكن التغلب عليها عن طريق تجنب الناجم عن البروتيني إماطة اللثام. في حالة معينة من المترجمة axonally-Atf4 أداء الناجم عن الحرارة إماطة اللثام كانت كافية للكشف عن حبيبات مرنا فوق المستويات الطبيعية الموجودة في المحاور كوليني. ولكن هذا قد لا يكون قد يلزم الحال بالنسبة ل mRNAs غيرها من الفوائد والبروتيني الهضم. إذا كان الأمر كذلك، يجب أن يتم تنفيذ counterstaining المحاور باستخدام أجسام مضادة أخرى من الجسم المضاد المضادة للدردشة هنا وصفها. بدلا من ذلك، قد تكون بديلا counterstaining على الأضداد التي كتبها أصباغ النسيجية كما هو موضح في المادة 2 من البروتوكول.
ق ق = "jove_content"> LFB تلطيخ من الألياف ليست مناسبة لرؤية المحاور كمون الفعل. تقنيات تلطيخ بديلة، مثل لBielchowsky أو الفضة تلطيخ بوديان، ويسمح التصور من كلا myelinated محاور عصبية وكمون الفعل. كلا الطريقتين تؤدي إلى تلطيخ الرمادي والأسود من المحاور التي ليست متوافقة مع DAB CISH منذ حبيبات مرنا تظهر البني والأسود كما نقاط و. ومع ذلك، هناك الأصباغ الأخرى المتاحة للكشف عن من mRNAs من الفائدة تحت المجهر brightfield، مثل بسرعة الأحمر أو الأخضر HRP 30.
كما جاء في القسم البروتوكول، واحدة من الخطوات الحاسمة لكلا الإجراءات هو إماطة اللثام الناجم عن الحرارة. إذا المغلي تتم في الميكروويف، وهناك فرص حل التبخر اعتمادا على خصائص الجهاز. اتبع الخطوات المحددة في 1.2.3 و2.2.4 لتفادي حل التبخر. لالثابتة المجمدة الأنسجة 10 دقيقة من إماطة اللثام ينبغي أن يكون كافيا، في حين أن لالبارافين جزءا لا يتجزأ منيوصى الأنسجة المغلي لمدة 15 دقيقة. إذا العينات لا تغلي بشكل مستمر للمرة أوصى هذا قد يؤدي إلى فضح جزئي. ولكن يمكن أن تختلف قليلا إذا تم اختيار الأجهزة الأخرى مثل طنجرة الأرز أو طبق ساخن بدلا من الميكروويف مرات. وينبغي أن تحدد المغلي مدة من قبل المستخدم، اعتمادا على الأسلوب.
خطوة حاسمة أخرى هي counterstaining LFB. من المهم أن كثافة صبغة زرقاء لا تتداخل مع التصور للحبيبات مرنا. وأجريت بعض التعديلات على بروتوكول الأصلي 31 من أجل الحد من كثافة الصبغة، مثل خفض درجة الحرارة (الشكل 3A) أو فترة حضانة (لا تظهر البيانات)، ومع ذلك فشلنا في التمييز بوضوح myelinated محاور عصبية في الدماغ البشري العينات . من ناحية أخرى، يحتضنها العينات في حل LFB في درجة الحرارة اقترح (60 درجة مئوية) أدى إلى تلطيخ الأمثل للmyelinated محاور عصبية. هوغير أنه أوصى بأن counterstaining يتم تنفيذ تدريجي تراقب عن كثب وجود حبيبات RNA في جميع الأوقات لضمان LFB لا تحجب مرنا من الفائدة كما هو محدد في الخطوات 2.2.28-2.2.36.
وأخيرا، يجب أن عينات لم تجف. الأساليب المذكورة في هذا التقرير تشمل الخطوات حضانة متعددة في 40 درجة مئوية، مما يزيد من فرص كاشف التبخر. كما جاء في البروتوكولات، يجب تغطية العينات مع parafilm في جميع الخطوات اللازمة لتجنب التبخر.
وباختصار، فإن تطوير عالية الدقة RNA ISH وطرق ISH أخرى وتمكن التصور من النصوص منخفضة وفيرة، بما فيها تلك المترجمة إلى محاور عصبية الكبار في الجسم الحي. هذا مهم خصوصا لسنوات عديدة مرنا توطين لوالترجمة في المحاور الكبار تم تجاهلها إلى حد كبير لأنها كانت تعتبر غير نشطة translationally.
في الختام نقدم الرواية والعلاقات العامةomising تكنولوجيا للكشف عن Atf4 والعديد من المحتمل من mRNAs أخرى في محاور عصبية الكبار من أدمغة الثدييات. سوف RNAscope تسهيل الدراسات المستقبلية على مرنا التعريب وسوف يساعد على كشف الأهمية البيولوجية الترجمة المحلية في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
References
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).
