Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52799
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

Abstract

mRNAs לעתים קרובות מקומי לאקסונים חוליות והתרגום המקומי שלהם נדרש לpathfinding האקסון או הסתעפות בפיתוח ותחזוקה, תיקון או ניוון של מערכת עצבים בתקופות postdevelopmental. ניתוחי תפוקה גבוהים חשפו לאחרונה כי יש לי האקסונים transcriptome יותר דינמית ומורכבת יותר מהצפוי בעבר. ניתוח אלה, עם זאת כבר נעשה בעיקר בנוירונים בתרבית שבו ניתן לבודד האקסונים מתאי somato-הדנדריטים. זה כמעט בלתי אפשרי להשיג בידוד כזה ברקמות שלמות in vivo. לפיכך, על מנת לאמת את הגיוס של mRNAs ורלוונטי הפונקציונלי שלהם בכל בעלי חיים, צריכים להיות משולבים באופן אידיאלי ניתוחי transcriptome עם טכניקות המאפשרות ההדמיה של mRNAs באתר. לאחרונה, טכנולוגיות ISH רומן המזהות RNAs ברמת מולקולה בודדת פותחו. זה חשוב במיוחד בעת ניתוח לוקליזציה subcellular של mRNA, RNAs המקומי מאז נמצא בדרך כלל ברמות נמוכות. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים לצורך זיהוי של mRNAs axonally-מקומי באמצעות טכנולוגית RNA ISH רומן רגישה. יש לנו שילוב RNAscope ISH עם counterstain axonal באמצעות אימונוהיסטוכימיה הקרינה או צבעים היסטולוגית כדי לאמת את הגיוס של Atf4 mRNA לאקסונים in vivo בעכבר הבוגר והמוח אנושי.

Introduction

גיוס mRNA axonal ותרגום מקומי לאפשר האקסונים להגיב לגירויים תאיים באופן 1 באופן זמני ומרחבית חריפה. סינתזת חלבון תוך-axonal היא הדרך הטובה ביותר להבין בהקשר של התפתחות המוח שבו משחק תפקידים מכריעים בצמיחה חרוט התנהגות 2-8, האקסון מפלס-הדרך 9-11 ומדרדר איתות 12,13. אבל הרבה פחות ידוע על המשמעות התפקודית של סינתזת חלבון axonal בתאי עצב פוסט-התפתחותית כאשר רמות ה- mRNA והריבוזום axonal מופחתות 14,15 מאוד. האקסונים חוליות בוגרים כבר מזמן חשבו להיות translationally פעיל 16. עם זאת, המחקרים אחרונים מצביעים על כך שהתרגום מקומי מחדש באקסונים בוגרים תחת מצבים פתולוגיים. לדוגמא, קבוצת משנה של mRNAs מגויס לאקסונים התחדשות הבאה פגיעה עצבית וסינתזה של חלבונים תוך-axonal נדרשים להתחדשות הנכונה של אקסונים אלה 17. בנוסף, חה הקבוצה שלנוים הוכיח כי mRNAs הספציפי מגויסים לאקסונים לאחר חשיפה מקומית לפפטיד מחלת אלצהיימר Aβ 1-42, ותרגום המקומי של ATF4 גורם השעתוק נדרשת כדי להפיץ את השפעות ניווניות של Aβ 1-42 מן האקסונים לסומה העצבית 18. לבסוף, ניתוחי תפוקה גבוהים גילו כי יש לי האקסונים בוגרים transcriptome יותר מורכבת ודינמית מהצפוי 18-21, במיוחד בתנאים פתולוגיים. לאור המחקרים הללו, שיטה רגישה וספציפית מאוד כדי לזהות mRNAs axonally מקומי במערכת העצבים הבוגרת יש צורך.

חלק גדול מהעבודה על גיוס mRNA ותרגום מקומי באקסונים בוגרים שבוצע על נוירונים בתרבית. זה נכון במיוחד עבור transcriptome ניתוחים מאז שיטות culturing מיוחדות קיימות המאפשרות הבידוד של אקסונים מהתא הדנדריטי somato-18-20. למרות שמחקרים כאלה ניתנו תוספות יקרותight לתוך התפקיד של תרגום המקומי באקסונים בוגרים, השאלה אם נוירונים בתרבית מייצגים נאמנה את המצב בvivo או אם גיוס mRNA הוא תגובה אדפטיבית של אקסונים לתנאי culturing עדיין פתוח. מחקרים מעטים סיפקו ראיות לגיוס mRNA להבשיל האקסונים in vivo. לדוגמא, תמליל קידוד לחלבון סמן חוש הריח זוהה באקסונים בתאי עצב תחושתיים מבוגרים 22. Transgene המכיל 'UTR 3 של mRNA β-אקטין מועבר לאקסונים בתאי עצב במערכת עצבים היקפיים ומרכזיים בעכברים ומתורגם באופן מקומי לאחר תקופות התפתחותיות 23. B2 Lamin mRNA הוא מקומי לאקסונים רשתית בXenopues laevis ראשנים ודלדולה משפיע תחזוקת האקסון לאחר פיתוח axonal 21. הפרעה לתחבורה axonal של קידוד mRNA לIV מונואמין ציטוכרום C משנה עכבר התנהגות 24. לבסוף, Atf4 mRNA נמצא במבוגריםxons של עכברים ומוח אנושי בהקשר של Aβ 1-42 -induced ניוון מוחיים 18.

ניתוחי transcriptome תפוקה גבוהה הוכיחו להיות שימושי כדי לזהות פרופילי mRNA באקסונים מבודדים במבחנה אבל יש מגבלות במחקרי vivo מאז בכל רקמות האקסונים לא נמצאים בבידוד, אבל התערבבו עם גופים עצביים תא, תאי גלייה וסוגי תאים אחרים. לפיכך, ניתוח כזה צריך להיות משולב עם טכניקות הדמיה שלאשר את לוקליזציה subcellular של mRNAs. RNA הכלאה באתר (RNA ISH) מאפשר זיהוי והדמיה של רצפי RNA ספציפיים בתאים וברקמות. עם זאת, מבחני RNA ISH המקוריים היו מתאימים רק לזיהוי RNAs הנרחב ביותר 25, שהוא לעתים רחוקות במקרה של mRNAs המקומי axonally. לעשורים האחרונים גוברים מאמצים כבר הכניס לתוך טכנולוגיות חדישות פיתוח המאפשרות זיהוי של mRNAs ברמת המולקולה בודדת 27). ההבדל העיקרי בין השיטות שהוזכרו לעיל ואחד כאן תאר הוא שמאוחר יותר משתמש 20 Z-מבנה כפול (לא ליניארי) בדיקות, כי בדרך כלל היעד ~ אזור KB 1 של ה- RNA של הספציפיות הבטחת ריבית ורמות רקע נמוכות. אז בדיקות הם הכלאה עם רצפי מגבר קדם מגבר שסופו של דבר כותרת או מצומדות עם אנזימים המאפשרים תגובות chromogenic fluorescently. צעדי הגברה אלה משפרים את יחס אות לרעש בהשוואה לטכנולוגיות אחרות ISH 28. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים באמצעות RNAscope בשילוב גם עם immunocytochemistry הקרינה או עם צבעים היסטולוגית מאפשרים counterstaining axonal. שני הפרוטוקולים מתאימים לדמיין לוקליזציה axonal של Atf4 mRNA במו הבוגרלהשתמש ומוח אנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נהלי כל החיה אושרו על ידי IACUC של אוניברסיטת קולומביה והנחיות החלים על הטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה היו במעקב. הערה: הכן את כל המאגרים המשמשים לנוהלי ISH במי RNase בחינם או DEPC שטופל. המלצה זו היא לא ממש הכרחית לאחר ISH הושלם אבל הוא הציע לי מאגרים עדיין מוכנים במים מזוקקים כפולים autoclaved ו / או עיקור על ידי סינון.

1. איתור של Atf4 mRNA מקומי לכולינרגית האקסונים בקרינה באמצעות מבוגרי עכבר המוח באתרו הכלאה (דגים) ואחריו אימונוהיסטוכימיה

  1. לדוגמא הכנה לפרוסות מוח קפוא-קבוע paraformaldehyde
    1. לדוגמא הבאה, להכין פרוסות ממוח עכבר קפוא קבוע.
      1. בקצרה, להקריב את העכברים 9 חודשים ישנים על ידי הרדמה עם קטמין (100 קילוגרם מ"ג -1 משקל גוף) ו xylazine (10 קילוגרם מ"ג -1 weig גוףHT) ואחריו עירוי transcardial של paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS (pH 7.4).
      2. הסר את המוח ולאחר תיקון-paraformaldehyde 4% למשך 24 שעות ב 4 o C.
      3. לאחר קיבוע, לשטוף דגימות שלוש פעמים PBS וcryoprotect בסוכרוז 30% ב- PBS (pH 7.4) במשך 24 שעות ב 4 o C.
      4. מוח שבץ ב אוקטובר הקפאת מתחם, סדרתי סעיף 20 מיקרומטר על cryostat והר בשקופיות מיקרוסקופ טופלו פולי-D ליזין. שמור פרוסות מוח ב -20 מעלות צלסיוס עד לשימוש.
    2. הסר פרוסות מוח-קבוע paraformaldehyde מהמקפיא ואוויר יבש למשך 30 דקות ב RT.
    3. לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
    4. במנדף, מוח מחדש לתקן משסף את 20 דקות עם paraformaldehyde 4% ב RT.
      הערה: זהירות: paraformaldehyde 4% הוא רעיל ויש לטפל בם והושלך כראוי הבאה פרוטוקולי בטיחות.
    5. לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
    6. ליבש פרוסות מוח.
      1. הכן 50%, 75% ו -100%פתרונות אתנול.
      2. לטבול את השקופיות ב 50% אתנול למשך 5 דקות על RT.
      3. לטבול את השקופיות באתנול 75% במשך 5 דקות על RT.
      4. לטבול את שקופיות אתנול 100% במשך 5 דקות על RT.
      5. לטבול את השקופיות באתנול 100% טריים במשך 5 דקות על RT. הערה: לחלופין, ניתן לאחסן שקופיות באתנול 100% ב -20 מעלות צלזיוס עד 1 בחודש.
  2. assay דגים ואחרי אימונוהיסטוכימיה באמצעות אנטיגן / הסרת מסכות RNA מושרה חום
    1. לפני שמתחיל להכין את כל החומר הנדרש:
      1. מחממים את תנור הכלאה עד 40 מעלות צלזיוס ולמקם את מגש המכיל מים מזוקקים בתנור כדי ליצור סביבת humidified.
      2. קח קופסא שקופיות ולמקם את מגבות נייר ספוגות במים מזוקקים בתוך כדי ללחלח את תיבת השקופיות. מניחים את תיבת השקופיות בתנור ההכלאה.
      3. הסר בדיקות (שתי בדיקות שליליות ויעד) מהמקרר ולחמם אותם בתנור ההכלאה במשך 10 דקות. בואו הבדיקות לקרר דאוn ב RT.
      4. לאזן ריאגנטים ההגברה AMP 1-4 (כלולים בערכת פלורסנט Multiplex מגיב) ב RT.
      5. הכן פתרון אחזור אנטיגן: ציטראט 10 מ"מ נתרן (pH 6), Tween 0.05% 20. הערה: פתרון יכול להיות מאוחסן בRT ללא הגבלת זמן ומשומשות לצביעת עתיד.
      6. הכן לשטוף חיץ 1x דילול פתרון 50x המניות (הכלול בערכת פלורסנט Multiplex מגיב) במי RNase בחינם או DEPC שטופל.
        הערה: לשטוף חיץ 1x ניתן לאחסן על RT עבור 1 חודש ומשומשות לצביעת עתיד. חיץ לשטוף 50x עשוי לזרז. אם כן, חיץ לשטוף חום 50x בC o 40 במשך 10 דקות לפני הכנת הפתרון 1x.
    2. הסר שקופיות מאתנול 100% ואוויר יבש במשך 5 דקות על RT.
    3. הכן צנצנת coplin המכילה 50 מיליליטר של תמיסה אחזור אנטיגן. לטבול את השקופיות בפתרון אחזור אנטיגן ולהרתיח אותם במשך 10 דקות במיקרוגל.
      הערה: לחלופין מקום מחליקה אופקית ב100 מ"מצלחת בקוטר סיבוב של זכוכית המכילה פתרון אחזור 100 מיליליטר.
      1. למלא את כוס 1 ליטר עם מים מזוקקים ולמקם אותו במיקרוגל.
        הערה: המים "חיץ" החום בעת ביצוע הסרת מסכות.
      2. מניחים את השקופיות בפתרון אחזור אנטיגן בתוך המיקרוגל. רתיחה מחליקה במתח גבוה במשך 5 דקות. מייד לאחר הדגימות הפסיקו רותחת, חום מחליק שוב בעצמה גבוהה למשך 5 דקות נוספות.
      3. להתקרר שקופיות ב RT.
        הערה: שלב קריטי: משך רותח והליך צריך להיקבע על ידי משתמש, בהתאם למאפייני המיקרוגל. מהר הרתיחה מתחילה גבוהה יותר הסיכויים של אידוי פתרון. במקרה זה מומלץ שהדגימות מבושלות לתקופות זמן קצרות יותר יותר מפעמיים כדי להשלים זמן הסרת מסכות כולל של 10 דקות. להיפך, אם חימום מתבצע בכוח בינוני או נמוך, הסרת מסכות יכולות להתבצע פעם אחת במשך 10 דקות. עם זאת, אם דגימות לא להרתיח continuously עבור הסכום כולל של כ 10 דקות, זה עלול לגרום להסרת מסכות חלקיות של שני RNA היעד והחלבון כדי להתגלות.
    4. לשטוף שקופיות שלוש פעמים עם 1X PBS.
    5. להוסיף 2-3 טיפות (~ 100 μl) של חללית dapB מוגדרת פרוסות המוח אלה המשמשים להערכת מכתים רקע. הערה: סט הבדיקה dapB מטרות גן חיידקים ולא צריך להכיר כל RNA יונקים.
    6. להוסיף 2-3 טיפות של חללית המיקוד מוגדרת פרוסות המוח אלה משמשים לאיתור RNA של עניין. הערה: סט בדיקה מיקוד שאריות 20 - 1,381 של העכבר Atf4 mRNA משמש בדוגמא זו.
    7. שקופיות כיסוי עם parafilm כדי למנוע אידוי בדיקה, למקם אותם בתיבת שקופיות humidified בתוך תנור הכלאת דגירה אותם ב 40 מעלות צלסיוס במשך 2 שעות.
      הערה: אופציונלית: יכולות להיות הכלאה פרוסות מוח נוספת עם סט בדיקה מיקוד העכבר Polr2A ומשמשות כביקורת חיובית.
    8. לשטוף SLIdes פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    9. להוסיף 2-3 טיפות של AMP מגיב הגברה 1-פלורידה לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
    10. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    11. להוסיף 2-3 טיפות של AMP מגיב הגברה 2-פלורידה לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
    12. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    13. להוסיף 2-3 טיפות של AMP מגיב הגברה 3-פלורידה לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
    14. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    15. להוסיף 2-3 טיפות של AMP מגיב הגברה 4 FL-לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבה ושקופיות לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
    16. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ 1x לשטוף עבור 2 דקות ב RT ופעמים עם 1X PBS.
    17. להוסיף 100-200 μl (או נפח מספיק כדי לכסות את הפרוסות לגמרי) של פתרון חסימה המכילות 3 מ"ג / מיליליטר BSA, 100 מ"מ וגליצין 0.25% Triton X-100 ב PBS (pH 7.4) לשקופיות, לכסות אותם עם parafilm ו דגירה במשך 30 דקות ב RT.
    18. הוספת 100 - של הנוגדן אנטי-צ'אט בדילול מלא בפתרון חסימה (1/100) לשקופיות 200 μl, לכסות אותם עם parafilm ו דגירה של 2 ימים בשעה 4 מעלות צלסיוס ודא שפרוסות המוח לא יתייבשו. במידת הצורך, מחדש להחיל פתרון נוגדן אנטי-צ'אט לפרוסות מוח 24 שעות לאחר הדגירה.
    19. לשטוף שקופיות שלוש פעמים ב1x PBS במשך 5 דקות ב RT.
    20. הוספת 100 - של הנוגדנים משני Alexa מצומדות המתאימים 200 μl (. למשל, Alexa-594 חמורים נגד עז לדוגמא זו בפרט) לשקופיות, לכסות עם parafilm וincubאכלתי במשך שעה 1 ב RT.
    21. לשטוף שקופיות שלוש פעמים ב1x PBS במשך 5 דקות ב RT.
    22. לשטוף שקופיות פעם במים מזוקקים.
    23. הר שקופיות עם הרכבה בינונית המכיל DAPI.
    24. דמיינו פרוסות מוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. איתור של Atf4 mRNA מקומי לאקסונים בדוגמאות מוח אנושיים באמצעות Chromogenic באתרו הכלאה (CISH) ואחריו כחול מהיר Luxol וCresyl יולט counterstaining

  1. לדוגמא הכנה לדגימות מוח האנושי מוטבע פרפין-קבוע פורמלין
    1. פרוסות אופה בתנור יבש בC o 60 לשעה 1.
    2. פרוסות מוח Deparaffinize במנדף.
      הערה: זהירות: ריאגנטים הם רעילים ויש לטפל בם וזנוח פועלים בהתאם להנחיות האבטחה המתאימות
      1. לטבול את השקופיות בסולקו חלופי קסילן פעמיים במשך 10 דקות.
      2. לטבול את השקופיות ב 100% אתנול פעמיים דקות 1.
      3. פרוסות IR-יבש 5 דקות ב RT. הערה: לחלופין דגימות עשויות להיות מיובשים בRT O / N אבל יש להשתמש תוך 24 שעות.
  2. Diaminobenzidine (DAB) המבוסס assay ISH chromogenic אחרי כתם כחול וcresyl המהיר luxol הסגול באמצעות הסרת מסכות RNA מושרה חום ופרוטאז-induced
    1. לפני שמתחיל להכין את החומרים נדרשים:
      1. מחממים את תנור הכלאה עד 40 מעלות צלזיוס ולמקם את מגש המכיל מים מזוקקים כדי ליצור סביבת humidified.
      2. קח קופסא שקופיות ולמקם את מגבות נייר ספוגות במים מזוקקים בתוך כדי ללחלח את תיבת השקופיות. מניחים את תיבת השקופיות בתנור ההכלאה.
      3. הכן 1x Pretreat 2 על ידי דילול פתרון 10x המניות (כלולים בערכת CISH מגיב) במי RNase בחינם או DEPC שטופל. אם לפני הטיפול מתבצע על צלחת חמה, להוסיף לפתרון Pretreat 100 מיליליטר לצלחת זכוכית קוטר 100 מ"מ להגדיל את שטח המגע בין הצלחת והצלחת החמה (אם המקדיםמתבצע במיקרוגל, צנצנת coplin ניתן להשתמש במקום כמפורט ב1.2.3). פתרון לחום 100 המעלות צלסיוס ולשמור אותו רותח לא יותר מ 30 דקות לפני הצללה דגימות.
      4. בדיקות חום שליליות וחיוביות של 10 דקות ב -40 מעלות צלזיוס ולהתקרר בRT.
      5. לאזן ריאגנטים ההגברה AMP 1-6 (כלולים בערכת CISH מגיב) ב RT.
      6. הכן לשטוף חיץ 1x דילול פתרון 50x המניות (הכלול בערכת CISH מגיב) במים מזוקקים. הערה: 1x חיץ לשטוף יכול להיות מאוחסן על RT עבור 1 חודש ומשומשות לצביעת עתיד.
    2. להוסיף 4 טיפות ~ (~ 120 μl) של 1 Pretreat לכל פרוסה מוח, לכסות עם parafilm ולדגור על RT במשך 10 דקות.
    3. לשטוף 3 עד 5 פעמים במים מזוקקים טריים.
    4. לבצע הסרת מסכות מושרה בחום:
      1. העברת שקופיות חמות Pretreat 2 (כלולות בערכת CISH מגיב) ופתרון רתיחה במשך 15 דקות. הערה: ניתן לבצע רותחים על צלחת חמה הבטחהרתיחה רציפה או במיקרוגל הבא שצוינו ב1.2.3 שלבים קריטיים).
    5. מייד להעביר שקופיות למים מזוקקים ולשטוף 3 עד 5 פעמים.
    6. לשטוף שקופיות 3 עד 5 פעמים באתנול 100% טריים.
    7. פרוסות אוויר יבש 5 דקות ב RT. הערה: O לחלופין ניתן לייבש פרוסות / N.
    8. לבצע הסרת מסכות מושרה פרוטאז:
      1. הוסף 4 טיפות של Pretreat 3 (כלולים בערכת CISH מגיב), לכסות עם parafilm ו דגירה 30 דקות ב -40 מעלות צלזיוס בתנור ההכלאה.
    9. לשטוף שקופיות 3 עד 5 פעמים במים מזוקקים טריים.
    10. הוסף 4 טיפות של חללית dapB מוגדרת פרוסות המוח אלה המשמשים להערכת מכתים רקע.
    11. הוסף 4 טיפות של חללית המיקוד מוגדרת פרוסות המוח אלה משמשים לאיתור RNA של עניין.
      הערה: סט בדיקה מיקוד שאריות 15 - 1,256 של ATF4 mRNA האנושי משמשת בדוגמא זו. אופציונליות: פרוסות מוח נוספות יכולות להיות היבridized עם סט בדיקה מיקוד PPIB אדם ומשמש כביקורת חיובית.
    12. מניחים שקופיות בתיבת השקופיות ודגירה של 2 שעות. ב 40 מעלות צלסיוס בתנור ההכלאה.
    13. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    14. הוסף 4 טיפות של מגיב AMP 1 לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
    15. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    16. הוסף 4 טיפות של AMP 2 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
    17. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    18. הוסף 4 טיפות של AMP 3 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
    19. לשטוף שקופיות פעמיים עם 1x היהחיץ שעות למשך 2 דקות על RT.
    20. הוסף 4 טיפות של AMP 4 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
    21. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    22. הוסף 4 טיפות של AMP 5 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm ו דגירה 30 דקות ב RT.
    23. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    24. הוסף 4 טיפות של AMP 6 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm ו דגירה 15 דקות ב RT.
    25. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    26. לערבב נפח שווה של חום-1 וחום-2 ריאגנטים (כלול בערכת CISH מגיב), להוסיף ~ 120 μl של פתרון לכל פרוסה מוח, לכסות עם parafilm ו דגירה 10 דקות ב RT.
    27. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT ולשטוף פעם אחת במים מזוקקים.
      הערה: צעדים קריטיים: השלבים הבאים הם קריטיים ללהשיג counterstain axonal אופטימלי ללא מיסוך הנוכחות של גרגרי RNA.
    28. לפני ביצוע counterstain לבדוק הנוכחות של mRNA של עניין תחת מיקרוסקופ brightfield. להגדיר אזורי התייחסות בדגימות המוח שבו כדי לפקח על הנוכחות של puncta לאורך הליך counterstain.
    29. פתרון כחול מהיר luxol מחממים ב 60 מעלות צלסיוס
    30. מגלשות מקום בכחול מהיר luxol דגירה 30 דקות ב -60 מעלות צלסיוס
    31. יש לשטוף מספר פעמים במים מזוקקים.
    32. טובלים שקופיות כמה פעמים ב0.05% פתרון ליתיום קרבונט להתחיל בידול.
    33. טובלים שקופיות פעמיים באתנול 75% טריים.
    34. יש לשטוף במים מזוקקים.
    35. בדקו פרוסות מוח תחת מיקרוסקופ brightfield. שים לב שחומר אפור ולבן צריך להתחיל להיות גרגרים להבחין ו- RNA עדיין נראים כמו puncta הכחול כהה / שחור. ודא שהאקסונים יתחילו להופיע כסיבים תכלת.
    36. חזור על שלבים 2.2.28 ל2.2.32. Perforincubations מ 'עם פתרון מהיר luxol כחול ב10 - 20 צעדי דקות, ניטור counterstain ואת הנוכחות של גרגרי RNA בזהירות. הערה: בדרך כלל, counterstain האופטימלי נרכש ב60-90 דקות (סה"כ זמן דגירה), אך זמן יכול להתקצר אם הוא חשוד כי גרגרי RNA עשויים להיות רעול פנים על ידי הכתם הכחול המהיר luxol (ראה איור 2 דוגמאות).
    37. דגירה שקופיות בפתרון סגול cresyl במשך 10 דקות ב RT.
    38. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים.
    39. טובלים שקופיות 5 עד 10 פעמים באתנול 70%.
    40. ליבש פרוסות מוח באמצעות 3 שינויים מהירים של 100% אתנול.
    41. במנדף, פרוסות מוח ברורות על ידי דוגרים פעמיים בסולקו חלופי קסילן 2 דקות ופעם שלישית במשך 5 דקות על RT.
    42. פרוסות מוח ההר בהרכבה בינונית קבועה מבוסס קסילן.
    43. ניתוח דגימות תחת מיקרוסקופ brightfield.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סיכום קצר של ההליכים שתוארו לעיל מוצג באיור 1.

זיהוי אופטימלי של Atf4 mRNA גרגירים באקסונים כולינרגית באמצעות הסרת מסכות מושרה חום

כאשר הערכת לוקליזציה axonal של mRNAs, זה הוא קריטי כדי להיות מסוגל לזהות את האקסונים ולהיות מסוגל לדמיין RNAs שפע נמוך. טכנולוגית RNA ISH המתוארת כאן מאפשרת זיהוי של RNAs ברזולוציה מולקולה בודדת. פרוטוקולים סטנדרטיים באמצעות טכנולוגיה זו מציעים שילוב של שני הליכי הסרת מסכות כדי לזהות ביעילות RNAs היעד: והחום מושרה 28 הסרת מסכות מושרה פרוטאז. עם זאת, כאשר אני עורך בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה לזהות האקסונים, הסרת מסכות מושרה פרוטאז אולי לא לגרום לזיהוי אנטיגן האופטימלי 29.

בפרוטוקול הראשון המתואר כאן, עיכול פרוטאז נמנע, מאז הנוגדן משמש לא הצליח לזהות גacetyltransferase holine (צ'אט) נמצא בדרך כלל באקסונים של הרכס המשונן הנובע ממסלול septohippocampal (איור 2 א 'וב'), אם כי גרגרי mRNA חיוביים אותרו. אחזור עם חיץ 10 מ"מ ציטרט (pH 6) הנגרם על-חום, לעומת זאת, הבטיח את השלמות של epitope מוכר על ידי הנוגדן אנטי-הצ'אט ולמקד mRNA זוהה ביעילות באקסונים מוכתם צ'אט (איור 2C ו- D). התוצאות שהוצגו כאן (איור 2) להראות נוכחות Atf4 ברכס המשונן של עכברים בוגרים שבי mRNA גיוס ותרגום מקומיים הנגרמים על ידי עירוי של Aβ 1-42 oligomers להיפוקמפוס. העדויות קודמות מצביעות על כך שAtf4 mRNA לא זוהה באקסונים במבחנה או בvivo בתנאים בסיסיים 18, ובכך הפרדיגמה כגון ניסיונית אינה מוצגת.

זיהוי אופטימלי של ATF4גרגרי mRNA באקסונים בשתי הסרת המסכות מושרה החום ומושרה פרוטאז

ואילו התוצאות שתוארו לעיל עולה כי גילוי חלבון נוגדן המבוסס תואם טכנולוגית RNA ISH בעת ביצוע החום מושרה הסרת מסווה מעל זה לא יכול להיות שימושי אם נדרש פרוטאז מראש טיפול. סעיף 2 מתאר זיהוי של ATF4 mRNA בתוך אקסונים הבאים נהלים שפורסמו בעבר 28,30 בשילוב עם כתמים היסטולוגית משמשים בדרך כלל דגימות מוח 31,32.

שלב קריטי בהליך זה הוא counterstain האופטימלי של סיבי myelinated באמצעות כחול luxol מהיר (LFB) ללא מיסוך הנוכחות של גרגרי mRNA באקסונים מוכתמים על ידי CISH. חומרים כימיים המשמשים למטרה זו יאפשר counterstain האופטימלי עם LFB הבא פעמים דגירה של 60 עד 90 דקות. Counterstain עלול להיכשל כאשר בשתי הפעמים הטמפרטורה והדגירה הם ירדו (איור 3 א והבלעה, ומידע לא מוצג)ND למרות גרגרי mRNA עדיין יהיו גלויים, לא ניתן לאמת לוקליזציה axonal. מצד השני, דוגרים דגימות מוח למשך 60 דקות או יותר ב 60 מעלות צלסיוס ללא ניטור הנוכחות של גרגרים חיוביים מעת לעת עלול לגרום למיסוך בלתי הפיך של mRNA של ריבית על ידי הצבע (איור 3 והבלעה). הוא כך מומלץ שדגימות מודגרת בLFB למשך 30 דקות ושדגירה נוספת מתבצעת בשלבים בדיקת הדגימות כל 10 עד 20 דקות כדי להשיג צביעה אופטימלית של שני האקסונים וגרגרי RNA (איור 3D-F). בעקבות הנחיות אלה גרגרים חיוביים Atf4 ניתן להבחין בבירור בשתי שליטה (איור 3D) ודגימות מוח מחלה (איור 3F) אלצהיימר.

איור 1
עבודה באיור 1. תמציתישל RNA ISH אחרי counterstain axonal. השלבים מתוארים בשחור משותפים לשני ההליכים שהודגמו. הצעדים מודגשים בכחול ספציפיים לדגימות קבועות paraformaldehyde המוכתם על ידי ISH ניאון ואילו אלה מסומנים באדום הם ספציפיים לדוגמאות מוטבעים פרפין-קבוע פורמלין המוכתם על ידי ISH chromogenic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. דגים לAtf4 mRNA מקומיים לאקסונים כולינרגית ברכס המשונן של עכברים בוגרים. FISH בוצע באמצעות מושרה פרוטאז (L פנל העברה בנקאית) או מושרה בחום (פנל מימין) ואחריו הסרת מסכות זיהוי נוגדן של acetyltransferase כולין (צ'אט) . Antibody לא הצליחה לזהות צ'אט כאשר טיפול פרוטאז בוצע. דוגמאות לתוצאות שהושגו עם בדיקה מיקוד-עישון (dapB) ובדיקת -targeting Atf4 באמצעות הגדרות מיקרוסקופ והתאמות תמונה זהות מוצגות. גרגרי -positive Atf4 עם לוקליזציה axonal ברורה מסומנות בסימני שאלה ואילו גרגרים מקומיים מסומנים כ" בסדר ". 20μm בר סולם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. CISH לATF4 mRNA מקומי לאקסונים myelinated בהיווצרות בהיפוקמפוס האדם. בעקבות איש, האקסונים היו counterstained עם כחול המהיר luxol (LFB) וsomata העצבי counterstained עם סגול cresyl. צביעת LFB לא טובים עלולה לגרום אם שתי הטמפרטורה (והבלעה מייצגות דגימות מוכתמות בLFB ב 40 מעלות צלסיוס במשך 4 שעות.) וזמן דגירה (לא מוצג) הם ירדו, או כאשר counterstain אינו מסומן לאחר תקופות קצרות דגירה (B והבלעה ). דוגמאות לצביעת LFB אופטימלית בשילוב עם ISH באמצעות בדיקה מיקוד-עישון (dapB) או הבדיקה ATF4 -targeting מוצגות (CF וריבועים). רכישת תמונה הותאמה באופן אוטומטי לגרגרי -positive יחס אות לרעש. ATF4 הטובים ביותר עם ​​לוקליזציה axonal ברורה מסומנים בסימני שאלה ואילו גרגרים מקומיים מסומנים כעל "אישור". בר סולם 50 מיקרומטר, ריבועי 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדוח זה אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית ISH ברזולוציה גבוהה בזיהוי של mRNA Atf4 המקומי axonally. מחקרים שפורסמו אלה וקודמים הראו כי טכנולוגיה זו היא תואמת עם זיהוי חלבון מבוסס נוגדנים ברקמות או אפילו עובר כל 33. חשוב לציין, זה כבר היה בשימוש לאחרונה לגילוי Arc mRNA בתוך הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס 34. זה גם יכול להיות בשילוב עם צבעים היסטולוגית לצביעת רקמות. לבסוף, הוא מתאים לזיהוי בו זמני של מספר יעד RNAs 28,30,33. ממצאים אלו ממחישים את הרבגוניות של טכנולוגיות RNA ISH ברזולוציה גבוהה, ושינויים קלים בפרוטוקולים המקוריים לא להקטין את הרגישות של שיטה זו.

פרוטוקולים מקוריים המתארים את השימוש בבדיקות Z-מבנה כדי לזהות mRNAs של עניין ברקמות ברזולוציה מולקולה בודדת מציעים שני צעדים להסרת מסווה מעל mRNA מעורבעיכול פרוטאז ומדגם רותח 30,35. כאן אנו מראים כיצד הסרת מסווה מעל לרעה מושרה פרוטאז משפיע על זיהוי מבוסס נוגדנים המוצלחים של צ'אט באקסונים כולינרגית הנובעים ממסלול septo-היפוקמפוס (איור 2 א 'וב'). לפיכך, החלטנו שלא לכלול את הצעד הזה ולבצע הסרת מסכות מושרה חום רק אם counterstaining axonal כללו השימוש בנוגדנים. כפי שניתן לראות (איור 2C ו- D), האקסונים כולינרגית יכולים להיות דמיינו עם נוגדן אנטי-צ'אט וגרגרי Atf4 mRNA היו להבחין הימנעות עיכול פרוטאז. שים לב שזיהוי החיובי של Atf4 mRNA מבוסס על הקרינה הרקע המתקבלת מהבדיקה השלילית. שליטה נוספת ניתן לכלול בשלב על ידי טיפול דגימות מוח עם RNases וחיטוטם עם בדיקות העכבר Atf4 כדי לבדוק הסגוליות שלהם זה. צעד זה אך לא נכלל בהליכים שנדונו כאן מאזמופע קודם ראיות, באמצעות זה אותה טכנולוגיה, דלדול מוחלט של Atf4 mRNA באקסונים הבאים הזרקת siRNA בהיפוקמפוס העכבר 18. תוצאות כאלה להפגין את הספציפיות של בדיקות ISH משמשות כאן. השימוש בפקדים, למעט הבדיקות השליליות יש להעריך על סמך שאלות מדעיות מסוימות. לבסוף, אחזור מושרה חום עלול להיות תחליף ידי או בשילוב עם הסרת מסכות מושרה פרוטאז בהתאם לדרישות של הנוגדן המשמש לcounterstaining האקסון. הבחירה של שימוש באחד או הליך אחר או שילוב של שניהם צריכה להיקבע באופן אמפירי על ידי המשתמש.

בעת ביצוע protease- והסרת מסכות מושרה חום בדגימות מוח אנושיים, צבעים היסטולוגית יכולים להחליף counterstaining axonal מבוסס נוגדנים. אף על פי הפרוטוקול המקורי כאן אחרי מרמז על השימוש בhematoxylin לרקמה counterstaining 30, צבע כזה אינו מתאים לצביעת האקסון. לפיכך, luxol FASלא כחול שימש להכתים האקסונים myelinated וסגול cresyl שימש לדמיין גופי תא עצביים. LFB, שפותח על ידי Kluever ו -31 Barrera, נבחר על כתמים אחרים, כי זה יכול להסתיים בפחות משעה 2 ואם ההבחנה היא מותאמת (איור 3 ג-ו) את הכתם הכחול האור לא מפריע גרגרי mRNA המופיעים כהה כ נקודות חומות-שחורות. כפי שניתן לראות (איור 3), counterstaining LFB האופטימלי יכול להיות מושלם כאשר דוגרים דגימות בC o 60 ל60-90 דקות. עם זאת מומלצת שהדגירה מתבצעת בשלבים, כך שבידול יכול להיות במעקב צמוד וגרגרי mRNA הם תמיד נראים לעין. טכניקות היסטולוגית אחרות כגון האקסון של של Bielchowsky או Bodian תשואת צביעת כסף אפור-שחור מכתים 36 שייתכן שאינו תואם עם תגובת chromogenic מבוסס DAB בחרה בדוח זה. טכניקות צביעה סבירה, כזה צריך להיות משולבים עם מבחני RNA CISH המאפשר את השימוש בצבעים חלופיים כגון אדום או ירוק HRP 30 מהירים. בחירת השילוב המתאים של מבחני ISH RNA וכתמי axonal צריך להיקבע באופן אמפירי על ידי משתמש.

מגבלה אחת של ההליך הראשון המתואר בדוח זה היא גילוי החלבון לא מוצלח על ידי אימונוהיסטוכימיה אם עיכול פרוטאז מתבצע. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי הימנעות הסרת מסכות מושרה פרוטאז. במקרה המסוים של Atf4 axonally-מקומי ביצוע הסרת מסכות מושרה חום היה מספיק כדי לזהות גרגירי mRNA מעל רמות רקע באקסונים כולינרגית. אולם זה לא יכול להיות המקרה לmRNAs האחר של עניין ועיכול פרוטאז ייתכן שיידרש. אם כן, counterstaining axonal צריך להתבצע באמצעות נוגדנים אחרים מאשר הנוגדן אנטי-הצ'אט כאן תאר. לחלופין, counterstaining מבוסס נוגדנים עשוי להחליף בצבעים היסטולוגית כפי שתואר בסעיף 2 לפרוטוקול.

ss = "jove_content"> צביעת LFB של סיבים אינה מתאים להדמיה של האקסונים unmyelinated. טכניקות צביעה אלטרנטיביות, כגון Bielchowsky של או צביעת הכסף של Bodian, מאפשרות ההדמיה של שני האקסונים myelinated וunmyelinated. שני השיטות לגרום להכתמה אפורה-שחורה של אקסונים שאינה תואם לCISH DAB מאז גרגרי mRNA מופיעים puncta החום-שחור כ. עם זאת, יש צבעים אחרים זמינים עבור זיהוי של mRNAs של עניין תחת מיקרוסקופ brightfield, כגון אדום מהיר או HRP ירוק 30.

כאמור בסעיף הפרוטוקול, אחד השלבים הקריטיים של שני ההליכים הוא הסרת המסכות מושרה חום. אם רותח מתבצע במיקרוגל, יש סיכוי של אידוי פתרון בהתאם למאפיינים של המכשיר. בצע את השלבים המפורטים ב1.2.3 ו2.2.4 כדי למנוע אידוי פתרון. לקפוא רקמת 10 דקות קבועות של הסרת מסכות צריכה להספיק, ואילו עבור פרפין מוטבערקמות רותחים במשך 15 דקות מומלצת. אם דגימות לא להרתיח ברציפות במשך הזמן המומלץ זה עלול לגרום להסרת מסכות חלקיות. עם זאת פעמים מעט יכולות להשתנות אם התקנים אחרים, כגון סיר אורז או צלחת חמה נבחרים במקום מיקרוגל. משך רותח צריך להיקבע על ידי משתמש, בהתאם לשיטה.

עוד צעד קריטי הוא counterstaining LFB. חשובה שעוצמת הצבע הכחול לא מפריעה להדמיה של גרגרי mRNA. שינויים מסוימים לפרוטוקול המקורי 31 בוצעו על מנת להפחית את עוצמת הצבע, כגון הפחתת הטמפרטורה (איור 3 א) או זמן הדגירה (מידע לא מוצג), עם זאת, אנו לא הבחנו בבירור האקסונים myelinated בדגימות מוח אנושיים . מצד השני, דוגרים הדגימות בפתרון LFB בטמפרטורה הציעה (60 המעלות צלסיוס) הביא צביעה אופטימלית של אקסונים myelinated. זהעם זאת המליץ ​​counterstaining מתבצע בשלבים ניטור בזהירות את הנוכחות של גרגרי RNA בכל העת על מנת להבטיח שLFB לא להסוות את ה- mRNA של עניין כמפורט בצעדים 2.2.28-2.2.36.

לבסוף, דגימות לא צריכים להתייבש. השיטות שתוארו בדוח זה כרוך צעדי דגירה מרובים ב 40 o C, אשר מגדיל את הסיכויים של אידוי מגיב. כאמור בפרוטוקולים, דגימות צריכים להיות מכוסות בparafilm בכל הצעדים כדי למנוע אידוי.

לסיכום, הפיתוח של רזולוציה גבוהה RNA ISH ושיטות ISH אחרים המאפשר הדמיה של תמלילים נמוכים בשפע, כוללים אלה מקומיים לאקסונים מבוגרים in vivo. זה חשוב במיוחד מאז ללוקליזציה שנים רבות mRNA ולתרגום באקסונים מבוגרים מאוד היה להתעלם כפי שהם נחשבו translationally לא פעיל.

לסיכום אנו מציגים רומן ויחסי ציבורomising טכנולוגיה לזיהוי של Atf4 ופוטנציאל רב mRNAs האחר באקסונים מבוגרים של המוח היונקים. RNAscope יקל מחקרים עתידיים על לוקליזציה mRNA ויעזור לפענח את המשמעות הביולוגית של התרגום המקומי שלהם in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) Advanced Cell Diagnostics - probe
custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) Advanced Cell Diagnostics - probe
negative control probe-DapB Advanced Cell Diagnostics 310043 probe
positive control probe-mouse Polr2A (optional) Advanced Cell Diagnostics 312471 probe
positive control probe-human PPIB (optional) Advanced Cell Diagnostics 313901 probe
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) Advanced Cell Diagnostics 320850 in situ hybridization kit
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) Advanced Cell Diagnostics 310035 in situ hybridization kit
Goat polyclonal anti-ChAT antibody Millipore AB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit American MasterTech KTLFB
Clearify clearing agent (xylene substitute) American MasterTech CACLEGAL
ProLong Gold mounting  medium with DAPI Life Technologies P36935
DPX mounting medium Sigma 6522

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Tags

Neuroscience גיליון 100 לוקליזציה mRNA האקסונים, RNAscope, מוח בוגר
איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C.,… More

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (100), e52799, doi:10.3791/52799 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter