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Neuroscience

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출 Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52799
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

Abstract

mRNA를 자주 척추 축삭에 지역화 및 로컬 번역 축삭 길 찾기 또는 개발 과정과 postdevelopmental 기간에 유지 보수, 수리 또는 신경 퇴행에 대한 분기가 필요합니다. 높은 처리량 분석은 최근 축색 돌기 이전에 예상했던 것보다 더 역동적이고 복잡한 사체을 가지고 계시했다. 이러한 분석은, 그러나 대부분의 축삭이 somato-수지상 구획에서 고립 될 수있다 배양 신경 세포에서 수행되었다. 이는 생체 내 전체 조직의 이러한 격리를 달성하는 것은 사실상 불가능하다. 따라서, 전체 동물에서의 mRNA 및 기능적 관련성의 채용을 검증하기 위해, 전 사체 분석은 이상적 동일계에서의 mRNA의 시각화를 허용 기법과 결합되어야한다. 최근에, 단일 분자 수준에서의 RNA를 검출 ISH 신규 기술이 개발되었다. mRNA는 세포 내 위치 파악을 분석 할 때 특히 중요이후 지역화의 RNA는 일반적으로 낮은 수준에서 찾을 수 있습니다. 여기에서 우리는 새로운 고감도 RNA ISH 기술을 사용하여 axonally 지역화의 mRNA의 검출을위한 두 개의 프로토콜을 설명합니다. 우리는 성숙 마우스와 인간의 두뇌의 생체 내에서 축삭에 ATF4의 mRNA의 채용을 확인하기 위해 형광 면역 조직 또는 조직 학적 염료를 사용하여 축삭 Counterstain과 함께 RNAscope ISH를 결합했다.

Introduction

축삭 mRNA의 모집 및 지방 번역은 시간적으로 공간적으로 급성으로 1 세포 외 자극에 반응하는 축삭 수 있습니다. 인트라 축삭 단백질 합성은 가장 엑손 9-11과 길 찾기를 역행 12,13 시그널링이 성장 원추 동작 2-8에서 결정적인 역할을 신경 발달의 맥락에서 이해된다. 축삭 mRNA와 리보솜 수준이 크게 14,15 감소하지만 훨씬 적은 포스트 발달 신경 축삭에서 단백질 합성의 기능적 중요성에 대해 공지되어있다. 성숙한 척추 축삭이 긴 16 병진 비활성 것으로 생각되고있다. 그러나 최근의 연구는 지역의 번역이 병적 인 상태에서 성숙 축삭에서 활성화되어 있음을 나타냅니다. 예를 들어, 서브 세트의 mRNA가 신경 손상과 인트라 축삭 단백질 합성은 이들 축색 돌기 (17)의 정확한 재생을 위해 요구되는 다음 재생 축삭을 모집한다. 또한, 우리 그룹의 하S는 알츠하이머 병 펩타이드 Aβ 1-42, 그리고 전사 인자 ATF4의 지역 번역 로컬 노출이 신경 소마 (18)에 축삭에서 Aβ 1-42의 신경 퇴행성 효과를 전파하는 데 필요한 후 특정의 mRNA가 축색 돌기에 채용되는 것을 보여 주었다. 마지막으로, 높은 처리량 분석 성숙한 축삭 특히 병리 적 상태하에, 18-21 예상보다 더 복잡하고 동적 사체가 있다고 밝혀졌다. 이러한 연구의 견지에서, 고감도 및 구체적인 방법은 성인 신경계 axonally 지역화 mRNA를 필요 검출.

mRNA의 모집과 성숙 축삭의 지역에 번역 작업의 대부분은 배양 된 신경 세포에서 수행되었다. 전문 배양 방법 somato-수지상 구획 18-20에서 축삭의 분리를 허용하는 존재하기 때문에 전 사체 분석을 위해 이것은 특히 사실이다. 이러한 연구는 가치있는 기능을 제공하고 있지만성숙한 축삭에서 현지 번역의 역할에 ight는 질문 배양 신경 세포 충실 생체 내에서 상황을 나타내는 또는 mRNA의 모집 배양 조건에 축삭의 적응 응답이 경우 여전히 열려 있는지 여부. 몇몇 연구는 생체 내에서 축삭을 성숙 mRNA의 모집의 증거를 제공했다. 예를 들어, 후각 마커 단백질을 코딩하는 전 사체는 성인 감각 뉴런 22 축삭에서 검출되었다. β - 굴지의 mRNA의 3 'UTR을 포함하는 형질 전환 생쥐에서 말초와 중추 신경계 신경 세포의 축색 돌기로 이송하고, 로컬 개발 기간 23 후 변환됩니다. Xenopues가 올챙이를 laevis의에서 라민 B2 mRNA의 망막 축삭에 지역화되고 그 고갈 축삭 개발 (21) 후 축삭 유지 보수에 영향을 미친다. 사이토 크롬 C 산화 효소 IV에 대한 mRNA의 부호화의 축삭 전송에 대한 간섭은 마우스 (24)의 동작을 변경한다. 마지막으로, ATF4의 mRNA는 성인에서 발견된다Aβ 1-42의 맥락에서 쥐와 인간의 두뇌 xons은 신경 퇴행 (18) - 유도.

높은 처리량 사체의 분석은 시험 관내에서 격리 된 축삭의 mRNA의 프로필을 확인하지만 축삭이 단독으로 발견하지만 신경 세포 기관, 아교 세포와 다른 세포 유형과 혼합 결코 전체 조직에 있기 때문에 생체 내 연구에 대한 제한을 가지고 유용한 것으로 입증되었다. 따라서, 이러한 분석의 mRNA의 세포 내 위치 파악을 확인 이미징 기술과 결합되어야한다. 현장 하이브리드 (RNA ISH)에서 RNA는 세포와 조직의 특정 RNA 서열의 검출 및 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 원래 RNA ISH 분석은 거의 axonally 지역화의 mRNA의 경우입니다 매우 풍부한 RNA를 (25)의 식별에 적합했다. 노력을 증가 지난 수십 년 동안 단일 분자 수준에서의 mRNA의 검출을 허용 새로운 기술 개발에 투입되었을 27를 참조하십시오) 50 머 레이블. 위에서 언급 한 기술 및 여기에 설명 된 것과의 주요 차이점은 이후 20 번 Z 구조 (되지 선형)는 전형적으로 관심 보장 특이성 및 낮은 배경 레벨의 RNA의 ~ 1킬로바이트 영역을 대상으로 프로브를 사용하는 것이다. 프로브는 다음 마지막으로 형광 표지 또는 발색 반응을 허용 효소가 결합되어 프리 앰프와 앰프 순서와 하이브리드있다. 이러한 증폭 단계 ISH 다른 기술 (28)에 비해 신호대 잡음비를 개선한다. 여기에서 우리는 형광 면역 세포 또는 축삭으로 대조를 허용하는 조직 학적 염료 중 결합 RNAscope를 사용하여 두 개의 프로토콜을 설명합니다. 두 프로토콜은 성인 개월에 ATF4의 mRNA의 축삭 현지화를 시각화하기에 적합사용하고 인간의 두뇌.

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Protocol

모든 동물의 절차는 컬럼비아 대학의 IACUC 및 관리 및 실험 동물의 사용을위한 관련 규정에 의해 승인 된이 추적 관찰 하였다. 참고 :의 RNase-무료 또는 DEPC 처리 된 물에 ISH 절차에 사용되는 모든 버퍼를 준비합니다. ISH가 완료된 있지만 버퍼가 여전히 멸균 된 두 번 증류수 제조 및 / 또는 필터링에 의해 살균하는 것이 좋습니다 후이 권장 사항은 엄격하게 할 필요가 없습니다.

1. 면역에 의해 이어 원위치 하이브리드 화에서 성인 마우스 뇌 사용하여 형광의 콜린성 축삭에 ATF4 mRNA의 현지화 (물고기)의 검출

  1. 파라 포름 알데히드 고정 냉동 뇌 조각의 샘플 준비
    1. 다음과 같은 예를 들어, 고정 냉동 마우스 뇌에서 조각을 준비합니다.
      1. 간단히, 케타민으로 마취에 의해 9개월 된 쥐를 희생 (100 mg을 kg -1 체중)과 자일 라진 (10 mg을 kg -1 몸 weigHT) PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 transcardial 주입 (PH 7.4) 하였다.
      2. 4 O ℃에서 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 두뇌 및 사후 수정을 제거
      3. 정착 후, 4 O C.에서 24 시간 동안 PBS (PH 7.4)의 샘플을 30 % 수크로오스 PBS에 세 번 세척 cryoprotect
      4. OCT에서 임베드 뇌는 저온 유지 장치에 20 μm의에서 직렬 섹션 화합물을 동결 폴리 -D- 라이신 처리 현미경 슬라이드에 탑재합니다. -20 ℃로 사용할 때까지 뇌 조각을 유지합니다.
    2. 실온에서 30 분 동안 냉동 및 공기 건조에서 파라 포름 알데히드 고정 뇌 조각을 제거합니다.
    3. 1X PBS로 3 회 세척 할 것.
    4. 흄 후드에서 다시 수정 뇌는 실온에서 4 % 파라 포름 알데히드와 20 분을 조각.
      참고 :주의 : 4 % 파라 포름 알데히드는 독성이 적절 안전 프로토콜 다음 처리 및 폐기해야합니다.
    5. 1X PBS로 3 회 세척 할 것.
    6. 뇌 조각을 탈수.
      1. 50 %, 75 % 및 100 %를 준비에탄올 솔루션을 제공합니다.
      2. RT에서 5 분 동안 50 % 에탄올에 담가 슬라이드.
      3. 실온에서 5 분 동안 75 % 에탄올에 슬라이드를 담가.
      4. RT에서 5 분 동안 100 % 에탄올에 담가 슬라이드.
      5. RT에서 5 분 동안 신선한 100 % 에탄올에 담가 슬라이드. 참고 : 또는 슬라이드 1 개월까지 -20 C o를 100 % 에탄올에 저장 될 수있다.
  2. FISH 분석은 열 - 유도 항원 / RNA의 언 마스킹을 이용한 면역 조직 화학에 이어
    1. 시작하기 전에 필요한 모든 재료를 준비 :
      1. 40 O C에 혼성화 오븐을 고온 가습 환경을 만들기 위해 오븐에 증류수를 함유 트레이를 배치했다.
      2. 슬라이드 상자를 가지고 내부 슬라이드 상자를 가습 증류수​​에 적신 종이 타월을 배치합니다. 하이브리드 오븐에서 슬라이드 상자를 놓습니다.
      3. 냉장고에서 프로브 (음 및 대상 프로브 모두)를 제거하고 10 분 동안 하이브리드 오븐을 가열한다. 프로브는 다우를 냉각하자실온에서 N.
      4. 실온에서 (형광 멀티 플렉스 시약 키트에 포함) 증폭 시약 AMP 1-4 평형.
      5. 항원 검색 용액을 준비한다 : 10 mM의 시트르산 나트륨 (PH 6), 0.05 % 트윈 20 주 : RT 용액 무기한으로 저장 될 수 있고, 미래의 염색에 사용된다.
      6. 의 RNase-무료 또는 DEPC 처리 된 물 (형광 멀티 플렉스 시약 키트에 포함) 50 배 원액을 희석 1X 세척 버퍼를 준비합니다.
        주 : 1X 세척 완충액 1 개월 동안 실온에서 저장 될 수 있고, 미래의 염색에 사용된다. 50 배 세척 버퍼는 침전 수 있습니다. 그렇다면, 1X 용액을 제조하기 전에 10 분 동안 40 ℃로 가열 50 배 세척 버퍼입니다.
    2. 실온에서 5 분 동안 100 % 에탄올과 공기 건조에서 슬라이드를 제거합니다.
    3. 항원 검색 용액 50 ㎖를 포함하는 코 플린 항아리를 준비합니다. 항원 검색 용액에 담그고 슬라이드를 전자 레인지에서 10 분 동안 삶아.
      참고 : 또는 장소는 100mm에 가로 슬라이드검색 솔루션의 100 ㎖를 포함하는 직경 둥근 유리 접시.
      1. 증류수 1 L 비커를 입력하고 전자 레인지에 넣습니다.
        참고 : 언 마스킹을 수행 할 때 물이 열을 "버퍼"합니다.
      2. 전자 레인지 내부 항원 검색 솔루션에 슬라이드를 놓습니다. 삶아 5 분 동안 고전력 슬라이드. 샘플을 끓는 멈춘 직후 여분의 열은 5 분 동안 높은 전력으로 다시 슬라이드.
      3. 실온에서 슬라이드를 아래로 냉각.
        주 : CRITICAL STEP : 끓는 기간 및 절차는 마이크로파의 특징에 따라, 사용자에 의해 결정되어야한다. 빨리 끓는 용액은 더 높은 증착 가능성을 개시한다. 이 경우는 샘플을 두 번 10 분의 총에 마스크 시간을 완료하는 것보다 더 짧은 시간 동안 삶은 것이 좋습니다. 가열 매체 또는 낮은 전력으로 수행되는 경우 반대로, 언 마스킹을 10 분 동안 한 번 수행 될 수있다. 그러나,에게 샘플 continuousl을 끓여하지 않습니다약 10 분의 총 Y,이 검출 될 표적 RNA와 단백질의 양쪽 부분에 마스크가 발생할 수도있다.
    4. 워시는 1X PBS로 3 회 슬라이드.
    5. 배경 염색을 평가하기 위해 사용되는 뇌 조각으로 설정 dapB 프로브의 3 방울 (~ 100 μL) - (2)를 추가합니다. 참고 : dapB 프로브 세트는 박테리아 유전자를 대상으로하고 포유 동물의 RNA를 인식하지합니다.
    6. 관심의 RNA를 검출하기 위해 사용되는 뇌 조각으로 설정 타겟팅 프로브의 3 방울 - (2)를 추가합니다. 참고 : 프로브 세트가 잔여 20 대상 - ATF4 mRNA를이 예제에 사용 된 마우스 1381을.
    7. 파라 필름으로 커버 슬라이드, 프로브 증발을 방지 하이브리드 오븐 내부 가습 슬라이드 상자에 배치하고 2 시간 동안 40 ℃로 그들을 품어.
      참고 : 옵션 : 추가 뇌 조각을 마우스 Polr2A을 대상으로 프로브 세트와 하이브리드 및 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다.
    8. 워시 SLI데 두 번 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼.
    9. 2 추가 - 각각의 뇌 조각을 증폭 시약 AMP (1) - 플로리다 3 방울을 슬라이드 상자에 배치하고, 하이브리드 오븐에서 30 분 동안 40 ℃로 배양, 파라 필름과 슬라이드 커버.
    10. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드.
    11. 2 추가 - 각각의 뇌 조각을 증폭 시약 AMP 2-FL 3 방울을 슬라이드 상자에 배치하고, 하이브리드 오븐에서 15 분 동안 40 ℃로 배양, 파라 필름과 슬라이드 커버.
    12. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드.
    13. 2 추가 - 각각의 뇌 조각을 증폭 시약 AMP 3 플로리다의 3 방울을 슬라이드 상자에 배치하고, 하이브리드 오븐에서 30 분 동안 40 ℃로 배양, 파라 필름과 슬라이드 커버.
    14. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드.
    15. 2 추가 - 각각의 뇌 조각을 증폭 시약 AMP 4 플로리다의 3 방울을에 배치, 파라 필름과 슬라이드를 커버슬라이드 상자와는 혼성화 오븐에서 15 분 동안 40 O C 부화.
    16. 워시는 1X PBS로 2 분 1X 세척 버퍼 RT에서 두 번 두 번 슬라이드.
    17. 100 추가 - 슬라이드를 3 ㎎ / ㎖ BSA, 100 mM의 글리신 및 0.25 % 트리톤 X-100의 PBS에서 (PH 7.4)을 함유하는 차단 용액 (완전히 슬라이스를 덮거나 충분한 부피) 200 μL를 파라 필름으로 그들을 덮고 RT에서 30 분 동안 배양한다.
    18. , 슬라이드에 솔루션 (1/100) 차단에 희석 방지 채팅 항체의 200 μL 파라 필름으로 그들을 커버 4 O ℃에서 2 일간 배양 - 100 추가 뇌 조각이 건조하지 않도록해야합니다. 필요한 경우, 24 시간 배양 후 뇌 조각에 방지 채팅 항체 솔루션을 다시 적용합니다.
    19. 워시 RT에서 5 분 동안 PBS 1X에 세 번 슬라이드.
    20. (100) 추가 - 해당 알렉사 - 복합 이차 항체의 200 μl를 (. 예를 들어,이 특정 예를 들어, 알렉사-594 당나귀 안티 - 염소) 슬라이드는, 파라 필름과 incub 커버실온에서 1 시간 동안 먹었다.
    21. 워시 RT에서 5 분 동안 PBS 1X에 세 번 슬라이드.
    22. 워시는 증류수로 한 번 슬라이드.
    23. 마운트 DAPI 함유 설치 매체 슬라이드.
    24. 형광 현미경 하에서 뇌 조각 시각화.

룩솔 빠른 블루와 크레 실 바이올렛으로 대조로 이어 원위치 하이브리드 (CISH)에서 원체를 사용하여 인간의 두뇌 샘플의 축삭에 ATF4 mRNA의 현지화 2. 검출

  1. 포르말린 고정 파라핀 인간의 뇌 샘플의 샘플 준비
    1. 1 시간 동안 60 ℃로 건조 오븐에 구워 슬라이스.
    2. 흄 후드에서 Deparaffinize의 뇌 조각.
      참고 :주의 : 시약은 독성 및 처리해야하고 적절한 보안 지침에 따라 폐기 된
      1. 10 분 동안 두 번 크실렌 대안 청소 에이전트에 슬라이드를 담가.
      2. 1 분 동안 두 번 100 % 에탄올에 슬라이드를 담가.
      3. IR 건조 슬라이스 실온에서 5 분. 참고 : 또는 샘플 RT O에서 건조 될 수 있습니다 / N하지만 24 시간 이내에 사용해야합니다.
  2. 미노 (DAB)의 열 유도 단백질 분해 효소 유도의 RNA에 마스크를 사용 룩솔 빠른 파란색과 크레 보라색 얼룩 다음 발색 ISH 분석 기반
    1. 시작하기 전에 필요한 자료를 준비 :
      1. 40 O C에 혼성화 오븐을 고온 가습 환경을 만들기 위해 증류수를 함유 트레이를 배치했다.
      2. 슬라이드 상자를 가지고 내부 슬라이드 상자를 가습 증류수​​에 적신 종이 타월을 배치합니다. 하이브리드 오븐에서 슬라이드 상자를 놓습니다.
      3. 의 RNase-무료 또는 DEPC 처리 된 물 (CISH 시약 키트에 포함) 10 배 원액을 희석하여 1 배 전처리 2를 준비합니다. 전처리 열판에서 시행된다면, 전처리 경우 (접시 핫 플레이트 간의 접촉면을 증가 100mm 직경의 유리 접시에 전처리 용액 100 ㎖를 추가1.2.3에 규정 된 마이크로파에서 수행되고, 코 플린 항아리) 대신에 사용될 수있다. 100 O C의 열 솔루션 및 샘플을 잠수하기 전에 더 이상 30 분 이상 끓는을 유지하지 않습니다.
      4. 열 음과 양의 프로브를 10 ~ 40 O C에서 분, 실온에서 냉각.
      5. 실온에서 (CISH 시약 키트에 포함) 증폭 시약 AMP 1-6 평형.
      6. 증류수 (CISH 시약 키트에 포함) 50 배 원액을 희석 1X 세척 버퍼를 준비합니다. 주 : 1X 세척 완충액 1 개월 동안 실온에서 저장 될 수 있고, 미래의 염색에 사용된다.
    2. 각 뇌 슬라이스 전처리 1 ~ 4 방울 (~ 120 μL)를 추가 파라 필름으로 커버하고 실온에서 10 분 동안 품어.
    3. 신선한 증류수에 3 ~ 5 회 반복한다.
    4. 열 유도에 마스크를 수행합니다
      1. (CISH 시약 키트에 포함) 뜨거운 전처리 2로 전송 슬라이드 15 분 동안 솔루션 끓인다. 끓는는 보장 핫 플레이트에서 수행 할 수 있습니다 : 참고연속 비등 또는 1.2.3에 규정 된 중요한 단계) 다음 전자 레인지에.
    5. 즉시 증류수에 슬라이드를 전송하고 3 ~ 5 회 반복한다.
    6. 워시 신선한 100 % 에탄올에 3 ~ 5 번 슬라이드.
    7. 공기 건조 슬라이스 실온에서 5 분. 참고 : 또는 조각을 건조 할 수있다 O / N을.
    8. 단백질 분해 효소에 의한 마스크 해제를 수행합니다
      1. (CISH 시약 키트에 포함) 전처리 3의 4 방울을 추가, 파라 필름으로 커버하고 하이브리드 오븐에서 40 O C에서 30 분을 품어.
    9. 워시 신선한 증류수에 3 ~ 5 번 슬라이드.
    10. 배경 염색을 평가하기 위해 사용되는 뇌 조각으로 설정 dapB 프로브의 4 방울을 추가합니다.
    11. 관심의 RNA를 검출하기 위해 사용되는 뇌 조각으로 설정 대상 프로브의 4 방울을 추가합니다.
      참고 : 잔여 15 대상 프로브 세트 - 인간 ATF4의 mRNA의 1256이 예에서 사용된다. 옵션 : 추가 뇌 조각은 HYB 될 수 있습니다인간의 PPIB을 대상으로 프로브 세트 ridized 양성 대조군으로 사용.
    12. 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓고 2 시간 동안 배양한다. 혼성화 오븐에서 40 ℃로.
    13. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드.
    14. 각각의 뇌 조각에 AMP (1) 시약의 4 방울을 추가, 파라 필름과 슬라이드를 커버, 슬라이드 상자에 배치하고, 하이브리드 오븐에서 30 분 동안 40 ℃로 배양한다.
    15. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드.
    16. 각각의 뇌 조각에 AMP 2 시약의 4 방울을 추가, 파라 필름과 슬라이드를 커버, 슬라이드 상자에 배치하고, 하이브리드 오븐에서 15 분 동안 40 ℃로 배양한다.
    17. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드.
    18. 각각의 뇌 조각에 AMP 3 시약의 4 방울을 추가, 파라 필름과 슬라이드를 커버, 슬라이드 상자에 배치하고, 하이브리드 오븐에서 30 분 동안 40 ℃로 배양한다.
    19. 1X이었다 씻어 두 번 슬라이드실온에서 2 분 시간 버퍼입니다.
    20. 각각의 뇌 조각에 AMP 4 시약의 4 방울을 추가, 파라 필름과 슬라이드를 커버, 슬라이드 상자에 배치하고, 하이브리드 오븐에서 15 분 동안 40 ℃로 배양한다.
    21. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드.
    22. 각각의 뇌 조각에 AMP 5 시약의 4 방울을 추가, 파라 필름과 슬라이드를 커버하고 실온에서 30 분을 품어.
    23. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드.
    24. 각각의 뇌 조각에 AMP 6 시약의 4 방울을 추가, 파라 필름과 슬라이드를 커버하고 실온에서 15 분을 품어.
    25. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드.
    26. 각 뇌 슬라이스 ~ 솔루션의 120 μl를 추가, (CISH 시약 키트에 포함 된) 동일 BROWN-1의 볼륨과 갈색-2 시약을 혼합 파라 필름으로 커버하고 실온에서 10 분을 품어.
    27. 워시는 실온에서 2 분 1X 세척 버퍼로 두 번 슬라이드와 증류수에 한 번 씻어.
      참고 : 중요한 단계를 다음 단계가 중요하다RNA 과립의 존재를 마스킹없이 최적의 축삭 Counterstain과를 얻을 수 있습니다.
    28. 명 시야 현미경으로 관심의 mRNA의 존재를 확인 Counterstain과 수행하기 전에. Counterstain과 절차를 통해 puncta의의 존재를 모니터링 할 수있는 뇌 샘플에서 참조 영역을 정의합니다.
    29. 60 O ℃에서 예열 룩솔 빠른 블루 솔루션
    30. 장소 룩솔 빠른 파란색 슬라이드 60 O ℃에서 30 분을 품어
    31. 증류 된 물에 여러 번 씻어.
    32. 딥 분화를 시작하기 위해, 0.05 %의 탄산 리튬 용액에 여러 번 슬라이드.
    33. 딥 신선한 75 % 에탄올에 두 번 슬라이드.
    34. 증류수에 씻어.
    35. 시야 현미경 뇌 조각을 확인합니다. 회색과 흰색 물질이 다크 블루 / 블랙 puncta에로 계속 표시 구별와 RNA 과립으로 시작해야합니다. 축삭은 밝은 파란색 섬유로 나타나는 시작되었는지 확인합니다.
    36. 반복 2.2.32에 2.2.28 단계를 반복합니다. Perfor20 분 단계 신중 Counterstain과 RNA 및 과립의 존재를 모니터링 - 10 룩솔 패스트 블루 용액 m 인큐베이션. 참고 : 일반적으로, 최적의 Counterstain과 60 년 인수 - 그것은 RNA 과립이 룩솔 빠른 푸른 얼룩 (예를 그림 2 참조)에 의해 마스크 될 수 있다고 의심되는 경우 90 분 (총 배양 시간)하지만 시간을 단축 할 수있다.
    37. RT에서 10 분 동안 크레 실 바이올렛 용액 슬라이드 부화.
    38. 증류수에 슬라이드를 씻어.
    39. 딥은 70 % 에탄올 5 ~ 10 배를 슬라이드.
    40. 100 % 에탄올 3 빠른 변화를 통해 뇌 조각 탈수.
    41. 흄 후드에서, 2 분, 실온에서 5 분 세 번째 크실렌 대안 청소 에이전트에 두 번 배양에 의한 명확한 뇌 조각.
    42. 크실렌 계 영구 설치 매체에 마운트 뇌 조각.
    43. 시야 현미경으로 샘플을 분석 할 수 있습니다.

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Representative Results

상술 한 절차의 간단한 요약이도 1에 도시된다.

ATF4 mRNA의 최적의 검출은 열 유도에 마스크를 사용하여 콜린성 축삭의 과립

지역화 된 mRNA의 축삭을 평가할 때, 축삭을 식별 할 수 있어야하고, 낮은 풍부한 RNA를 시각화 할 수있는 것이 중요하다. 여기에 설명 된 RNA ISH 기술은 단일 분자 분해능의 RNA를 검출 할 수있다. 이 기술을 사용하는 표준 프로토콜을 효율적으로 표적 RNA를 검출하기 위해 두 개의 마스크를 제거하는 절차의 조합을 제안한다 : 프로테아제 - 유도 및 언 마스킹 (28)을 열 유도. ISH는 축삭을 식별하기 위해 면역 조직 화학 염색과 결합 될 때 그러나, 단백질 분해 효소에 의한 마스크 해제 최적의 항원 검출 (29)가 발생하지 않을 수 있습니다.

사용 된 항체는 C를 인식하는데 실패 이후 여기에 설명 된 제 1 프로토콜에서, 프로테아제 소화는 피시켰다긍정적 인 mRNA의 과립이 검출되었다하더라도 일반적으로 septohippocampal 경로 (그림 2A와 B)에서 발생하는 치아 이랑의 축삭에서 발견 holine 아세틸 (하는 ChAT). 열 - 유도 된 10 mM 시트 레이트 완충액 (pH 6)와 검색, 반면에, 반 채팅 항체에 의해 인식되는 에피토프의 무결성을 보장하고 mRNA를 효율적 간담 염색 축삭 (도 2C 및 D)에서 검출 된 타겟. 여기에 제시된 결과 (그림 2) mRNA의 모집 및 지방 번역이 1-42 올리고머 해마에 Aβ의 주입에 의해 유도 된 성인 쥐의 치아 이랑의 ATF4의 존재를 보여줍니다. 이전 증거 ATF4 mRNA를 기저 상태 (18)하에 시험 관내 또는 생체 내에서 축색 돌기에서 검출되지 않고, 따라서 이러한 실험 패러다임이 도시되지 않는다는 것을 암시한다.

ATF4의 최적의 검출모두 열 유도 단백질 분해 효소에 의한 언 마스킹을 사용하여 축삭의 mRNA의 과립

단백질 분해 효소 전처리가 필요한 경우에 유용하지 않을 수 있습니다 폭로 유도 열을 수행 할 때 항체 기반의 단백질 검출 RNA ISH 기술과 호환되는지 보여 위에서 설명한 결과 반면. 2 장에서는 일반적으로 뇌 샘플 (31, 32)에 사용되는 조직 학적 얼룩과 함께 이전에 발행 된 절차 (28, 30) 다음 축삭 내 ATF4 mRNA의 검출에 대해 설명합니다.

이 과정에서 중요한 단계는 CISH 스테인드 축삭에서 mRNA의 과립의 존재를 마스킹없이 룩솔 빠른 블루 (LFB)를 사용하여 유수 섬유의 최적 Counterstain과입니다. 이 목적을 위해 사용되는 시약 LFB 90 분 60의 배양 시간에 따라 최적 Counterstain과 허용. Counterstain과 모두 배양 온도와 시간이 감소되고 실패 할 (도 3a 및 인셋, 데이터를 도시되지 않음)mRNA의 과립은 여전히​​ 볼 수 있지만, 차, 자신의 축삭 현지화를 확인할 수 없습니다. 한편, 긍정적 인 과립의 존재를 모니터링하지 않고 60 분간 또는 60 ℃로 더 긴 뇌 샘플들을 배양 주기적 염료에 의한 관심의 mRNA (도 3b 및 인셋)의 비가역 마스킹 될 수 있습니다. 따라서 그것은 샘플을 30 분 동안 LFB에서 인큐베이션하고 더 인큐베이션 축삭 RNA 과립 (도 3d-F) 모두의 최적의 염색을 구하는 시료마다 10 ~ 20 분에 의하면 단계적으로 실시하는 것이 좋다. ATF4 긍정적 인 과립이 명확하게 검출 할 수있다이 지침에 따라 모두 제어 (그림 3D) 및 알츠하이머 병 (그림 3 층) 뇌 샘플.

그림 1
그림 1. 요약 워크 플로우RNA ISH는 축삭 Counterstain과 다음의. 검은 색으로 묘사 단계 예시 한 두 가지 절차에 공통입니다. 파란색으로 표시 단계는 빨간색으로 강조 사람들은 발색 ISH 스테인드 포르말린 고정 파라핀 포함 된 샘플에 고유 한 반면 형광 ISH 스테인드 파라 포름 알데히드 고정 샘플에 따라 다릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
ATF4 mRNA의 그림 2. 물고기가 성인 쥐의 치아 이랑에서 콜린성 축삭에 지역화. 물고기는 콜린 아세틸의 항체 검출 (하는 ChAT) 다음에 단백질 분해 효소 유도 (L 송금 패널) 또는 열 유도 (오른쪽 패널)에 마스크를 사용하여 수행되었다 . antibODY는 단백질 분해 효소 처리를 수행 할 때 채팅을 인식하지 못했습니다. 비 대상 프로브 (dapB) 및 현미경 설정 및 이미지 조정이를 이용한 ATF4 -targeting 프로브로 얻은 결과의 예는 표시됩니다. 불분명 축삭 현지화와 ATF4 양성 과립은 물음표로 표시됩니다 지역화 된 과립 "로 표시되는 동안 그래 ". 스케일 바 20 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
ATF4 mRNA의 그림 3. CISH 인간의 해마 형성 유수 축삭에 지역화. ISH에 따라, 축삭은 룩솔 빠른 블루 (LFB)으로 대조하고 신경 세포 인 somata은 크레 실 바이올렛으로 대조했다. 온도 모두 (A와 삽입은 4 시간 동안 40 ℃로 LFB 염색 샘플을 나타냅니다.) 경우에 최적 인 LFB 염색 및 배양 시간 (도시하지 않음) 감소되거나 발생할 수 Counterstain과 짧은 배양 기간 (B와 삽입 후 확인되지 않는 경우 ). 비 대상 프로브 (dapB) 또는 ATF4 -targeting 프로브를 사용하여 ISH와 함께 최적의 LFB 염색의 예 (CF와 세트)을 나타내었다. 지역화 된 과립은 "OK"로 표시되는 동안 이미지 수집이 자동으로 불분명 축삭 현지화와 함께 최고의 신호 대 잡음비. ATF4 양성 과립에 대한 조정은 물음표로 표시됩니다. 스케일 바 50 μm의 10 μm의 인 세트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이보고에서는 axonally 지역화 ATF4 mRNA를 검출 고해상도 ISH 기술의 사용을 설명한다. 이 이전 발표 된 연구는이 기술이 조직 또는 전체 배아 (33)에 항체 기반의 단백질 검출과 호환되는지 보여준다. 중요한 것은 최근 해마 뉴런의 수상 돌기 (34) 내의 아크의 mRNA의 검출을 위해 사용되었다. 또한, 조직 학적 염색 용 염료와 조합 될 수있다. 마지막으로, 다수의 RNA를 대상 28,30,33의 동시 검출을 위해 적합하다. 이러한 결과는 고해상도 RNA ISH 기술의 기능성을 예시하고, 원래의 프로토콜을 약간 변형이 이러한 방법의 민감도를 감소시키지 않는다.

단일 분자 분해능 조직에서 관심의 mRNA를 검출하기위한 Z-구조 프로브의 사용을 기술하는 원래 프로토콜 mRNA를 포함하는 마스크 제거 단계를 두 건의프로테아제 소화 샘플 30,35 끓는. 여기에서 우리는 단백질 분해 효소에 의한 부정적인 폭로가 septo - 해마 경로 (그림 2A와 B)에서 발생하는 콜린성 축삭에서 채팅을 성공적으로 항체 기반의 탐지에 영향을 미치는 방법을 보여줍니다. 따라서, 우리는이 단계를 제외하고 축삭으로 대조 항체의 사용을 포함하는 경우에만 열 유도 언 마스킹을 수행하기로 결정했다. (그림 2C와 D)와 같이, 콜린성 축삭은 안티 채팅 항체로 시각화 및 ATF4 mRNA의 과립 단백질 분해 효소의 소화를 방지 검출되었다 할 수있다. ATF4의 mRNA의 양의 검출이 음극 프로브로부터 얻어진 배경 형광 기준입니다. 여분의 제어 RNases와 뇌 샘플들을 처리 및 특이성을 테스트하기 위해 마우스 ATF4 프로브로 프로빙함으로써이 점에서 포함될 수있다. 그러나이 단계는 이후 여기에 설명 된 절차에 포함되지이 같은 기술, 마우스 해마 (18)에 siRNA를 주입 다음 축삭의 ATF4의 mRNA의 완전한 고갈을 사용하여 이전의 증거 쇼. 이러한 결과는 여기에 사용 ISH 프로브의 특이성을 증명한다. 네거티브 컨트롤 프로브 이외의 사용은, 특히 과학 질문에 기초한 평가되어야한다. 마지막으로, 검색을 유도 가열에 의해 치환 또는 축삭 대조 염색에 사용 된 항체의 요구에 따라 유도 된 프로테아제에 마스크와 결합 될 수있다. 하나 또는 다른 절차 또는이 둘의 조합을 사용하는 선택은 사용자에 의해 실험적으로 결정되어야한다.

인간의 뇌 샘플에서 프로테아제 및 열 유도 언 마스킹을 수행 할 때, 조직 학적 염료는 항체 기반의 축삭으로 대조를 대체 할 수 있습니다. 여기에이 다음에 원래의 프로토콜이 30으로 대조 조직에 대한 헤 마톡 실린의 사용을 제안하지만, 이러한 염료는 축삭 염색에 적합하지 않습니다. 따라서, 룩솔 FASt 파랑 유수 축색 얼룩이 사용하고, 크레 실 바이올렛은 신경 세포체를 시각화하는데 사용되었다. 분화가 최적화되면 Kluever과 발레라 (31)에 의해 개발 된 LFB는, 그 미만에서 2 시간에 완료 할 수 있기 때문에 다른 얼룩 위에 선택 하였다 (도 3C-F)는 하늘색 얼룩은 어두운 표시 mRNA의 과립을 방해하지 갈색 검은 점. 90 분 - (도 3)에 도시 된 바와 같이 60, 60 ℃로 샘플을 배양 할 때, 최적의 LFB의 대조 염색은 달성 될 수있다. 그것은 그러나 차별주의 깊게 모니터링 할 수 있으며, mRNA의 과립이 항상 볼 수 있도록 배양이 단계적으로 수행하는 것이 좋습니다. 이와 보고서에서 선택한 DAB 기반의 발색 반응과 호환되지 않을 수 있습니다 (36) 염색 Bielchowsky의 또는 Bodian의 실버 염색 수율 회색 검은 축삭과 같은 다른 조직 학적 기법. 확실하게, 이러한 염색 기술은 RNA CISH 분석과 결합되어야즉, 이러한 고속 적색 또는 녹색 HRP (30)로 대체 염료의 사용을 허용한다. ISH 및 검정 RNA 축삭 얼룩의 적절한 조합을 선택하는 것은 사용자에 의해 실험적으로 결정되어야한다.

프로테아제 소화가 수행되는 경우이 보고서에 설명 된 첫 번째 절차 중 하나 제한은 면역 조직 화학 염색에 의한 실패 단백질 검출입니다. 이 제한은 프로테아제 - 유도 된 언 마스킹을 피함으로써 극복 될 수있다. 열 유도 언 마스킹을 수행 axonally 지역화 ATF4의 특별한 경우 콜린성 축삭의 배경 수준 이상으로 mRNA의 과립을 감지하기에 충분했다. 그러나 이것은 필요할 수 있습니다 관심과 단백질 분해 효소 소화의 다른의 mRNA의 경우하지 않을 수 있습니다. 그렇다면, 축삭 대조 염색은 여기에 설명 된 안티 채팅 항체 이외의 항체를 사용하여 수행되어야한다. 프로토콜의 2 장에 설명 된대로 또는 항체 기반으로 대조는 조직 학적 염료로 치환 될 수 있습니다.

30 패스트 적색 또는 HRP 같은 시야 현미경으로 관심의 mRNA의 검출에 사용할 수있는 다른 염료가있다.

프로토콜 절에서 언급 한 바와 같이, 두 절차의 중요한 단계 중 하나는 열에 의해 유도 된 마스크를 제거한다. 비등이 마이크로파에서 수행되는 경우, 장치의 특성에 따라 용액 증착법의 가능성이있다. 솔루션의 증발을 방지하기 위해 1.2.3과 2.2.4에 규정 된 단계를 수행합니다. 마스크 해제의 고정 냉동 조직 10 분은 충분해야 들어, 파라핀에 대한 반면 포함15 분 동안 끓는 조직을 권장합니다. 샘플 권장 시간 동안 지속적으로 비등하지 않는 경우이 부분에 마스크 될 수 있습니다. 그러나 이러한 밥솥 또는 핫 플레이트와 같은 다른 장치 대신 전자 레인지로 선택하는 경우 시간이 약간 다를 수 있습니다. 끓는 기간은 방법에 따라, 사용자에 의해 결정되어야한다.

또 다른 중요한 단계 LFB의 대조 염색이다. 그것은 청색 염료의 강도가 mRNA의 과립의 가시화를 방해하지 않는 것이 중요하다. 원래 프로토콜 (31)에 약간 변형이 그러한 온도 (도 3a) 또는 배양 시간 (데이터는 도시되지 않음)를 감소로, 염료의 농도를 감소시키기 위해 수행되었다 그러나 우리는 분명히 인간 뇌 샘플 유수 축색를 구별하는데 실패 . 반면에, 제안 된 온도 (60 오 C)에서 LFB 용액에서 샘플을 배양하는 유수 축색 최적 염색 결과. 그것그러나 대조 염색 단계 신중 2.2.28-2.2.36에 규정 LFB 관심의 mRNA를 마스크하지 않도록 항상 RNA 과립의 존재를 모니터링하는 단계적으로 실시하는 것이 좋다.

마지막으로, 샘플은 건조해서는 안됩니다. 이 보고서에 기재된 방법은 시약 증발 가능성이 높아 40 O C, 여러 배양 단계를 포함한다. 프로토콜에 명시된 바와 같이, 샘플은 증발을 방지하기 위해 모든 단계에서 파라 필름으로 피복한다.

요약하면, 고해상도 RNA ISH ISH 및 다른 방법의 개발은 생체 내에서 성인 축삭 지역화 포함한 저 풍부한 사체의 시각화를 가능하게한다. 이것은 그들이 병진 비활성 간주되었다으로 크게 간과 한 성인 축삭에서 다년간의 mRNA에 현지화 및 번역 이후 특히 중요합니다.

결론적으로 우리는 소설과 홍보를 제시ATF4의 검출 및 포유 동물의 뇌의 성인 축삭에 잠재적으로 다른 많은 mRNA를위한 기술을 omising. RNAscope는 mRNA의 현지화에 미래 연구를 촉진하고 생체 내에서 로컬 번역의 생물학적 중요성을 해명하는 데 도움이 될 것입니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) Advanced Cell Diagnostics - probe
custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) Advanced Cell Diagnostics - probe
negative control probe-DapB Advanced Cell Diagnostics 310043 probe
positive control probe-mouse Polr2A (optional) Advanced Cell Diagnostics 312471 probe
positive control probe-human PPIB (optional) Advanced Cell Diagnostics 313901 probe
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) Advanced Cell Diagnostics 320850 in situ hybridization kit
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) Advanced Cell Diagnostics 310035 in situ hybridization kit
Goat polyclonal anti-ChAT antibody Millipore AB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit American MasterTech KTLFB
Clearify clearing agent (xylene substitute) American MasterTech CACLEGAL
ProLong Gold mounting  medium with DAPI Life Technologies P36935
DPX mounting medium Sigma 6522

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References

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Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C.,… More

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (100), e52799, doi:10.3791/52799 (2015).

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