Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Påvisning af Axonally Lokaliseret mRNA i Brain Sektioner Brug High-Resolution Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52799
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

Abstract

mRNA ofte lokaliseret til hvirveldyr axoner og deres lokale oversættelse er nødvendig for axon stifinding eller forgrening under udvikling og for vedligeholdelse, reparation eller neurodegeneration i postdevelopmental perioder. Høje throughput analyser har for nylig afsløret, at axoner har en mere dynamisk og kompleks transkriptom end tidligere forventet. Disse analyser er imidlertid blevet det meste gjort i dyrkede neuroner, hvor axoner kan isoleres fra somatisk-dendritiske rum. Det er næsten umuligt at opnå en sådan isolation i hele væv in vivo. Således, for at verificere rekrutteringen af mRNA og deres funktionelle relevans i et helt dyr, transkriptom analyser bør ideelt kombineres med teknikker, der tillader visualisering af mRNA in situ. For nylig er hidtil ukendte ISH teknologier, der registrerer RNA'er på et enkeltstrenget molekyle niveau blevet udviklet. Dette er især vigtigt, når man analyserer den subcellulære lokalisering af mRNADa lokaliserede RNA'er findes typisk i lave niveauer. Her beskriver vi to protokoller til påvisning af axonally-lokaliserede mRNA'er under anvendelse af en hidtil ukendt ultrasensitiv RNA ISH-teknologi. Vi har kombineret RNAscope ISH med axonal modfarve anvendelse af fluorescens immunohistokemi eller histologiske farvestoffer til at verificere rekrutteringen af Atf4 mRNA til axoner in vivo i det modne murine og humane hjerner.

Introduction

Axonal mRNA rekruttering og lokalt oversættelse muliggøre axoner til at reagere på ekstracellulære stimuli i en tidsmæssigt og rumligt akut måde 1. Intra-axonal proteinsyntese forstås bedst i sammenhæng med nervesystemets udvikling hvor det spiller afgørende roller i vækst kegle adfærd 2-8, axon pathfinding 9-11 og retrograd signalering 12,13. Men langt mindre om den funktionelle betydning af axonal proteinsyntese i post-udviklingsmæssige neuroner når axonal mRNA og ribosom niveauer er stærkt reduceret 14,15. Modne hvirveldyr axoner har længe været anset for at være translatorisk inaktiv 16. Seneste undersøgelser viser dog, at den lokale oversættelse reaktiveret i modne axoner under patologiske tilstande. For eksempel er en delmængde af mRNA'er rekrutteret til regenererende axoner efter nervebeskadigelse og intra-axonal proteinsyntese er nødvendige til korrekt regenerering af disse axoner 17. Derudover vores gruppe has viste, at specifikke mRNA'er rekrutteres til axoner efter lokal eksponering for Alzheimers sygdom peptid Ap 1-42, og lokalt oversættelse af transkriptionsfaktoren ATF4 er påkrævet for at udbrede de neurodegenerative virkninger af Ap 1-42 fra axoner til den neuronale soma 18. Endelig har højt gennemløb analyser afslørede, at modne axoner har en mere kompleks og dynamisk transkriptom end forventet 18-21, især under patologiske tilstande. I lyset af disse undersøgelser, at en meget følsom og specifik metode registrerer axonally lokaliserede mRNA i voksne nervesystem er nødvendig.

Meget af arbejdet på mRNA rekruttering og lokalt oversættelse i modne axoner er blevet udført på dyrkede neuroner. Dette gælder især for transkriptom analyser siden specialiserede dyrkningsmetoder findes, der tillader isolering af axoner fra somato-dendritiske rum 18-20. Selv om sådanne undersøgelser har givet værdifulde insight ind i rollen som lokal oversættelse i modne axoner, hvorvidt dyrkede neuroner korrekt billede af den situation, in vivo, eller hvis mRNA rekruttering er en adaptiv reaktion axoner til dyrkningsbetingelser er stadig åben. Kun få studier har fremlagt dokumentation af mRNA rekruttering til modne axoner in vivo. For eksempel har transkriptet koder for det olfaktoriske markørprotein blevet detekteret i axoner hos voksne sensoriske neuroner 22. Et transgen indeholdende 3'UTR af β-actin-mRNA transporteres til axoner i perifere og centralnervesystemet neuroner i mus og er lokalt oversat efter udviklingsmæssige perioder 23. Lamin b2 mRNA er lokaliseret til retinale axoner i Xenopues laevis haletudser og udtynding påvirker Axon vedligeholdelse efter axonal udvikling 21. Interferens med axonal transport af mRNA koder for cytochrom C oxidase IV ændrer mus adfærd 24. Endelig Atf4 mRNA findes i voksen enXON'er af mus og humane hjerner i forbindelse med Ap 1-42-induceret neurodegeneration 18.

High throughput transkriptom analyser har vist sig at være nyttigt at identificere mRNA profiler i isolerede axoner in vitro, men har begrænsninger for in vivo-undersøgelser siden i hele væv axoner er aldrig fundet isoleret, men blandet med neuronale celle organer, gliaceller og andre celletyper. Således sådanne analyser skal kombineres med billeddannelsesteknikker, der bekræfter den subcellulære lokalisering af mRNA'er. RNA in situ hybridisering (RNA ISH) muliggør påvisning og visualisering af specifikke RNA-sekvenser i celler og væv. Men originale RNA ISH-assays var kun egnet til identifikation af stærkt rigelige RNA'er 25, hvilket sjældent er tilfældet for axonally lokaliserede mRNA. I de sidste årtier stigende indsats har været lagt i udviklingslandene nye teknologier, som gør påvisning af mRNA på enkelt-molekyle-niveau 27). Den væsentligste forskel mellem de ovenfor nævnte teknikker og den her beskrevne, er, at den senere bruger 20 dobbelt Z-struktur (ikke lineær) prober, der typisk er målrettet ~ 1 kb region af RNA'et af interesse at sikre specificitet og lave baggrundsniveauer. Prober hybridiseres derefter med forforstærker og forstærker sekvenser, der er endelig fluorescensmærkede eller konjugeret med enzymer, der tillader chromogene reaktioner. Disse amplifikationstrinnene forbedre signal-til-støj-forhold sammenlignet med andre teknologier ISH 28. Her beskriver vi to protokoller anvender RNAscope kombineret enten med fluorescens immuncytokemi eller histologiske farvestoffer tillader axonal kontrastfarvning. Begge protokoller er egnede til at visualisere axonal lokalisering af Atf4 mRNA i voksne mobruge og menneskelige hjerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af IACUC fra Columbia University og gældende retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr blev fulgt. Bemærk: Forbered alle buffere anvendt til ISH procedurer i RNase-fri eller DEPC-behandlet vand. Denne anbefaling er ikke strengt nødvendigt, efter ISH er afsluttet, men det foreslås, at buffere stadig er udarbejdet i autoklaveret double-destilleret vand og / eller steriliseres ved filtrering.

1. Påvisning af Atf4 mRNA Lokaliseret til kolinerge Axoner i Adult Mouse Brain hjælp fluorescens in situ hybridisering (FISH) Efterfulgt af Immunohistokemi

  1. Prøvefremstilling til paraformaldehyd-fikserede frosne hjerneskiver
    1. For det følgende eksempel forberede skiver fra faste frosne musehjerner.
      1. Kort fortalt ofre ni måneder gamle mus ved anæstesi med ketamin (100 mg kg -1 kropsvægt) og xylazin (10 mg kg -1 krop Weight) efterfulgt af transcardial infusion af 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,4).
      2. Fjern hjerner og post-fix i 4% paraformaldehyd i 24 timer ved 4 ° C.
      3. Efter fiksering vaskes prøverne tre gange i PBS og cryoprotect i 30% saccharose i PBS (pH 7,4) i 24 timer ved 4 ° C.
      4. Integrer hjerner i oktober frysning sammensatte, serielt sektion ved 20 pm på en kryostat og montere på poly-D-lysin behandlet objektglas. Holde hjernen skiver ved -20 ° C indtil anvendelse.
    2. Fjerne paraformaldehyd-fikserede hjerneskiver fra fryseren og lufttørre i 30 minutter ved stuetemperatur.
    3. Vask tre gange med 1 x PBS.
    4. I et stinkskab, re-fix hjerneskiver 20 min med 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: ADVARSEL: 4% paraformaldehyd er giftigt og skal håndteres og kasseres korrekt efter sikkerhed protokoller.
    5. Vask tre gange med 1 x PBS.
    6. Dehydrere hjernen skiver.
      1. Forbered 50%, 75% og 100%ethanolopløsninger.
      2. Fordybe objektglassene i 50% ethanol i 5 minutter ved stuetemperatur.
      3. Fordybe objektglassene i 75% ethanol i 5 minutter ved stuetemperatur.
      4. Fordybe objektglassene i 100% ethanol i 5 minutter ved stuetemperatur.
      5. Fordybe objektglassene i frisk 100% ethanol i 5 minutter ved stuetemperatur. Bemærkning: Alternativt kan objektglas opbevares i 100% ethanol ved -20 ° C op til 1 måned.
  2. FISH-assayet efterfulgt af immunhistokemi under anvendelse af varme-induceret antigen / RNA demaskering
    1. Før du starter forberede alle nødvendige materiale:
      1. Varm hybridisering ovnen til 40 ° C og placere en bakke indeholdende destilleret vand i ovnen for at skabe et fugtigt miljø.
      2. Tag et dias kasse og placere papirservietter gennemvædet i destilleret vand inde til at befugte slide kassen. Placer slide boks i hybridiseringsovn.
      3. Fjern prober (både negative og target prober) fra køleskab og opvarme dem i hybridisering ovn i 10 min. Lad sonderne afkøle down ved stuetemperatur.
      4. Ækvilibrer amplifikationsreagenser AMP 1-4 (inkluderet i Fluorescent Multiplex Reagent Kit) ved stuetemperatur.
      5. Forbered antigengenfinding opløsning: 10 mM natriumcitrat (pH 6), 0,05% Tween 20. Bemærk: Opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur i det uendelige og anvendes til senere farvning.
      6. Forbered 1X vaskebuffer fortynde 50x stamopløsningen (inkluderet i Fluorescent Multiplex Reagent Kit) i RNase-frit eller DEPC-behandlet vand.
        BEMÆRK: 1X vaskebuffer kan opbevares ved stuetemperatur i 1 måned og anvendes til senere farvning. 50x vaskebuffer kan udfældes. Hvis ja, varme 50x vaskebuffer ved 40 ° C i 10 minutter, inden den 1x opløsning.
    2. Fjern slides fra 100% ethanol og lufttørre i 5 minutter ved stuetemperatur.
    3. Forbered en Coplin-skål, der indeholder 50 ml antigen hentning løsning. Fordyb dias i antigen hentning løsning, og kog dem i 10 minutter i en mikrobølgeovn.
      BEMÆRK: Alternativt sted glider vandret i en 100 mmdiameter runde glasskål indeholdende 100 ml hentning opløsning.
      1. Fylde en 1 L bægerglas med destilleret vand og læg den i mikrobølgeovnen.
        BEMÆRK: Vandet vil "buffer" varmen, når du udfører demaskering.
      2. Objektglassene anbringes i antigengenfinding opløsning inde i mikrobølgeovn. Kog glider ved høj effekt i 5 min. Umiddelbart efter prøverne er holdt op med kogende, glider varmen igen ved høj effekt for ekstra 5 min.
      3. Køl ned dias ved RT.
        BEMÆRK: KRITISK STEP: kogende varighed og procedure bør bestemmes af brugeren, afhængigt af mikrobølge karakteristika. Jo hurtigere kogningen begynder jo større er chancerne for opløsning fordampning. Anbefales det i dette tilfælde, at prøverne kogt i kortere perioder flere end to gange for at fuldføre en total demaskering tid på 10 min. Tværtimod, hvis opvarmning udføres ved medium eller lav effekt, demaskering kan udføres én gang i 10 min. Men hvis prøverne ikke koge continuously for i alt ca. 10 minutter, kan dette resultere i en delvis afmaskering af både mål-RNA og protein, der skal detekteres.
    4. Wash slides tre gange med 1x PBS.
    5. Læg 2 - 3 dråber (~ 100 pi) i dapB probe sat til disse hjerneskiver anvendes til at vurdere baggrundsfarvning. Bemærk: dapB sonde sæt er rettet mod et bakterielt gen og bør ikke anerkende nogen pattedyr RNA.
    6. Læg 2 - 3 dråber af målretning probe sat til disse hjerneskiver anvendes til påvisning af RNA af interesse. Bemærk: en sonde sæt målretning resterne 20 - 1.381 af muse Atf4 mRNA anvendes i dette eksempel.
    7. Dækslides med parafilm at undgå probe fordampning, placere dem i befugtet slide boksen inde hybridiseringen ovnen og inkubere dem ved 40 ° C i 2 timer.
      BEMÆRK: EKSTRA: ekstra hjernen skiver kan hybridiseret med en probe sæt målrettet mus Polr2A og anvendes som positive kontroller.
    8. Wash SLIdes to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    9. Læg 2 - 3 dråber amplifikationsreagens AMP 1-FL til hver hjerne skive, dækslides med parafilm, placere dem i slæden boksen og inkuberes ved 40 ° C i 30 minutter i hybridiserings- ovnen.
    10. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    11. Læg 2 - 3 dråber amplifikationsreagens AMP 2-FL til hver hjerne skive, dækslides med parafilm, placere dem i slæden boksen og inkuberes ved 40 ° C i 15 min i hybridiseringsovn.
    12. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    13. Læg 2 - 3 dråber amplifikationsreagens AMP 3-FL til hver hjerne skive, dækslides med parafilm, placere dem i slæden boksen og inkuberes ved 40 ° C i 30 minutter i hybridiserings- ovnen.
    14. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    15. Tilføj 2 - 3 dråber amplifikationsreagens AMP 4-FL til hver hjerne skive, dækker dias med parafilm, placere dem islide box og inkuberes ved 40 ° C i 15 min i hybridiseringsovn.
    16. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur og to gange med 1 x PBS.
    17. Tilføj 100-200 pi (eller nok volumen til helt at dække skiver) af en blokeringsopløsning indeholdende 3 mg / ml BSA, 100 mM glycin og 0,25% Triton X-100 i PBS (pH 7,4) til objektglassene, dække dem med parafilm og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
    18. Tilføj 100-200 pi anti-ChAT antistof fortyndet i blokeringsopløsning (1/100) til objektglassene, dække dem med parafilm og inkuber i 2 dage ved 4 ° C. Sørg for, at hjernen skiver ikke tørre ud. Hvis det er nødvendigt, re-anvende anti-ChAT antistof løsning på hjernen skiver 24 timer efter inkubation.
    19. Wash slides tre gange i 1x PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
    20. Tilføj 100-200 ul af den relevante Alexa-konjugeret sekundært antistof (. F.eks Alexa-594 æsel anti-ged til dette særlige eksempel) til dias, dække med parafilm og incubspiste i 1 time ved stuetemperatur.
    21. Wash slides tre gange i 1x PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
    22. Vask glider en gang med destilleret vand.
    23. Mount glider med DAPI-holdige monteringsmedium.
    24. Visualisere hjerneskiver under et fluorescensmikroskop.

2. Påvisning af Atf4 mRNA lokaliseret til Axoner i Human Brain Prøver hjælp Chromogenic in situ hybridisering (CISH) Efterfulgt af Luxol Fast Blue og cresylviolet kontrastfarvning

  1. Prøvefremstilling til formalin-fikserede paraffin-indlejrede humane hjerneprøver
    1. Bag skiver i en tør ovn ved 60 ° C i 1 time.
    2. Afparaffiniser hjerneskiver i et stinkskab.
      BEMÆRK: ADVARSEL: reagenser er giftige og skal håndteres og kasseres efter de relevante retningslinjer sikkerhedsmæssige
      1. Fordybe objektglassene i xylen alternativ klaringsmiddel to gange i 10 min.
      2. Fordyb dias i 100% ethanol to gange i 1 min.
      3. EnIR-tørre skiver 5 minutter ved stuetemperatur. Bemærkning: Alternativt prøver kan blive tørret ved RT O / N, men skal bruges inden for 24 timer.
  2. Diaminobenzidin (DAB) -baseret kromogent ISH assay efterfulgt af Luxol hurtig blå og cresylviolet pletten med varmeinduceret og protease-induceret RNA demaskering
    1. Før du starter forberede nødvendige materialer:
      1. Varm hybridisering ovnen til 40 ° C og placere en bakke indeholdende destilleret vand for at skabe et fugtigt miljø.
      2. Tag et dias kasse og placere papirservietter gennemvædet i destilleret vand inde til at befugte slide kassen. Placer slide boks i hybridiseringsovn.
      3. Forbered 1x forbehandle 2 ved at fortynde 10x stamopløsningen (inkluderet i CISH Reagent Kit) i RNase-frit eller DEPC-behandlet vand. Hvis forbehandling udføres på en varmeplade, tilsættes 100 ml forbehandle opløsningen til en 100 mm diameter glasskål at forøge kontaktfladen mellem skålen og den varme plade (hvis forbehandlingudføres i en mikrobølgeovn, kan en Coplin-skål anvendes i stedet som angivet i 1.2.3). Heat løsning til 100 ° C og holde det kogende ikke længere end 30 min før nedsænkning prøver.
      4. Heat negative og positive sonder 10 min ved 40 ° C og køle ned ved RT.
      5. Ækvilibrer amplifikationsreagenser AMP 1-6 (inkluderet i CISH Reagent Kit) ved stuetemperatur.
      6. Forbered 1X vaskebuffer fortynde 50x stamopløsningen (inkluderet i CISH Reagent Kit) i destilleret vand. Bemærk: 1x vaskebuffer kan opbevares ved stuetemperatur i 1 måned og anvendes til senere farvning.
    2. Tilføj ~ 4 dråber (~ 120 pi) af forbehandle 1 til hver hjerne skive, dække med parafilm og inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
    3. Vask 3 til 5 gange i frisk destilleret vand.
    4. Udføre varmeinduceret demaskering:
      1. Overfør dias til hot forbehandle 2 (inkluderet i CISH Reagent Kit) løsning og kog i 15 min. Bemærk: Boiling kan udføres på en varmeplade sikrerkontinuerlig kogning eller i en mikrobølgeovn efter kritiske trin specificeret i 1.2.3).
    5. Umiddelbart overføre dias til destilleret vand og vask 3 til 5 gange.
    6. Wash slides 3 til 5 gange i frisk 100% ethanol.
    7. Lufttørre skiver 5 minutter ved stuetemperatur. Bemærk: Alternativt skiver kan tørres O / N.
    8. Udføre protease-induceret demaskering:
      1. Tilsæt 4 dråber forbehandle 3 (inkluderet i CISH Reagent Kit), dække med parafilm og inkuber 30 minutter ved 40 ° C i hybridiseringsovn.
    9. Wash slides 3 til 5 gange i frisk destilleret vand.
    10. Tilsæt 4 dråber af dapB probe sat til disse hjerneskiver anvendes til at vurdere baggrundsfarvning.
    11. Tilsæt 4 dråber af den målsøgende probe sat til disse hjerneskiver anvendes til påvisning af RNA af interesse.
      BEMÆRK: En probe sæt målretning resterne 15 - 1.256 af det humane ATF4 mRNA anvendes i dette eksempel. EKSTRA: ekstra hjernen skiver kan være hybridized med en sonde sæt målrettet human PPIB og anvendt som positive kontroller.
    12. Anbring objektglassene i slæden boksen og der inkuberes i 2 timer. ved 40 ° C i hybridiseringsovn.
    13. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    14. Tilsæt 4 dråber AMP 1 reagens til hver hjerne skive, dækker lysbilleder med parafilm, placere dem i slæden boksen og inkuberes ved 40 ° C i 30 minutter i hybridiserings- ovnen.
    15. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    16. Tilsæt 4 dråber AMP 2 reagens til hver hjerne skive, dækker lysbilleder med parafilm, placere dem i slæden boksen og inkuberes ved 40 ° C i 15 min i hybridiseringsovn.
    17. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    18. Tilsæt 4 dråber AMP 3 reagens til hver hjerne skive, dækker lysbilleder med parafilm, placere dem i slæden boksen og inkuberes ved 40 ° C i 30 minutter i hybridiserings- ovnen.
    19. Vask glider to gange med 1x varh puffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    20. Tilsæt 4 dråber AMP 4 reagens til hver hjerne skive, dækker lysbilleder med parafilm, placere dem i slæden boksen og inkuberes ved 40 ° C i 15 min i hybridiseringsovn.
    21. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    22. Tilsæt 4 dråber AMP 5 reagens til hver hjerne skive, dækker dias med parafilm og inkuber 30 minutter ved stuetemperatur.
    23. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    24. Tilsæt 4 dråber AMP 6 reagens til hver hjerne skive, dækker dias med parafilm og inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur.
    25. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
    26. Bland lige volumen af ​​BROWN-1 og BROWN-2 reagenser (inkluderet i CISH Reagent Kit), tilsæt ~ 120 ul opløsning til hver hjerne skive, dække med parafilm og inkuberes 10 minutter ved stuetemperatur.
    27. Vask glider to gange med 1X vaskebuffer i 2 min ved stuetemperatur og skylles en gang i destilleret vand.
      BEMÆRK: kritiske trin: de følgende trin er afgørende foropnå en optimal axonal modfarve uden maskering af forekomsten af ​​RNA-granulat.
    28. Inden du udfører kontrastfarve kontrol af tilstedeværelse af mRNA af interesse under et brightfield mikroskop. Definer referenceområder i hjernen prøver til at overvåge forekomsten af ​​puncta hele kontrastfarve procedure.
    29. Forvarm Luxol hurtigt blå opløsning ved 60 ° C.
    30. Placer slides i Luxol hurtigt blåt og inkuberes 30 min ved 60 ° C.
    31. Skyl flere gange i destilleret vand.
    32. Dip glider flere gange i 0,05% lithiumcarbonat løsning til at starte differentiering.
    33. Dip glider to gange i frisk 75% ethanol.
    34. Skyl i destilleret vand.
    35. Check hjerneskiver under et lysfelt mikroskop. Bemærk, at grå og hvid substans bør begynde at kunne skelnes og RNA granulat stadig synlige som mørkeblå / sort puncta. Kontroller, at axoner begynder optræder som lyseblå fibre.
    36. Gentag trin 2.2.28 til 2.2.32. Perform inkuberinger med Luxol hurtig blå opløsning i 10 - 20 min trin, omhyggeligt overvåge kontrastfarve og tilstedeværelsen af ​​RNA granulat. Bemærk: Typisk er optimal kontrastfarve erhvervet i 60-90 min (total inkubationstid) men tiden kan afkortes, hvis der er mistanke om, at RNA-granuler måske blive maskeret af Luxol hurtig blåsplint (se figur 2 for eksempler).
    37. Inkuber objektglassene i cresylviolet opløsningen i 10 minutter ved stuetemperatur.
    38. Skyl dias i destilleret vand.
    39. Dip glider 5 til 10 gange i 70% ethanol.
    40. Dehydrerer hjerneskiver gennem 3 hurtige ændringer i 100% ethanol.
    41. I et stinkskab, klare hjernen skiver ved inkubering to gange i xylen alternativ klaringsmiddel i 2 minutter og en tredje gang i 5 minutter ved stuetemperatur.
    42. Mount hjerneskiver i xylen-baserede permanent monteringsmedium.
    43. Analysere prøver under et brightfield mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et kort resumé af de ovenfor beskrevne procedurer, er vist i figur 1.

Optimal detektering af Atf4 mRNA granulat i cholinerge axoner ved hjælp af varme-induceret demaskering

Ved vurdering axonal lokalisering af mRNA'er, er det vigtigt at kunne identificere de axoner og at være i stand til at visualisere lave rigelige RNA'er. RNA ISH teknologi beskrevet her muliggør påvisning af RNA'er på et enkelt-molekyle opløsning. Standardprotokoller anvender denne teknologi foreslå kombinationen af to demaskerende procedurer til effektivt at detektere mål-RNA'er: protease-induceret og varmeinduceret afmaskering 28. Men når ISH kombineres med immunhistokemi til at identificere axoner, protease-induceret demaskering måske ikke resultere i optimal påvisning af antigen 29.

I den første protokol er beskrevet her, blev proteasespaltning undgås, da det anvendte antistof ikke anerkendte choline acetyltransferase (ChAT) typisk findes i axoner i den tandede gyrus følger af septohippocampal pathway (figur 2A og B), selvom positive mRNA granulat blev påvist. Varmeinduceret hentning med 10 mM citratpuffer (pH 6), på den anden side, sikres integritet af epitopen genkendt af anti-ChAT antistof og målrette mRNA blev effektivt påvist i ChAT-farvede axoner (figur 2C og D). De præsenteres her resultater (figur 2) viser tilstedeværelsen af Atf4 i gyrus dentatus fra voksne mus, hvor mRNA rekruttering og lokalt oversættelse blev induceret ved infusion af Ap 1-42 oligomerer i hippocampus. Forrige tyder på, at Atf4 mRNA ikke detekteres i axoner in vitro eller in vivo under basale betingelser 18, og dermed en sådan eksperimentel paradigme er ikke vist.

Optimal detektering af ATF4mRNA granulat i axoner under anvendelse af både varmeinduceret og protease-induceret demaskering

De resultater, der er beskrevet ovenfor, viser, at antistof baseret protein detektering er kompatibel med RNA ISH-teknologi, når du udfører varme induceret demaskering det måske ikke være nyttigt, hvis protease forbehandling er nødvendig. Afsnit 2 beskriver påvisning af ATF4 mRNA inden axoner efter tidligere offentliggjorte procedurer 28,30 kombineret med histologiske pletter typisk anvendes til hjerneprøver 31,32.

Et kritisk trin i denne procedure er det optimale modfarvning af myelinerede fibre ved hjælp Luxol Fast Blue (LFB) uden maskering af forekomsten af ​​mRNA granulat i axoner farvet med CISH. Reagenser anvendt til dette formål muliggøre optimal modfarve med LFB efter inkubationstider på 60 til 90 min. Counterstain mislykkes, når både temperatur og inkubationstider er faldet (figur 3A og indpresningsdybde, og data ikke vist) ennd selvom mRNA granulat stadig vil være synlige, deres axonal lokalisering kan ikke verificeres. På den anden side, inkubere hjerneprøver i 60 min eller længere ved 60 ° C uden overvågning af tilstedeværelsen af positive granuler periodisk kan resultere i irreversibel maskering af mRNA'et af interesse ved farvestoffet (figur 3B og indsat). Det anbefales derfor, at prøverne inkuberes i LFB i 30 minutter og at yderligere inkubation udføres trinvis kontrol prøverne hver 10 til 20 min for at opnå en optimal farvning af både axoner og RNA granulat (figur 3D-F). Efter disse retningslinier Atf4 positive granuler kan tydeligt påvises både i kontrol (figur 3D) og Alzheimers sygdom (figur 3F) hjerneprøver.

Figur 1
Figur 1. Opsummeret arbejdsgangaf RNA ISH efterfulgt af axonal kontrastfarve. Steps afbildet i sort er fælles for de to procedurer, der er eksemplificeret. Trin fremhævet i blåt er specifikke for paraformaldehyd-faste prøver farvet af fluorescerende ISH hvorimod fremhævet med rødt, er specifikke for formalin-fikseret paraffinindlejrede prøver farvet af kromogene ISH. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. FISH for Atf4 mRNA lokaliseret til cholinerge axoner i gyrus dentatus af voksne mus. FISH blev udført ved hjælp af protease-induceret (l enstre panel) eller varme-induceret (højre panel) demaskering efterfulgt af antistof påvisning af cholinacetyltransferase (ChAT) . Den ANTIBody undladt at genkende chatte, når proteasebehandling blev udført. Eksempler på resultater opnået med en ikke-targeting sonde (dapB) og Atf4 -targeting sonden ved hjælp af samme mikroskop indstillinger og billedjusteringer er vist. Atf4 -positive granulat med uklare axonal lokalisering er angivet med spørgsmålstegn, mens lokaliserede granulat er markeret som " ok ". Målestok 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. CISH for ATF4 mRNA lokaliseret til myelinerede axoner i humant hippocampus formation. Efter ISH blev axoner modfarvet med Luxol Fast Blue (LFB), og neuronal somata blev modfarvet med cresylviolet. Suboptimal LFB farvning kan medføre, hvis både temperatur (A og indpresningsdybde repræsenterer prøver farvet med LFB ved 40 ° C i 4 timer.) Og inkubationstid (ikke vist) er faldet, eller når kontrastfarve ikke kontrolleres, efter korte inkubationsperioder (sort og inset ). Eksempler på optimal LFB farvning kombineret med ISH anvendelse af et ikke-targeting probe (dapB) eller ATF4 -targeting probe er vist (CF og Einsatzmellemværk). Billedoptagelse blev justeres automatisk efter de bedste signal-støj-forhold. ATF4 -positive granulat med uklare axonal lokalisering er angivet med spørgsmålstegn, mens lokaliserede granulat er markeret som "ok". Scale bar 50 um, mellemværker 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne rapport beskriver vi anvendelse af en høj opløsning ISH teknologi til detektion af axonally lokaliseret Atf4 mRNA. Disse og tidligere publicerede undersøgelser viser, at denne teknologi er kompatibel med antistof-baserede protein detektion i væv eller endda hele embryoner 33. Vigtigere er det, har det været for nylig anvendt til påvisning af Arc mRNA inden dendritter af hippocampusneuroner 34. Det kan også kombineres med histologiske farvestoffer til farvning af væv. Endelig er det velegnet til samtidig påvisning af multipel mål-RNA'er 28,30,33. Disse resultater eksemplificere alsidighed høj opløsning RNA ISH teknologier og mindre ændringer af de oprindelige protokoller ikke nedsætte følsomheden af ​​denne metode.

Originale protokoller, der beskriver brugen af ​​Z-struktur sonder til at opdage mRNA af interesse i væv på et enkelt molekyle opløsning tyder to trin for mRNA demaskering involvererprotease-fordøjelse og prøve kogende 30,35. Her viser vi, hvordan protease-induceret demaskering krænker den vellykkede antistof-baseret detektion af ChAT i cholinerge axoner følge af septo-hippocampale reaktionsvej (figur 2A og B). Således besluttede vi at udelukke dette skridt og udfører kun varme-induceret demaskering hvis axonal kontrastfarvning involveret brugen af ​​antistoffer. Som vist (figur 2C og D), kan cholinerge axoner visualiseres med et anti-ChAT antistof og Atf4 mRNA granuler var påviselige undgå proteasefordøjelse. Bemærk, at den positive påvisning af Atf4 mRNA er baseret på den baggrundsfluorescens opnået fra den negative probe. En ekstra kontrol kan medtages på dette tidspunkt ved at behandle hjernen prøver med RNaser og sondering dem med musen Atf4 sonder for at teste deres specificitet. Dette trin er imidlertid ikke indeholdt i de procedurer, der diskuteres her, datidligere beviser show, ved hjælp af denne samme teknologi, en komplet udtømning af Atf4 mRNA i axoner efter siRNA injektion i mus hippocampus 18. Sådanne resultater demonstrerer specificiteten af ​​ISH sonder anvendes her. Brugen af ​​kontroller, bortset fra negative sonder bør vurderes på grundlag af særlige videnskabelige spørgsmål. Endelig kunne varmeinduceret hentning være substitueret med eller kombineres med protease-induceret demaskering afhængigt af kravene af antistoffet anvendes til Axon modfarvning. Valget af anvendelse af en eller anden procedure eller kombinationen af ​​begge skal bestemmes empirisk af brugeren.

Når du udfører protease- og varme-induceret demaskering i humane hjerne prøver, kan histologiske farvestoffer erstatte antistof-baserede axonal kontrastfarvning. Selvom den oprindelige protokol her fulgte foreslår anvendelsen af hæmatoxylin for vævs kontrafarvning 30, såsom farvestof er ikke egnet til Axon farvning. Således Luxol fast blå blev anvendt til at farve myelinerede axoner og cresylviolet blev anvendt til at visualisere neuronale cellelegemer. LFB, udviklet af Kluever og Barrera 31, blev valgt frem for andre pletter, fordi det kan være afsluttet i mindre end 2 timer, og hvis differentiering er optimeret (figur 3C-F) den lyseblå pletten ikke forstyrrer mRNA granulat, der vises som mørke brun-sorte prikker. Som vist (figur 3), kan optimale LFB kontrastfarvning opnås når inkubere prøver ved 60 ° C i 60-90 min. Det anbefales dog, at inkubationen udføres trinvis, så differentiering kan overvåges nøje, og mRNA granulat er altid synlige. Andre histologiske teknikker såsom Bielchowsky s eller Bodian sølv farvning udbytte grå-sort Axon farvning 36, som måske ikke er kompatible med DAB-baserede kromogene reaktion valgt i denne rapport. Sandsynlige sådanne farvningsteknikker bør kombineres med RNA CISH assaysat tillade brug af alternative farvestoffer såsom hurtig rød eller grøn HRP 30. Vælge den passende kombination af RNA ISH assays og axonale pletter bør bestemmes empirisk af brugeren.

En begrænsning af de første, der er beskrevet i denne rapport er den tabende protein detektion ved immunhistokemi hvis proteasefordøjelse udføres. Denne begrænsning kan overvindes ved at undgå protease-induceret demaskering. I det særlige tilfælde med axonally-lokaliserede Atf4 udfører varmeinduceret demaskering var tilstrækkeligt til at påvise mRNA granulat over baggrundsniveauer i cholinerge axoner. Dette er dog måske ikke være tilfældet for andre mRNA af interesse og protease fordøjelse kan være påkrævet. Hvis det er tilfældet, bør axonal kontrastfarvning udføres ved hjælp af andre end anti-ChAT antistof beskrevet her antistoffer. Alternativt kan antistof-baserede kontrastfarvning erstattes af histologiske farvestoffer, som beskrevet i afsnit 2 i protokollen.

30.

Som anført i protokollen sektion, en af ​​de kritiske trin i begge procedurer er varmeinduceret demaskering. Hvis kogning udføres i en mikrobølgeovn, er der chancer for løsning fordampning afhængigt karakteristika enheden. Følg trinene angivet i 1.2.3 og 2.2.4 for at undgå løsning fordampning. Til fast frosset væv 10 min af demaskering burde være nok, mens der for paraffin indlejretvæv koger i 15 minutter anbefales. Hvis prøverne ikke koge uafbrudt i den anbefalede tid kan dette resultere i en delvis demaskering. Men tider kunne let variere, hvis andre enheder såsom en ris komfur eller en varmeplade er valgt i stedet for en mikrobølgeovn. Kogende varighed bør bestemmes af brugeren, afhængigt af metoden.

En anden afgørende skridt er LFB kontrastfarvning. Det er vigtigt, at intensiteten af ​​det blå farvestof ikke forstyrrer visualiseringen af ​​mRNA granuler. Nogle ændringer til den oprindelige protokol 31 blev udført for at reducere intensiteten af farvestoffet, såsom sænkning af temperaturen (figur 3A) eller inkubationstiden (data ikke vist), men vi ikke klart skelne myelinerede axoner i humane hjerneprøver . På den anden side, inkubering af prøverne i LFB opløsning ved den foreslåede temperatur (60 ° C) resulterede i optimal farvning af myelinerede axoner. Deter dog anbefales, at kontrastfarvning udføres trinvis omhyggeligt overvåge tilstedeværelsen af ​​RNA granulat på alle tidspunkter for at sikre, at LFB ikke maskere mRNA'et af interesse som angivet i trin 2.2.28-2.2.36.

Endelig bør prøver aldrig tørre ud. De beskrevet i denne rapport metoder indebærer flere inkubationstrin ved 40 ° C, hvilket øger chancerne for reagens fordampning. Som anført i protokollerne, skal prøver dækkes med parafilm i alle foranstaltninger for at undgå fordampning.

Sammenfattende er udviklingen af høj opløsning RNA ISH og andre ISH metoder muliggør visualisering af lave rigelige udskrifter, herunder dem, lokaliseret til voksne axoner in vivo. Dette er især vigtigt, da mange år mRNA lokalisering til og oversættelse hos voksne axoner var stærkt overset, da de blev anset for translatorisk inaktive.

Afslutningsvis præsenterer vi en hidtil ukendt og promising teknologi til påvisning af Atf4 og potentielt mange andre mRNA'er hos voksne axoner i pattedyrs hjerne. RNAscope vil lette fremtidige undersøgelser af mRNA lokalisering og vil bidrage til at opklare den biologiske betydning af deres lokale oversættelse in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) Advanced Cell Diagnostics - probe
custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) Advanced Cell Diagnostics - probe
negative control probe-DapB Advanced Cell Diagnostics 310043 probe
positive control probe-mouse Polr2A (optional) Advanced Cell Diagnostics 312471 probe
positive control probe-human PPIB (optional) Advanced Cell Diagnostics 313901 probe
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) Advanced Cell Diagnostics 320850 in situ hybridization kit
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) Advanced Cell Diagnostics 310035 in situ hybridization kit
Goat polyclonal anti-ChAT antibody Millipore AB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit American MasterTech KTLFB
Clearify clearing agent (xylene substitute) American MasterTech CACLEGAL
ProLong Gold mounting  medium with DAPI Life Technologies P36935
DPX mounting medium Sigma 6522

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Tags

Neuroscience mRNA lokalisering axoner, Voksne hjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C.,… More

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (100), e52799, doi:10.3791/52799 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter