Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

उच्च संकल्प का उपयोग मस्तिष्क वर्गों में Axonally स्थानीयकृत mRNAs का पता लगाने Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52799
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

Abstract

mRNAs अक्सर कशेरुकी एक्सोन के लिए स्थानीय कर रहे हैं और उनके स्थानीय अनुवाद अक्षतंतु pathfinding या विकास के दौरान और postdevelopmental अवधि में रखरखाव, मरम्मत या neurodegeneration के लिए शाखाओं में बंटी के लिए आवश्यक है। उच्च throughput विश्लेषण हाल ही में एक्सोन पहले की उम्मीद की तुलना में एक अधिक गतिशील और जटिल transcriptome है कि पता चला है। ये विश्लेषण, हालांकि ज्यादातर एक्सोन somato-वृक्ष के समान डिब्बों से अलग किया जा सकता है, जहां सभ्य न्यूरॉन्स में किया गया है। यह vivo में पूरे ऊतकों में इस तरह के अलगाव को प्राप्त करने के लिए लगभग असंभव है। इस प्रकार, एक पूरे जानवरों में mRNAs और उनके कार्यात्मक प्रासंगिकता की भर्ती को सत्यापित करने के क्रम में, transcriptome विश्लेषण आदर्श बगल में mRNAs का दृश्य की अनुमति है कि तकनीक के साथ संयुक्त किया जाना चाहिए। हाल ही में, एक एकल अणु के स्तर पर RNAs का पता लगाने कि उपन्यास ISH प्रौद्योगिकियों का विकास किया गया है। MRNA की subcellular स्थानीयकरण का विश्लेषण करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, के बाद से स्थानीकृत RNAs आम तौर पर कम स्तर पर पाए जाते हैं। यहाँ हम एक उपन्यास ultrasensitive शाही सेना ISH प्रौद्योगिकी का उपयोग कर axonally स्थानीयकृत mRNAs का पता लगाने के लिए दो प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम परिपक्व माउस और मानव दिमाग में vivo में एक्सोन के लिए Atf4 mRNA की भर्ती सत्यापित करने के लिए प्रतिदीप्ति immunohistochemistry या ऊतकीय रंगों का उपयोग axonal counterstain साथ RNAscope ISH के संयुक्त है।

Introduction

Axonal mRNA के भर्ती और स्थानीय अनुवाद एक अस्थायी और स्थानिक तीव्र ढंग 1 में बाह्य stimuli करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए एक्सोन कर सकें। इंट्रा-axonal प्रोटीन संश्लेषण सबसे अच्छा अक्षतंतु 9-11 pathfinding और प्रतिगामी 12,13 संकेत है, यह विकास शंकु व्यवहार 2-8 करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जहां की भविष्यवाणी के संदर्भ में समझा जाता है। Axonal mRNA और राइबोसोम का स्तर बहुत 14,15 कम कर रहे हैं लेकिन जब भी कम समय तक पद के विकास न्यूरॉन्स में axonal प्रोटीन संश्लेषण के कार्यात्मक महत्व के बारे में जाना जाता है। परिपक्व कशेरुकी एक्सोन लंबे समय 16 translationally निष्क्रिय होने लगा दिया गया है। हालांकि, हाल के अध्ययनों से स्थानीय अनुवाद रोग की स्थिति के तहत परिपक्व एक्सोन में सक्रिय है कि संकेत मिलता है। उदाहरण के लिए, mRNAs का एक सबसेट तंत्रिका चोट और इंट्रा-axonal प्रोटीन संश्लेषण इन axons 17 का सही उत्थान के लिए आवश्यक है निम्नलिखित regenerating axons के लिए भर्ती किया गया है। इसके अतिरिक्त, हमारे समूह हाएस अल्जाइमर रोग पेप्टाइड Aβ 1-42, और प्रतिलेखन कारक ATF4 के स्थानीय अनुवाद करने के लिए स्थानीय लोगों तक पहुंचाने के न्यूरोनल सोमा से 18 एक्सोन से Aβ 1-42 की neurodegenerative प्रभाव का प्रचार करने के लिए आवश्यक है के बाद विशिष्ट mRNAs एक्सोन के लिए भर्ती कर रहे हैं कि प्रदर्शन किया। अंत में, उच्च throughput विश्लेषण परिपक्व एक्सोन विशेष रूप से रोग की स्थिति के तहत, 18-21 उम्मीद की तुलना में एक अधिक जटिल और गतिशील transcriptome है कि पता चला है। इन अध्ययनों के प्रकाश में, एक बेहद संवेदनशील और विशिष्ट विधि वयस्क तंत्रिका तंत्र में axonally स्थानीय mRNAs की जरूरत है पता लगाने के लिए।

MRNA के भर्ती और परिपक्व एक्सोन में स्थानीय अनुवाद पर काम के बहुत सभ्य न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया गया है। विशेष संवर्धन के तरीकों somato-वृक्ष के समान डिब्बे 18-20 से axons की अलगाव की अनुमति है कि मौजूद बाद से transcriptome विश्लेषण के लिए यह विशेष रूप से सच है। इस तरह के अध्ययन के लिए मूल्यवान आईएनएस दे दिया है हालांकिपरिपक्व एक्सोन में स्थानीय अनुवाद की भूमिका में ight, सवाल सभ्य न्यूरॉन्स ईमानदारी विवो में स्थिति का प्रतिनिधित्व करते हैं या mRNA भर्ती संवर्धन शर्तों के axons की एक अनुकूली प्रतिक्रिया है अगर अभी भी खुला है या नहीं। कुछ अध्ययनों विवो में एक्सोन परिपक्व करने के लिए mRNA के भर्ती के सबूत प्रदान की है। उदाहरण के लिए, घ्राण मार्कर प्रोटीन के लिए कोडिंग प्रतिलेख वयस्क संवेदी न्यूरॉन्स 22 में एक्सोन में पाया गया है। Β-actin के mRNA की 3 'UTR से युक्त एक transgene चूहों में परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र न्यूरॉन्स में एक्सोन के लिए ले जाया जाता है और स्थानीय स्तर पर विकास की अवधि 23 के बाद अनुवादित है। Xenopues टैडपोल laevis में Lamin B2 mRNA के रेटिना axons के लिए स्थानीय है और इसकी कमी axonal विकास 21 के बाद अक्षतंतु रखरखाव को प्रभावित करता है। साइटोक्रोम सी ओक्सीडेस चतुर्थ के लिए mRNA के एन्कोडिंग का axonal परिवहन के साथ हस्तक्षेप माउस व्यवहार 24 को बदल देता है। अंत में, Atf4 mRNA के वयस्क एक में पाया जाता हैAβ 1-42 के संदर्भ में चूहों और मानव दिमाग की xons neurodegeneration 18 -induced।

उच्च throughput transcriptome विश्लेषण के लिए इन विट्रो में पृथक एक्सोन में mRNA प्रोफाइल को पहचान लेकिन एक्सोन अलगाव में पाया लेकिन neuronal सेल निकायों, glial कोशिकाओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ intermingled कभी नहीं कर रहे हैं, पूरे ऊतकों में बाद में vivo अध्ययन के लिए सीमाएं हैं करने के लिए उपयोगी साबित किया है। इस प्रकार, इस तरह के विश्लेषण mRNAs का subcellular स्थानीयकरण की पुष्टि है कि इमेजिंग तकनीक के साथ संयुक्त किया जाना है। स्वस्थानी संकरण (आरएनए ISH) में शाही सेना कोशिकाओं और ऊतकों में विशिष्ट शाही सेना के दृश्यों का पता लगाने और दृश्य अनुमति देता है। हालांकि, मूल आरएनए ISH के assays के केवल शायद ही कभी axonally स्थानीयकृत mRNAs के लिए मामला है जो अत्यधिक प्रचुर मात्रा में RNAs 25 की पहचान के लिए उपयुक्त थे। प्रयासों में वृद्धि पिछले दशकों के लिए एकल अणु के स्तर पर mRNAs का पता लगाने की अनुमति है कि विकासशील उपन्यास प्रौद्योगिकियों में डाल दिया गया है 27 का उल्लेख करने के लिए) 50-mers लेबल। ऊपर वर्णित तकनीकों और यहाँ वर्णित एक के बीच मुख्य अंतर यह है कि बाद में 20 डबल जेड-संरचना (रैखिक नहीं) आम तौर पर ब्याज सुनिश्चित करने विशिष्टता और कम पृष्ठभूमि के स्तर की शाही सेना के ~ 1 केबी क्षेत्र को लक्षित है कि जांच का उपयोग करता है। जांच फिर अंत में fluorescently लेबल या वर्णजनीय प्रतिक्रियाओं की अनुमति देते हैं कि एंजाइमों के साथ संयुग्मित कर रहे हैं कि preamplifier और एम्पलीफायर दृश्यों के साथ संकरित हैं। ये प्रवर्धन चरणों अन्य ISH प्रौद्योगिकियों 28 की तुलना में संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार होगा। यहाँ हम प्रतिदीप्ति immunocytochemistry के साथ या axonal counterstaining की इजाजत दी ऊतकीय रंगों के साथ या तो संयुक्त RNAscope का उपयोग करते हुए दो प्रोटोकॉल का वर्णन है। दोनों प्रोटोकॉल वयस्क मो में Atf4 mRNA की axonal स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए उपयुक्त हैंउपयोग और मानव दिमाग।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं कोलंबिया विश्वविद्यालय के IACUC और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए लागू दिशा-निर्देशों के द्वारा अनुमोदित किया गया पीछा किया गया था। नोट: RNase मुक्त या DEPC इलाज पानी में ISH प्रक्रियाओं के लिए प्रयुक्त सभी बफ़र्स तैयार करें। ISH के पूरा हो चुका है, लेकिन यह अभी भी बफ़र्स autoclaved डबल आसुत जल में तैयार किया है और / या छानने द्वारा निष्फल रहे हैं सुझाव दिया है कि के बाद यह सिफारिश सख्ती जरूरी नहीं है।

1. immunohistochemistry द्वारा पीछा किया स्वस्थानी संकरण में वयस्क माउस मस्तिष्क का उपयोग कर प्रतिदीप्ति में कोलीनर्जिक Axons को Atf4 mRNA के स्थानीयकृत (मछली) की जांच

  1. Paraformaldehyde तय जमे हुए मस्तिष्क के स्लाइस के लिए नमूना तैयार
    1. निम्नलिखित उदाहरण के लिए, तय जमी माउस दिमाग से स्लाइस तैयार करते हैं।
      1. संक्षेप में, Ketamine साथ संज्ञाहरण से 9 महीने की उम्र में चूहों बलिदान (100 मिलीग्राम किलो -1 शरीर के वजन) और xylazine (10 मिलीग्राम किलो -1 शरीर weigहिंदुस्तान टाइम्स) पीबीएस में 4% paraformaldehyde की transcardial अर्क (7.4 पीएच) द्वारा पीछा किया।
      2. 4 ओ सी पर 24 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में दिमाग और बाद तय निकालें
      3. निर्धारण के बाद, 4 ओ सी पर 24 घंटे के लिए पीबीएस (7.4 पीएच) में नमूने 30% sucrose में तीन पीबीएस में बार और cryoprotect धोने
      4. अक्टूबर में एम्बेड दिमाग एक cryostat पर 20 माइक्रोन से कम क्रमानुसार अनुभाग, यौगिक ठंड और पाली-डी lysine इलाज किया खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट। -20 ओ सी पर उपयोग करें जब तक मस्तिष्क के स्लाइस रखें।
    2. आरटी पर 30 मिनट के लिए फ्रीजर और हवा शुष्क से paraformaldehyde तय मस्तिष्क के स्लाइस निकालें।
    3. 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    4. एक धूआं हुड में, फिर से तय मस्तिष्क आरटी पर 4% paraformaldehyde के साथ 20 मिनट के स्लाइस।
      नोट: चेतावनी: 4% paraformaldehyde के विषैला होता है और उचित सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन संभाला और त्याग किया जाना चाहिए।
    5. 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    6. मस्तिष्क के स्लाइस निर्जलीकरण।
      1. 50%, 75% और 100% की तैयारीइथेनॉल समाधान।
      2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 50% इथेनॉल में स्लाइड को विसर्जित कर दिया।
      3. आरटी पर 5 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में स्लाइड को विसर्जित कर दिया।
      4. आरटी पर 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड को विसर्जित कर दिया।
      5. आरटी पर 5 मिनट के लिए नए सिरे से 100% इथेनॉल में स्लाइड को विसर्जित कर दिया। नोट: वैकल्पिक रूप से, स्लाइड्स 1 महीने के लिए सी ओ -20 में 100% इथेनॉल में संग्रहित किया जा सकता है।
  2. मछली परख गर्मी प्रेरित प्रतिजन / आरएनए unmasking का उपयोग कर immunohistochemistry द्वारा पीछा किया
    1. शुरू करने से पहले सभी आवश्यक सामग्री तैयार:
      1. 40 ओ सी के लिए संकरण ओवन गर्मी और एक humidified माहौल बनाने के लिए ओवन में आसुत जल से युक्त एक ट्रे जगह है।
      2. एक स्लाइड बॉक्स ले लो और अंदर स्लाइड बॉक्स गीला करने के लिए आसुत पानी में भिगो कागज तौलिये जगह है। संकरण ओवन में स्लाइड बॉक्स रखें।
      3. फ्रिज से जांच (नकारात्मक और लक्ष्य जांच दोनों) को हटाने और 10 मिनट के लिए संकरण उन्हें ओवन में गर्म करें। जांच डॉव शांत करते हैंआरटी पर एन।
      4. आरटी पर (फ्लोरोसेंट मल्टीप्लेक्स अभिकर्मक किट में शामिल है) प्रवर्धन अभिकर्मकों एएमपी 1-4 संतुलित करना।
      5. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान तैयार: 10 मिमी सोडियम साइट्रेट (पीएच 6), 0.05% के बीच 20 नोट: समाधान अनिश्चित काल के लिए आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है और भविष्य धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
      6. RNase मुक्त या DEPC इलाज पानी में (फ्लोरोसेंट मल्टीप्लेक्स अभिकर्मक किट में शामिल है) 50x शेयर समाधान गिराए 1x धो बफर तैयार करें।
        नोट: 1x धो बफर 1 महीने के लिए आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है और भविष्य धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। 50x धोने बफर वेग सकता है। यदि ऐसा है, 1x समाधान तैयार करने से पहले 10 मिनट के लिए 40 ओ सी में गर्मी 50x धोने बफर।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल और हवा शुष्क से स्लाइड्स निकालें।
    3. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान के 50 मिलीग्राम से युक्त एक coplin जार तैयार करें। प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान में स्लाइड को विसर्जित कर दिया और एक माइक्रोवेव ओवन में 10 मिनट के लिए उन्हें फोड़ा।
      नोट: वैकल्पिक रूप से जगह एक 100 मिमी में क्षैतिज स्लाइडपुनः प्राप्ति के समाधान के 100 मिलीलीटर युक्त व्यास दौर गिलास पकवान।
      1. आसुत जल के साथ एक 1 एल बीकर भरें और माइक्रोवेव में जगह है।
        नोट: unmasking प्रदर्शन कर पानी जब गर्मी 'बफर "जाएगा।
      2. माइक्रोवेव के अंदर प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान में स्लाइड्स रखें। उबाल लें 5 मिनट के लिए उच्च शक्ति में स्लाइड। नमूने उबलते बंद कर दिया है के तुरंत बाद, गर्मी अतिरिक्त 5 मिनट के लिए उच्च शक्ति पर फिर से स्लाइड।
      3. आरटी पर स्लाइड शांत हो जाओ।
        नोट: महत्वपूर्ण कदम: उबलते अवधि और प्रक्रिया माइक्रोवेव विशेषताओं के आधार पर उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। तेजी से उबलते उच्च समाधान वाष्पीकरण की संभावना शुरू होता है। इस मामले में यह नमूने दो बार 10 मिनट के एक कुल unmasking समय पूरा करने के लिए अधिक से अधिक कम समय अवधि के लिए उबला हुआ है कि सिफारिश की है। हीटिंग मध्यम या कम बिजली पर किया जाता है इसके विपरीत, यदि, unmasking 10 मिनट के लिए एक बार किया जा सकता है। हालांकि, अगर नमूने continuousl फोड़ा नहीं हैलगभग 10 मिनट की कुल के लिए वाई, इस से पता लगाया जा करने के लिए लक्ष्य आरएनए और प्रोटीन दोनों की आंशिक unmasking में परिणाम हो सकता है।
    4. धो 1x पीबीएस के साथ तीन बार स्लाइड।
    5. पृष्ठभूमि धुंधला आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के मस्तिष्क के स्लाइस के लिए सेट dapB जांच के 3 बूँदें (~ 100 μl) - 2 जोड़ें। नोट: dapB जांच सेट एक जीवाणु जीन लक्ष्य है और किसी भी स्तनधारी शाही सेना को पहचान नहीं होना चाहिए।
    6. ब्याज की शाही सेना का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के मस्तिष्क के स्लाइस के लिए सेट लक्ष्य-निर्धारण जांच के 3 बूँदें - 2 जोड़ें। नोट: एक जांच सेट अवशेष 20 को लक्षित - Atf4 mRNA के इस उदाहरण में प्रयोग किया जाता है माउस की 1381।
    7. Parafilm के साथ कवर स्लाइड, जांच के वाष्पीकरण से बचने के संकरण ओवन के अंदर humidified स्लाइड बॉक्स में उन्हें जगह और 2 घंटे के लिए 40 ओ सी पर उनके लिए सेते हैं।
      नोट: वैकल्पिक: अतिरिक्त मस्तिष्क के स्लाइस माउस Polr2A को लक्षित एक जांच सेट के साथ संकरित और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    8. धो SLIदेस दो बार आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ।
    9. 2 जोड़ें - प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए प्रवर्धन अभिकर्मक एएमपी 1-फ्लोरिडा के 3 बूँदें, स्लाइड बॉक्स में उन्हें जगह और संकरण ओवन में 30 मिनट के लिए 40 ओ सी पर सेते हैं, parafilm के साथ स्लाइड को कवर किया।
    10. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड।
    11. 2 जोड़ें - प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए प्रवर्धन अभिकर्मक एएमपी 2-फ्लोरिडा के 3 बूँदें, स्लाइड बॉक्स में उन्हें जगह और संकरण ओवन में 15 मिनट के लिए 40 ओ सी पर सेते हैं, parafilm के साथ स्लाइड को कवर किया।
    12. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड।
    13. 2 जोड़ें - प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए प्रवर्धन अभिकर्मक एएमपी 3-फ्लोरिडा के 3 बूँदें, स्लाइड बॉक्स में उन्हें जगह और संकरण ओवन में 30 मिनट के लिए 40 ओ सी पर सेते हैं, parafilm के साथ स्लाइड को कवर किया।
    14. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड।
    15. 2 जोड़ें - प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए प्रवर्धन अभिकर्मक एएमपी 4-फ्लोरिडा के 3 बूँदें, में उन्हें जगह, parafilm के साथ स्लाइड कवरस्लाइड बॉक्स और संकरण ओवन में 15 मिनट के लिए 40 ओ सी सेते हैं।
    16. धो 1x पीबीएस के साथ 2 मिनट के लिए 1x धो बफर आरटी पर और दो बार के साथ दो बार स्लाइड।
    17. 100 जोड़ें - स्लाइड करने के लिए 3 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 100 मिमी ग्लाइसिन और 0.25% ट्राइटन X-100 पीबीएस में (7.4 पीएच) युक्त एक अवरुद्ध समाधान की (पूरी तरह से स्लाइस को कवर करने के लिए या पर्याप्त मात्रा) 200 μl, parafilm के साथ उन्हें कवर और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    18. स्लाइड का हल (1/100) अवरुद्ध में पतला विरोधी चैट एंटीबॉडी के 200 μl parafilm के साथ उन्हें कवर और 4 ओ सी में 2 दिनों के लिए सेते हैं - 100 जोड़ें मस्तिष्क के स्लाइस बाहर सूखी नहीं है कि सुनिश्चित करें। यदि आवश्यक हो, 24 घंटे ऊष्मायन के बाद मस्तिष्क के स्लाइस को विरोधी चैट एंटीबॉडी समाधान फिर से लागू होते हैं।
    19. धो आरटी पर 5 मिनट के लिए 1X पीबीएस में तीन बार स्लाइड।
    20. 100 जोड़ें - उचित एलेक्सा संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 μl (। उदाहरण के लिए, इस विशिष्ट उदाहरण के लिए एलेक्सा 594 गधा विरोधी बकरी) स्लाइड के लिए, parafilm और incub के साथ कवरआरटी पर 1 घंटे के लिए खा लिया।
    21. धो आरटी पर 5 मिनट के लिए 1X पीबीएस में तीन बार स्लाइड।
    22. धो आसुत जल के साथ एक बार स्लाइड।
    23. माउंट DAPI युक्त बढ़ते मध्यम के साथ स्लाइड।
    24. एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत मस्तिष्क के स्लाइस कल्पना।

Luxol फास्ट ब्लू और cresyl बैंगनी counterstaining द्वारा पीछा स्वस्थानी संकरण (CISH) में chromogenic का उपयोग करते हुए मानव मस्तिष्क नमूनों में Axons को Atf4 mRNA के स्थानीयकृत 2. डिटेक्शन

  1. Formalin तय आयल एम्बेडेड मानव मस्तिष्क के नमूने के लिए नमूना तैयार
    1. 1 घंटे के लिए 60 ओ सी पर एक सूखी ओवन में बनाओ स्लाइस।
    2. एक धूआं हुड में Deparaffinize मस्तिष्क के स्लाइस।
      नोट: चेतावनी: अभिकर्मकों विषाक्त कर रहे हैं और नियंत्रित किया जाना चाहिए और उचित सुरक्षा दिशा निर्देशों का पालन त्याग
      1. 10 मिनट के लिए दो बार xylene वैकल्पिक समाशोधन एजेंट में स्लाइड्स विसर्जित कर दिया।
      2. 1 मिनट के लिए दो बार 100% इथेनॉल में स्लाइड को विसर्जित कर दिया।
      3. एआईआर-सूखी स्लाइस आरटी पर 5 मिनट। नोट: वैकल्पिक रूप से नमूने आर टी ओ में सूखे की जा सकती है / एन लेकिन 24 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए।
  2. Diaminobenzidine (थपका) गर्मी प्रेरित और प्रोटीज प्रेरित शाही सेना unmasking का उपयोग कर luxol तेजी से नीले और cresyl बैंगनी दाग ​​द्वारा पीछा वर्णजनीय ISH परख आधारित
    1. शुरू करने से पहले आवश्यक सामग्री तैयार करते हैं:
      1. 40 ओ सी के लिए संकरण ओवन गर्मी और एक humidified माहौल बनाने के लिए आसुत जल से युक्त एक ट्रे जगह है।
      2. एक स्लाइड बॉक्स ले लो और अंदर स्लाइड बॉक्स गीला करने के लिए आसुत पानी में भिगो कागज तौलिये जगह है। संकरण ओवन में स्लाइड बॉक्स रखें।
      3. RNase मुक्त या DEPC इलाज पानी में (CISH अभिकर्मक किट में शामिल है) 10x शेयर समाधान गिराए द्वारा 1x pretreat 2 तैयार करें। Pretreatment के एक गर्म थाली पर किया जाता है, तो pretreatment अगर (पकवान और हॉट प्लेट के बीच संपर्क की सतह को बढ़ाने के लिए एक 100 मिमी व्यास कांच डिश के लिए pretreat समाधान के 100 मिलीलीटर जोड़ने1.2.3 में निर्दिष्ट के रूप में एक माइक्रोवेव में किया जाता है, एक coplin जार) के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है। 100 ओ सी के लिए हीट समाधान और नमूने जलमग्न होने से पहले अब कोई 30 मिनट से उबलते रहते हैं।
      4. हीट नकारात्मक और सकारात्मक जांच 10 से 40 ओ सी पर न्यूनतम और आरटी पर शांत हो जाओ।
      5. आरटी पर (CISH अभिकर्मक किट में शामिल है) प्रवर्धन अभिकर्मकों एएमपी 1-6 संतुलित करना।
      6. आसुत जल में (CISH अभिकर्मक किट में शामिल है) 50x शेयर समाधान गिराए 1x धो बफर तैयार करें। नोट: 1x धो बफर 1 महीने के लिए आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है और भविष्य धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    2. , प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए pretreat 1 ~ 4 बूँदें (~ 120 μl) जोड़ें parafilm के साथ कवर और 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    3. ताजा आसुत जल में 3 से 5 बार धोएं।
    4. गर्मी प्रेरित unmasking प्रदर्शन:
      1. (CISH अभिकर्मक किट में शामिल है) गर्म pretreat 2 स्थानांतरण करने के लिए स्लाइड 15 मिनट के लिए समाधान और फोड़ा। उबलते सुनिश्चित करने के लिए एक गर्म थाली पर प्रदर्शन किया जा सकता है: नोटनिरंतर उबलते या 1.2.3 में निर्दिष्ट महत्वपूर्ण कदम) के बाद एक माइक्रोवेव में।
    5. इसके तत्काल बाद डिस्टिल्ड पानी के लिए स्लाइड हस्तांतरण और 3 से 5 बार धो लें।
    6. धो ताजा 100% इथेनॉल में 3 से 5 बार स्लाइड।
    7. हवा शुष्क स्लाइस आरटी पर 5 मिनट। नोट: वैकल्पिक रूप से स्लाइस सूख जा सकता हे / एन।
    8. प्रोटीज प्रेरित unmasking प्रदर्शन:
      1. (CISH अभिकर्मक किट में शामिल है) pretreat 3 से 4 बूँदें जोड़ें, parafilm के साथ कवर किया और संकरण ओवन में 40 ओ सी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    9. धो ताजा आसुत जल में 3 से 5 बार स्लाइड।
    10. पृष्ठभूमि धुंधला आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के मस्तिष्क के स्लाइस के लिए सेट dapB जांच के 4 बूँदें जोड़ें।
    11. ब्याज की शाही सेना का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के मस्तिष्क के स्लाइस के लिए सेट को लक्षित कर जांच के 4 बूँदें जोड़ें।
      नोट: अवशेष 15 को लक्ष्य बनाने वाले जांच के सेट - मानव ATF4 mRNA की 1,256 इस उदाहरण में प्रयोग किया जाता है। वैकल्पिक: अतिरिक्त मस्तिष्क के स्लाइस HYB किया जा सकता हैमानव PPIB को लक्षित एक जांच सेट के साथ ridized और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया।
    12. स्लाइड बॉक्स में स्लाइड्स प्लेस और 2 बजे के लिए सेते हैं। संकरण ओवन में 40 ओ सी पर।
    13. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड।
    14. प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए एएमपी 1 अभिकर्मक के 4 बूँदें जोड़ें, parafilm के साथ स्लाइड कवर, स्लाइड बॉक्स में उन्हें जगह और संकरण ओवन में 30 मिनट के लिए 40 ओ सी सेते हैं।
    15. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड।
    16. प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए एएमपी 2 अभिकर्मक के 4 बूँदें जोड़ें, parafilm के साथ स्लाइड कवर, स्लाइड बॉक्स में उन्हें जगह और संकरण ओवन में 15 मिनट के लिए 40 ओ सी सेते हैं।
    17. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड।
    18. प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए एएमपी 3 अभिकर्मक के 4 बूँदें जोड़ें, parafilm के साथ स्लाइड कवर, स्लाइड बॉक्स में उन्हें जगह और संकरण ओवन में 30 मिनट के लिए 40 ओ सी सेते हैं।
    19. 1x था के साथ धोने दो बार स्लाइडआरटी पर 2 मिनट के लिए एच बफर।
    20. प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए एएमपी 4 अभिकर्मक के 4 बूँदें जोड़ें, parafilm के साथ स्लाइड कवर, स्लाइड बॉक्स में उन्हें जगह और संकरण ओवन में 15 मिनट के लिए 40 ओ सी सेते हैं।
    21. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड।
    22. प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए एएमपी 5 अभिकर्मक के 4 बूँदें जोड़ें, parafilm के साथ स्लाइड को कवर किया और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    23. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड।
    24. प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए एएमपी 6 अभिकर्मक के 4 बूँदें जोड़ें, parafilm के साथ स्लाइड को कवर किया और आरटी पर 15 मिनट सेते हैं।
    25. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड।
    26. , प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए ~ समाधान के 120 μl जोड़ने के लिए, (CISH अभिकर्मक किट में शामिल है) के बराबर ब्राउन-1 की मात्रा और भूरे रंग-2 अभिकर्मकों मिक्स parafilm के साथ कवर किया और आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    27. धो आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के साथ दो बार स्लाइड और आसुत जल में एक बार कुल्ला।
      नोट: महत्वपूर्ण कदम: निम्न चरणों के लिए महत्वपूर्ण हैंशाही सेना कणिकाओं की उपस्थिति मास्किंग के बिना एक इष्टतम axonal counterstain प्राप्त करते हैं।
    28. एक brightfield माइक्रोस्कोप के तहत ब्याज की mRNA की उपस्थिति की जांच counterstain प्रदर्शन से पहले। Counterstain प्रक्रिया के दौरान puncta के उपस्थिति की निगरानी करने में जो मस्तिष्क के नमूनों में संदर्भ के क्षेत्रों को परिभाषित करें।
    29. 60 ओ सी पर पहले से गरम luxol तेजी से नीले समाधान
    30. प्लेस luxol तेजी से नीले रंग में स्लाइड और 60 ओ सी पर 30 मिनट के लिए सेते
    31. आसुत जल में कई बार कुल्ला।
    32. डुबकी भेदभाव शुरू करने के लिए 0.05% लिथियम कार्बोनेट के घोल में कई बार स्लाइड।
    33. डुबकी ताजा 75% इथेनॉल में दो बार स्लाइड।
    34. आसुत जल में कुल्ला।
    35. एक brightfield खुर्दबीन के नीचे मस्तिष्क के स्लाइस की जाँच करें। ग्रे और सफेद पदार्थ गहरे नीले / काले puncta के रूप में अभी भी दिखाई अलग पहचाना और आरएनए कणिकाओं होना शुरू कर देना चाहिए ध्यान दें। एक्सोन हल्के नीले रंग फाइबर के रूप में दिखने शुरू की जाँच करें।
    36. दोहराएँ 2.2.32 को 2.2.28 कदम। कामकाज20 मिनट के कदम, ध्यान से counterstain और आरएनए कणिकाओं की उपस्थिति की निगरानी - 10 में luxol तेजी से नीले समाधान के साथ मीटर incubations। नोट: आमतौर पर, इष्टतम counterstain 60 में अधिग्रहण कर लिया है - यह आरएनए कणिकाओं luxol तेजी से नीला दाग (उदाहरण के लिए देखें चित्र 2) द्वारा नकाबपोश जा सकता है संदेह है कि अगर 90 मिनट (कुल ऊष्मायन समय), लेकिन समय छोटा किया जा सकता है।
    37. आरटी पर 10 मिनट के लिए cresyl बैंगनी समाधान में स्लाइड्स सेते हैं।
    38. आसुत जल में स्लाइड्स कुल्ला।
    39. डुबकी 70% इथेनॉल में 5 से 10 गुना स्लाइड।
    40. 100% इथेनॉल के 3 त्वरित परिवर्तन के माध्यम से मस्तिष्क के स्लाइस निर्जलीकरण।
    41. एक धूआं हुड में, 2 मिनट और आरटी पर 5 मिनट के लिए एक तीसरी बार के लिए xylene वैकल्पिक समाशोधन एजेंट में दो बार incubating द्वारा स्पष्ट मस्तिष्क के स्लाइस।
    42. Xylene आधारित स्थायी बढ़ते मध्यम में माउंट मस्तिष्क के स्लाइस।
    43. एक brightfield खुर्दबीन के नीचे नमूनों का विश्लेषण।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं का एक संक्षिप्त सारांश चित्र 1 में दिखाया गया है।

Atf4 mRNA की इष्टतम पता लगाने गर्मी प्रेरित unmasking का उपयोग कर कोलीनर्जिक एक्सोन में कणिकाएं

MRNAs का axonal स्थानीयकरण का आकलन करते हैं, तो यह एक्सोन की पहचान करने में सक्षम होने के लिए और कम प्रचुर मात्रा में RNAs कल्पना करने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ वर्णित शाही सेना ISH प्रौद्योगिकी एक एकल अणु संकल्प पर RNAs का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है। इस तकनीक का उपयोग कर मानक प्रोटोकॉल कुशलता से लक्ष्य RNAs पता लगाने के लिए दो unmasking प्रक्रियाओं के संयोजन का सुझाव: प्रोटीज प्रेरित और unmasking 28 गर्मी प्रेरित किया। ISH के एक्सोन की पहचान करने के लिए immunohistochemistry के साथ संयुक्त है हालांकि, जब प्रोटीज प्रेरित unmasking इष्टतम प्रतिजन का पता लगाने के 29 में परिणाम नहीं हो सकता है।

इस्तेमाल किया एंटीबॉडी सी पहचान करने में विफल के बाद से यहाँ वर्णित पहली प्रोटोकॉल में, प्रोटीज पाचन, बचा थासकारात्मक mRNA के कणिकाओं का पता लगाया गया है, हालांकि आम तौर पर septohippocampal मार्ग (2A चित्रा और बी) से उत्पन्न होने वाली दांतेदार गाइरस के axons में पाया holine acetyltransferase (चैट),। हीट प्रेरित 10 मिमी साइट्रेट बफर (पीएच 6) के साथ पुनः प्राप्ति, दूसरी ओर, विरोधी चैट एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त मिलान की अखंडता को सुनिश्चित किया और mRNA कुशलता से चैट से सना हुआ एक्सोन (चित्रा -2 और डी) में पाया गया था लक्ष्य। यहाँ प्रस्तुत परिणाम (चित्रा 2) mRNA के भर्ती और स्थानीय अनुवाद 1-42 oligomers हिप्पोकैम्पस में Aβ के अर्क से प्रेरित थे, जहां वयस्क चूहों के दांतेदार गाइरस में Atf4 की उपस्थिति दिखाते हैं। पिछले सबूत Atf4 mRNA के बेसल शर्तों 18 के तहत इन विट्रो में या विवो में एक्सोन में पता नहीं है, और इस तरह इस तरह के एक प्रयोगात्मक प्रतिमान नहीं दिखाया गया है कि पता चलता है।

ATF4 का इष्टतम का पता लगानेदोनों गर्मी प्रेरित और प्रोटीज प्रेरित unmasking का उपयोग कर एक्सोन में mRNA कणिकाओं

प्रोटीज पूर्व उपचार आवश्यक है, तो यह उपयोगी नहीं हो सकता है unmasking प्रेरित गर्मी जब प्रदर्शन एंटीबॉडी आधारित प्रोटीन का पता लगाने के शाही सेना ISH प्रौद्योगिकी के साथ संगत है कि शो में ऊपर वर्णित परिणामों जबकि। धारा 2 आम तौर पर मस्तिष्क के नमूने 31,32 के लिए इस्तेमाल किया ऊतकीय दाग के साथ संयुक्त पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं 28,30 निम्नलिखित एक्सोन के भीतर ATF4 mRNA की पता लगाने का वर्णन है।

इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम CISH से सना हुआ एक्सोन में mRNA कणिकाओं की उपस्थिति मास्किंग बिना luxol तेजी ब्लू (LFB) का उपयोग मेलिनकृत फाइबर का इष्टतम counterstain है। इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों LFB 90 मिनट के लिए 60 की ऊष्मायन समय निम्न के साथ इष्टतम counterstain अनुमति देते हैं। Counterstain दोनों तापमान और ऊष्मायन बार घट रहे हैं जब विफल हो सकता है (चित्रा 3 ए और इनसेट, और डेटा नहीं दिखाया गया है) एकmRNA के कणिकाओं अभी भी दिखाई जाएगी, हालांकि एन डी, उनके axonal स्थानीयकरण सत्यापित नहीं किया जा सकता है। दूसरी ओर, सकारात्मक कणिकाओं की उपस्थिति की निगरानी के बिना 60 मिनट या 60 ओ सी पर लंबे समय तक के लिए मस्तिष्क के नमूने incubating समय-समय पर डाई द्वारा ब्याज की mRNA (चित्रा 3 बी और इनसेट) के अपरिवर्तनीय मास्किंग में परिणाम हो सकता है। यह इस प्रकार के नमूने 30 मिनट के लिए LFB में incubated रहे हैं और कहा कि आगे ऊष्मायन axons और शाही सेना कणिकाओं (चित्रा 3 डी-एफ) दोनों का एक इष्टतम धुंधला प्राप्त करने के लिए नमूने हर 10 से 20 मिनट की जाँच चरणबद्ध किया जाता है की सिफारिश की है। Atf4 सकारात्मक कणिकाओं स्पष्ट रूप से पता लगाया जा सकता है कि इन दिशा निर्देशों के बाद दोनों नियंत्रण (चित्रा 3 डी) और अल्जाइमर रोग (चित्रा 3F) मस्तिष्क नमूनों में।

चित्र 1
चित्रा 1. संक्षेप कार्यप्रवाहशाही सेना ISH axonal counterstain द्वारा पीछा की। काले रंग में दर्शाया कदम उदाहरण दो प्रक्रियाओं के लिए आम हैं। नीले रंग में प्रकाश डाला कदम लाल रंग में डाला उन वर्णजनीय ISH के द्वारा दाग formalin तय आयल एम्बेडेड नमूने के लिए विशिष्ट हैं जबकि फ्लोरोसेंट ISH के द्वारा दाग paraformaldehyde तय नमूने के लिए विशिष्ट हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Atf4 mRNA के लिए चित्रा 2. मछली वयस्क चूहों के दांतेदार गाइरस में कोलीनर्जिक एक्सोन के लिए स्थानीय। मछली कोलीन acetyltransferase के एंटीबॉडी का पता लगाने (चैट) द्वारा पीछा प्रोटीज प्रेरित (एल ईएफटी पैनल) या गर्मी प्रेरित (सही पैनल) unmasking उपयोग किया गया था । antibODY प्रोटीज उपचार प्रदर्शन किया गया था जब चैट पहचानने में असफल रहे। एक गैर-लक्षित कर जांच (dapB) और माइक्रोस्कोप सेटिंग्स और छवि समायोजन का उपयोग कर उसी Atf4 -targeting जांच के साथ प्राप्त परिणामों के उदाहरण दिखाए जाते हैं। अस्पष्ट axonal स्थानीयकरण के साथ Atf4 -positive कणिकाओं प्रश्न चिह्न के साथ संकेत कर रहे हैं स्थानीयकृत कणिकाओं "के रूप में चिह्नित कर रहे हैं, जबकि ठीक है "। स्केल बार 20μm। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
ATF4 mRNA के लिए चित्रा 3. CISH मानव हिप्पोकैम्पस गठन में मेलिनकृत एक्सोन के लिए स्थानीय। ISH के बाद, एक्सोन luxol तेजी ब्लू (LFB) के साथ counterstained थे और neuronal somata cresyl बैंगनी साथ counterstained। तापमान दोनों एक (और इनसेट 4 बजे के लिए 40 ओ सी पर LFB के साथ दाग नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं।) यदि suboptimal LFB धुंधला और ऊष्मायन समय () नहीं दिखाया कमी आई है, या कर रहे हैं परिणाम हो सकता है counterstain कम ऊष्मायन अवधि (बी और इनसेट के बाद जाँच नहीं है जब )। एक गैर-लक्षित कर जांच (dapB) या ATF4 -targeting जांच का उपयोग ISH के साथ संयुक्त इष्टतम LFB धुंधला के उदाहरण (सीएफ और insets) दिखाए जाते हैं। स्थानीयकृत कणिकाओं "ठीक है" के रूप में चिह्नित कर रहे हैं, जबकि छवि अधिग्रहण स्वचालित रूप से स्पष्ट नहीं axonal स्थानीयकरण के साथ सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात। ATF4 -positive कणिकाओं के लिए समायोजित किया गया था प्रश्न चिह्न के साथ संकेत कर रहे हैं। स्केल बार 50 माइक्रोन, 10 माइक्रोन insets। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस रिपोर्ट में हम axonally स्थानीयकृत Atf4 mRNA का पता लगाने में एक उच्च संकल्प ISH प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन। ये और पिछले प्रकाशित अध्ययन में इस तकनीक के ऊतकों या यहां तक कि पूरे भ्रूण 33 में एंटीबॉडी आधारित प्रोटीन का पता लगाने के साथ संगत है कि पता चलता है। महत्वपूर्ण बात है, यह हाल ही में हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स 34 की डेन्ड्राइट के भीतर आर्क mRNA की पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह भी ऊतक धुंधला के लिए ऊतकीय रंगों के साथ जोड़ा जा सकता है। अंत में, यह एकाधिक लक्ष्य RNAs के 28,30,33 के एक साथ पता लगाने के लिए उपयुक्त है। इन निष्कर्षों को उच्च संकल्प शाही सेना ISH के प्रौद्योगिकियों के बहुमुखी प्रतिभा का उदाहरण देना, और मूल प्रोटोकॉल को मामूली संशोधनों के इस पद्धति की संवेदनशीलता में कमी नहीं है।

एक एकल अणु संकल्प पर ऊतकों में ब्याज की mRNAs पता लगाने के लिए जेड संरचना जांच के उपयोग का वर्णन मूल प्रोटोकॉल mRNA को शामिल unmasking के लिए दो कदम सुझावप्रोटीज पाचन और नमूना 30,35 उबलते। यहाँ हम प्रोटीज प्रेरित नकारात्मक रूप unmasking septo-हिप्पोकैम्पस मार्ग (2A चित्रा और बी) से उत्पन्न होने वाली कोलीनर्जिक एक्सोन में चैट के सफल एंटीबॉडी आधारित पता लगाने को कैसे प्रभावित करता दिखा। इस प्रकार, हम इस कदम को बाहर निकालने और axonal counterstaining एंटीबॉडी का उपयोग शामिल अगर केवल गर्मी प्रेरित unmasking प्रदर्शन करने का निर्णय लिया। (चित्रा -2 और डी) दिखाया गया है, कोलीनर्जिक एक्सोन एक विरोधी चैट एंटीबॉडी के साथ कल्पना और Atf4 mRNA के कणिकाओं प्रोटीज पाचन परहेज detectable थे जा सकता है। Atf4 mRNA की सकारात्मक पता लगाने नकारात्मक जांच से प्राप्त पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पर आधारित है कि ध्यान दें। एक अतिरिक्त नियंत्रण RNases के साथ मस्तिष्क के नमूने के इलाज और उनकी विशिष्टता का परीक्षण करने के क्रम में माउस Atf4 जांच के साथ उन्हें जांच कर रही द्वारा इस बिंदु पर शामिल किया जा सकता है। यह कदम, लेकिन जब से यहाँ पर चर्चा की प्रक्रियाओं में शामिल नहीं हैइस एक ही प्रौद्योगिकी, माउस हिप्पोकैम्पस 18 में siRNA इंजेक्शन के बाद एक्सोन में Atf4 mRNA की एक पूरी रिक्तीकरण का उपयोग कर पिछले सबूत दिखाने के लिए,। इस तरह के परिणाम का यहां इस्तेमाल किया ISH जांच की विशिष्टता प्रदर्शित करता है। नकारात्मक जांच के अलावा अन्य नियंत्रणों का उपयोग करते हैं, विशेष रूप से वैज्ञानिक सवालों के जवाब के आधार पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए। अंत में, गर्मी प्रेरित पुनः प्राप्ति द्वारा प्रतिस्थापित या अक्षतंतु counterstaining के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की आवश्यकताओं के आधार पर प्रोटीज प्रेरित unmasking के साथ जोड़ा जा सकता है। एक या अन्य प्रक्रिया या दोनों के संयोजन का उपयोग करने का विकल्प अनुभव से उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।

मानव मस्तिष्क के नमूनों में protease- और गर्मी प्रेरित unmasking करते समय, ऊतकीय रंगों एंटीबॉडी आधारित axonal counterstaining स्थानापन्न कर सकते हैं। यहाँ पीछा मूल प्रोटोकॉल 30 counterstaining ऊतक के लिए hematoxylin के उपयोग का पता चलता है, इस तरह की डाई अक्षतंतु धुंधला के लिए उपयुक्त नहीं है। इस प्रकार, luxol एफएएसटी नीले मेलिनकृत एक्सोन दाग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और cresyl बैंगनी neuronal सेल निकायों कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। भेदभाव अनुकूलित है अगर KLUEVER और Barrera 31 द्वारा विकसित LFB, यह कम से कम 2 घंटे में पूरा किया जा सकता है, क्योंकि अन्य दाग पर चुना गया था और (चित्रा -3 सी-एफ) हल्के नीले रंग के दाग के रूप में अंधेरे में दिखाई देते हैं कि mRNA के granules के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है भूरे-काले डॉट्स। 90 मिनट - (चित्रा 3) के रूप में दिखाया 60 के लिए 60 ओ सी पर नमूने incubating जब, इष्टतम LFB counterstaining पूरा किया जा सकता है। हालांकि यह भेदभाव सावधानी से नजर रखी जा सकता है और mRNA कणिकाओं हमेशा दिखाई दे रहे हैं ताकि ऊष्मायन चरणबद्ध किया जाता है की सिफारिश की है। इस तरह इस रिपोर्ट में चुना थपका आधारित वर्णजनीय प्रतिक्रिया के साथ संगत नहीं किया जा सकता है कि 36 धुंधला Bielchowsky या Bodian की चांदी धुंधला उपज भूरे काले अक्षतंतु के रूप में अन्य ऊतकीय तकनीक। इसी तरह, ऐसे धुंधला तकनीक शाही सेना CISH assays के साथ जोड़ा जाना चाहिएऐसी है कि तेजी से लाल या एचआरपी 30 हरे रंग के रूप में वैकल्पिक रंगों के उपयोग की अनुमति देते हैं। शाही सेना ISH के assays के और axonal दाग का उचित संयोजन का चयन अनुभव से उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।

प्रोटीज पाचन किया जाता है अगर इस रिपोर्ट में वर्णित पहली प्रक्रिया की एक सीमा immunohistochemistry द्वारा असफल प्रोटीन का पता लगाने के लिए है। इस सीमा प्रोटीज प्रेरित unmasking से बचने के द्वारा दूर किया जा सकता है। गर्मी प्रेरित unmasking प्रदर्शन कर axonally स्थानीयकृत Atf4 की विशेष मामले में कोलीनर्जिक एक्सोन में पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर mRNA के कणिकाओं का पता लगाने के लिए पर्याप्त था। हालांकि यह आवश्यक हो सकता है ब्याज और प्रोटीज पाचन के अन्य mRNAs के लिए मामला नहीं हो सकता है। यदि हां, तो axonal counterstaining यहाँ वर्णित विरोधी चैट एंटीबॉडी के अलावा अन्य एंटीबॉडी का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल की धारा 2 में वर्णित के रूप में वैकल्पिक रूप से, एंटीबॉडी आधारित counterstaining ऊतकीय रंगों से प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

30 हरे रंग की तेजी से लाल या एचआरपी के रूप में एक brightfield माइक्रोस्कोप के तहत ब्याज की mRNAs का पता लगाने के लिए उपलब्ध अन्य रंजक, वहाँ रहे हैं।

प्रोटोकॉल खंड में कहा गया है, दोनों प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण कदमों में से एक गर्मी प्रेरित unmasking है। उबलते एक माइक्रोवेव में किया जाता है, तो उपकरण की विशेषताओं के आधार पर समाधान के वाष्पीकरण की संभावना है। समाधान वाष्पीकरण से बचने के लिए 1.2.3 और 2.2.4 में निर्दिष्ट चरणों का पालन करें। Unmasking की अचल जमे हुए ऊतक 10 मिनट पर्याप्त होना चाहिए के लिए, आयल के लिए जबकि एम्बेडेड15 मिनट के लिए उबलते ऊतकों की सिफारिश की है। नमूने की सिफारिश की समय के लिए लगातार फोड़ा नहीं है, तो इस आंशिक unmasking में परिणाम हो सकता है। हालांकि इस तरह के एक चावल कुकर या एक गर्म थाली के रूप में अन्य उपकरणों के बजाय एक माइक्रोवेव के लिए चुना जाता है तो कई बार थोड़ा भिन्न हो सकता है। उबलते अवधि पद्धति पर निर्भर करता है, उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।

एक और महत्वपूर्ण कदम LFB counterstaining है। यह नीले रंग की तीव्रता mRNA के कणिकाओं के दृश्य के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि महत्वपूर्ण है। मूल प्रोटोकॉल 31 के लिए कुछ संशोधनों जैसे तापमान (चित्रा 3 ए) या ​​ऊष्मायन समय (डेटा) नहीं दिखाया घटते के रूप में, डाई की तीव्रता को कम करने के क्रम में प्रदर्शन किया गया, लेकिन हम स्पष्ट रूप से मानव मस्तिष्क के नमूनों में मेलिनकृत एक्सोन भेद करने में विफल रहा है । दूसरी ओर, सुझाव तापमान (60 ओ सी) पर LFB समाधान में नमूने incubating मेलिनकृत axons की इष्टतम धुंधला में हुई। यहहालांकि counterstaining कदम सावधानी से 2.2.28-2.2.36 में निर्दिष्ट के रूप में LFB ब्याज की mRNA मुखौटा नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए सभी समय पर शाही सेना कणिकाओं की उपस्थिति की निगरानी चरणबद्ध किया जाता है की सिफारिश की है।

अंत में, नमूने के बाहर सूखी नहीं करना चाहिए। इस रिपोर्ट में वर्णित विधि अभिकर्मक वाष्पीकरण की संभावना बढ़ जाती है, जो 40 ओ सी, पर कई ऊष्मायन कदम शामिल। प्रोटोकॉल में कहा गया है, नमूने वाष्पीकरण से बचने के लिए सभी कदम में parafilm के साथ कवर किया जाना चाहिए।

सारांश में, उच्च संकल्प शाही सेना ish और अन्य ISH के तरीकों के विकास के vivo में वयस्क एक्सोन के लिए स्थानीय उन सहित कम प्रचुर मात्रा में टेप, के दृश्य सक्षम कर रहे हैं। यह अगर वे translationally निष्क्रिय माना जाता था के रूप में काफी अनदेखी की थी वयस्क एक्सोन में कई वर्षों mRNA के लिए स्थानीयकरण और अनुवाद के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

अंत में हम एक उपन्यास और जनसंपर्क पेशAtf4 का पता लगाने और स्तनधारी मस्तिष्क के वयस्क एक्सोन में संभावित कई अन्य mRNAs के लिए प्रौद्योगिकी omising। RNAscope mRNA के स्थानीयकरण पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा होगी और vivo में उनके स्थानीय अनुवाद की जैविक महत्व को जानने में मदद मिलेगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) Advanced Cell Diagnostics - probe
custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) Advanced Cell Diagnostics - probe
negative control probe-DapB Advanced Cell Diagnostics 310043 probe
positive control probe-mouse Polr2A (optional) Advanced Cell Diagnostics 312471 probe
positive control probe-human PPIB (optional) Advanced Cell Diagnostics 313901 probe
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) Advanced Cell Diagnostics 320850 in situ hybridization kit
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) Advanced Cell Diagnostics 310035 in situ hybridization kit
Goat polyclonal anti-ChAT antibody Millipore AB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit American MasterTech KTLFB
Clearify clearing agent (xylene substitute) American MasterTech CACLEGAL
ProLong Gold mounting  medium with DAPI Life Technologies P36935
DPX mounting medium Sigma 6522

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 100 mRNA के स्थानीयकरण एक्सोन, RNAscope, वयस्क मस्तिष्क
उच्च संकल्प का उपयोग मस्तिष्क वर्गों में Axonally स्थानीयकृत mRNAs का पता लगाने<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C.,… More

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (100), e52799, doi:10.3791/52799 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter