Abstract
mRNAs são freqüentemente localizada axônios vertebrados e sua tradução local é necessário para pathfinding axônio ramificação ou durante o desenvolvimento e para a manutenção, reparação ou neurodegeneração em períodos postdevelopmental. Análises de alto rendimento revelaram recentemente que os axônios têm um transcriptoma mais dinâmico e complexo do que o anteriormente esperado. Estas análises, no entanto, têm sido feitas principalmente em neurónios em cultura, onde axónios podem ser isolados a partir dos compartimentos somato-dendrítico. É virtualmente impossível de alcançar tal isolamento em tecidos completos in vivo. Assim, a fim de verificar o recrutamento de ARNm e a sua relevância funcional num animal inteiro, análises transcriptoma devem, idealmente, ser combinadas com as técnicas que permitem a visualização de ARNm in situ. Recentemente, as novas tecnologias ISH que detectam ARN a um nível de uma única molécula têm sido desenvolvidos. Isto é especialmente importante quando se analisa a localização subcelular de ARNm, Uma vez que os ARN são localizados, tipicamente encontrada em níveis baixos. Aqui, descrevemos dois protocolos para a detecção de ARNm axonally-localizadas utilizando um novo ultra-sensível tecnologia de RNA ISH. Nós combinamos RNAscope ISH com counterstain axonal usando imuno-histoquímica de fluorescência ou corantes histológicos para verificar o recrutamento de ATF4 mRNA para axônios in vivo no rato maduro e cérebros humanos.
Introduction
Recrutamento mRNA axonal e tradução local permitir axônios de responder a estímulos extracelulares de uma forma temporal e espacialmente aguda 1. Síntese da proteína intra-axonal é melhor compreendida no contexto de neurodesenvolvimento, onde ele desempenha um papel crucial no crescimento do cone de comportamento 2-8, 9-11 pathfinding axonal retrógrado e sinalização 12,13. Mas muito menos se sabe sobre o significado funcional da síntese de proteínas axonal em neurónios pós-desenvolvimento, quando os níveis de mRNA e ribossomas axonal são muito reduzidas 14,15. Axônios vertebrados maduros têm sido pensado para ser traducionalmente inativo 16. No entanto, estudos recentes indicam que a tradução local é reativado em axônios maduras em condições patológicas. Por exemplo, um subconjunto de mRNAs é recrutado para axónios em regeneração após a lesão do nervo e a síntese de proteínas intra-axonal é necessária para a regeneração de axónios correcta destes 17. Além disso, o nosso grupo has demonstrou que mRNAs específicos são recrutados para os axônios após exposição local à doença de Alzheimer peptídeo Aâ 1-42, e tradução local do ATF4 fator de transcrição é necessária para propagar os efeitos neurodegenerativos de Ap 1-42 de axônios para a soma neuronal 18. Finalmente, análises de alto rendimento têm revelado que os axônios maduros têm um transcriptoma mais complexo e dinâmico do que o esperado 18-21, especialmente sob condições patológicas. À luz destes estudos, um método altamente sensível e específico para a detecção de mRNAs axonally localizados no sistema nervoso adulto é necessária.
Grande parte do trabalho sobre recrutamento mRNA e tradução local em axônios maduras foi realizada em neurônios cultivados. Isto é especialmente verdadeiro para as análises do transcriptoma de cultura uma vez que não existem métodos especializados que permitem o isolamento de axónios do compartimento da somato-dendrítico 18-20. Embora esses estudos tenham dado ins valiososight para o papel da tradução local em axônios maduros, a questão de saber se neurônios cultivados representam fielmente a situação in vivo ou se o recrutamento mRNA é uma resposta adaptativa dos axônios para condições de cultura ainda está aberta. Poucos estudos têm fornecido evidências de recrutamento mRNA para amadurecer axônios in vivo. Por exemplo, o transcrito que codifica para a proteína marcadora olfactiva tem sido detectada em axónios em neurónios sensoriais adultos 22. Um transgene contendo 3 'UTR do mRNA β-actina é transportado para axónios em neurónios do sistema nervoso periférico e central, nos ratinhos, e é localmente traduzido após períodos de desenvolvimento 23. Lamin b2 mRNA é localizada axônios da retina em Xenopues laevis girinos e seu esgotamento afeta manutenção axônio após o desenvolvimento axonal 21. Interferência com o transporte axonal do ARNm que codifica para o citocromo C oxidase IV altera o comportamento do rato 24. Finalmente, ATF4 ARNm é encontrado em um adultoXONs de ratos e cérebros humanos no contexto de Ap 1-42 induzida neurodegeneração 18.
Transcriptoma análises de alto rendimento têm provado ser útil para identificar perfis de mRNA em axônios isolado in vitro, mas tem limitações para estudos in vivo uma vez que em tecidos completos axônios nunca são encontrados isoladamente, mas misturado com corpos celulares neuronais, células gliais e outros tipos de células. Assim, essas análises têm de ser combinadas com as técnicas de imagem que confirmem a localização subcelular de mRNAs. RNA de hibridação in situ (ISH ARN) permite a detecção e a visualização de sequências de RNA específicas em células e tecidos. No entanto, os ensaios de ARN ISH originais foram adequado apenas para a identificação de ARN altamente abundantes 25, que é raramente o caso para o ARNm axonally localizadas. Para as últimas décadas crescentes esforços têm sido postas em desenvolvimento novas tecnologias que permitem a detecção de ARNm no nível de uma única molécula
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Protocol
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo IACUC da Universidade de Columbia e orientações aplicáveis para o cuidado e uso de animais de laboratório foram seguidas. Nota: Prepare todos os buffers utilizados para os procedimentos ISH em água RNase ou tratada com DEPC. Esta recomendação não é estritamente necessário após ISH foi concluída, mas sugere-se que buffers ainda são preparadas com água bidestilada autoclavado e / ou esterilizado por filtragem.
1. Detecção de ATF4 mRNA localizada Cholinergic axônios no Adulto do rato do cérebro usando fluorescência Hibridização In Situ (FISH) Seguido por imuno-histoquímica
- Preparação de amostras para fatias de cérebro congeladas fixo-paraformaldeído
- Por exemplo a seguir, preparar fatias de cérebros de camundongos congelados fixos.
- Resumidamente, sacrificar ratos nove meses de idade, pela anestesia com cetamina (100 mg kg -1 de peso corporal) e xilazina (10 mg kg -1 weig corpoHT) seguido por infusão transcardial de 4% de paraformaldeído em PBS (pH 7,4).
- Remover cérebros e pós-correção em paraformaldeído a 4% durante 24 horas a 4 o C.
- Após a fixação, lavar as amostras três vezes em PBS e cryoprotect em 30% de sacarose em PBS (pH 7,4) durante 24 horas a 4 o C.
- Cérebros Incorporar em outubro congelamento composto, em série na seção de 20 um em um criostato e montar em poli-D-lisina tratados lâminas de microscópio. Mantenha fatias do cérebro a -20 ° C até o uso.
- Remover fatias do cérebro fixadas com paraformaldeído a partir do congelador e secar ao ar durante 30 min à TA.
- Lavar três vezes com PBS 1x.
- Numa hotte, re-fixar fatias do cérebro do 20 min com 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente.
NOTA: CUIDADO: 4% de paraformaldeído é tóxico e devem ser manuseados e descartados apropriadamente seguindo os protocolos de segurança. - Lavar três vezes com PBS 1x.
- Desidratar fatias de cérebro.
- Prepare a 50%, 75% e 100%soluções de etanol.
- Imergir as lâminas em etanol a 50% durante 5 min à TA.
- Imergir as lâminas em etanol a 75% durante 5 min à TA.
- Imergir as lâminas em etanol a 100% durante 5 min à TA.
- Imergir as lâminas em fresco etanol a 100% durante 5 min à TA. Nota: Em alternativa, as lâminas podem ser armazenadas em etanol a 100% a -20 ° C até 1 mês.
- Por exemplo a seguir, preparar fatias de cérebros de camundongos congelados fixos.
- Teste FISH seguido de imunohistoquímica usando induzida pelo calor antígeno / desmascaramento RNA
- Antes de começar preparar todo o material necessário:
- Aqueça o forno de hibridação a 40 ° C e colocar num tabuleiro contendo água destilada no forno para criar um ambiente humidificado.
- Pegue uma caixa de slides e colocar toalhas de papel embebido em água destilada para dentro para umidificar a caixa de slide. Coloque a caixa de slides no forno de hibridização.
- Remover as sondas (ambos sondas negativos e de destino) de geladeira e aqueça-os no forno de hibridação para 10 min. Deixe esfriar as sondas down à temperatura ambiente.
- Equilibrar reagentes de amplificação AMP 1-4 (incluídos no kit de reagentes multiplex fluorescente) à TA.
- Preparar a solução de recuperação de antigénio de: citrato de sódio 10 mM (pH 6), 0,05% de Tween 20. Nota: A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente indefinidamente e ser utilizado para a coloração futuro.
- Preparar o tampão de lavagem 1x diluição da solução estoque 50x (incluídos no kit de reagentes multiplex fluorescente) em água isenta de RNase ou tratada com DEPC.
NOTA: 1x tampão de lavagem pode ser armazenado à temperatura ambiente durante 1 mês e ser utilizado para a coloração futuro. Tampão de lavagem 50x pode precipitar. Se assim for, o calor 50x tampão de lavagem a 40 ° C durante 10 min antes da preparação da solução 1x.
- Retirar as lâminas a partir de etanol a 100% e ar seco, durante 5 min à TA.
- Prepare um frasco coplin contendo 50 ml de solução de recuperação antigênica. Imergir as lâminas em solução de recuperação antigênica e ferva-os durante 10 minutos em um forno de microondas.
NOTA: Como alternativa lugar desliza horizontalmente em um 100 milímetrosdiâmetro prato de vidro redondo contendo 100 ml de solução de recuperação.- Encha um copo de 1 L com água destilada e colocá-lo no microondas.
NOTA: A água vai "tampão" o calor quando se realiza desmascaramento. - Colocar as lâminas em solução de recuperação antigênica dentro do microondas. Ferva desliza em potência alta por 5 min. Imediatamente após amostras pararam de ebulição, calor desliza novamente em alta potência para extra de 5 min.
- Esfriar lâminas à temperatura ambiente.
NOTA: passo crítico: ebulição duração e procedimento deve ser determinada pelo utilizador, dependendo das características de micro-ondas. Quanto mais rápido a ebulição começa maiores as chances de solução de evaporação. Neste caso recomenda-se que as amostras são fervidas durante períodos de tempo mais curtos do que mais duas vezes para completar um tempo de desmascaramento total de 10 min. Pelo contrário, se o aquecimento realizado a potência média ou baixa, desmascaramento pode ser realizada uma vez durante 10 min. No entanto, se as amostras não ferver continuously para um total de cerca de 10 min, isto pode resultar em desmascaramento parcial de ambos os ARN alvo e proteína a ser detectada.
- Encha um copo de 1 L com água destilada e colocá-lo no microondas.
- Lave as lâminas três vezes com PBS 1x.
- Adicionar 2-3 gotas (~ 100? L) de sonda dapB definida como aquelas fatias do cérebro utilizadas para avaliar a coloração de fundo. Nota: O conjunto de sonda dapB tem como alvo um gene bacteriano e não deve reconhecer qualquer RNA mamíferos.
- Adicionar 2-3 gotas de direccionamento a sonda definida como aquelas fatias do cérebro utilizadas para detectar o ARN de interesse. Nota: um conjunto de sondas alvo resíduos de 20 - 1381 do rato ATF4 ARNm é utilizado neste exemplo.
- Lâminas de cobertura com parafilme para evitar a evaporação da sonda, colocá-los na caixa de slides umidificado dentro do forno de hibridação e incubar-los a 40 o C durante 2 horas.
NOTA: OPCIONAL: fatias de cérebro adicionais podem ser hibridados com um conjunto sonda segmentação do mouse Polr2A e utilizados como controlos positivos. - Wash SLIdes duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 1-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 2-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação de AMP 3-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 4-FL para cada fatia do cérebro, cobrir slides com parafilme, colocá-los noCaixa de lâminas e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente e duas vezes com PBS 1x.
- Adicionar 100-200 ul (ou volume suficiente para cobrir completamente as fatias) de uma solução de bloqueio contendo 3 mg / ml de BSA, 100 mM de glicina e 0,25% de Triton X-100 em PBS (pH 7,4) às lâminas, cobri-los com parafilme e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 100-200 ul de anticorpo anti-ChAT em solução diluída (1/100) para as lâminas de bloqueio, cobri-los com parafilme e incubar durante 2 dias a 4 o C. Certifique-se de que fatias de cérebro não sequem. Se necessário, re-aplique a solução de anticorpo anti-chat para fatias de cérebro de 24 horas após a incubação.
- Lave as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente.
- Adicione 100-200 ul do anticorpo secundário Alexa conjugado apropriado (. Por exemplo, Alexa-594 burro anti-cabra para este exemplo particular) para os slides, cubra com filme plástico e incubcomeu durante 1 h à TA.
- Lave as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente.
- Lavagem das lâminas uma vez com água destilada.
- Mount slides com meio de montagem contendo DAPI.
- Visualize fatias de cérebro sob um microscópio de fluorescência.
- Antes de começar preparar todo o material necessário:
2. Detecção de ATF4 mRNA localizado para axônios em amostras de cérebro usando Chromogenic Hibridização In Situ (CISH) Seguido por Luxol rápido azul e violeta Cresyl contracoloração
- A preparação da amostra para amostras de cérebros humanos embebidos em parafina e fixados em formalina
- Fatias Asse em forno seco a 60 ° C durante 1 hora.
- Desparafinar fatias de cérebro em um exaustor.
NOTA: CUIDADO: Os reagentes são tóxicos e deve ser manuseado e descartado seguindo as diretrizes de segurança apropriadas- Imergir as lâminas em xileno agente de compensação alternativa duas vezes durante 10 minutos.
- Imergir as lâminas em etanol a 100%, duas vezes durante 1 min.
- UMAIR-seco fatias 5 min à TA. NOTA: Como alternativa amostras pode ser seco a temperatura ambiente O / N, mas deve ser utilizada dentro de 24 horas.
- Diaminobenzidina (DAB) à base de ensaio ISH cromog�ico seguido por Luxol rápido mancha azul violeta e cresyl usando induzida protease-induzida pelo calor e RNA desmascaramento
- Antes de começar preparar os materiais necessários:
- Aqueça o forno de hibridação a 40 ° C e colocar num tabuleiro contendo água destilada para criar um ambiente humidificado.
- Pegue uma caixa de slides e colocar toalhas de papel embebido em água destilada para dentro para umidificar a caixa de slide. Coloque a caixa de slides no forno de hibridização.
- Prepare 1x Pretreat 2 por diluição da solução estoque 10x (incluídos no kit de reagentes CISH) em água isenta de RNase ou tratada com DEPC. Se o pré-tratamento é realizado em uma placa quente, adicionando 100 ml de solução de pré-tratamento para um prato de 100 mm de diâmetro de vidro para aumentar a superfície de contacto entre o prato e a placa quente (pré-tratamento seé realizada em um forno de microondas, um frasco Coplin pode ser usado em vez conforme especificado no ponto 1.2.3). Solução de aquecimento para 100 ° C e mantê-lo não mais de 30 min a ferver antes de submergir amostras.
- Calor sondas positivos e negativos 10 min a 40 o C e arrefecer à temperatura ambiente.
- Equilibrar reagentes de amplificação AMP 1-6 (incluídos no kit de reagentes CISH) à TA.
- Preparar o tampão de lavagem 1x diluição da solução estoque 50x (incluído no Kit de Reagentes CISH) em água destilada. Nota: 1x tampão de lavagem pode ser armazenado à temperatura ambiente durante 1 mês e ser utilizado para a coloração futuro.
- Adicionar ~ 4 gotas (~ 120 ul) de um Pré-tratar a cada fatia de cérebro, cobrir com parafilme e incubar à TA durante 10 min.
- Lavar 3 a 5 vezes em água destilada fresca.
- Execute desmascaramento induzida pelo calor:
- Lâminas de transferência para quente Pretreat 2 (incluído no Kit de Reagentes CISH) de solução e deixe ferver por 15 minutos. Nota: Ebulição pode ser executada em um prato quente assegurandoebulição contínua ou em um forno seguindo os passos críticos especificados no ponto 1.2.3).
- Imediatamente transferir lâminas para água destilada e lava-se 3-5 vezes.
- Lavagem das lâminas de 3 a 5 vezes em fresco etanol a 100%.
- Fatias de ar seco 5 min a RT. Nota: Em alternativa pode ser seco fatias O / N.
- Realizar desmascaramento induzida por protease:
- Adicionar 4 gotas de 3 Pré-tratar (incluído no Kit de Reagentes CISH), cobrir com parafilme e incubar 30 min a 40 ° C no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas de 3 a 5 vezes em água destilada fresca.
- Adicionar 4 gotas da sonda dapB definido para essas fatias do cérebro utilizadas para avaliar a coloração de fundo.
- Adicionar 4 gotas da sonda alvo definido para essas fatias do cérebro utilizadas para detectar o ARN de interesse.
NOTA: Um conjunto de sonda alvo resíduos de 15 - 1256 do ATF4 ARNm humano é utilizado neste exemplo. OPCIONAL: fatias de cérebro adicionais podem ser hybridized com um conjunto de sonda alvo PPIB humano e utilizado como controle positivo. - Colocar as lâminas na caixa de corrediça e incubar durante 2 horas. a 40 ° C no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 4 gotas de AMP um reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 4 gotas de AMP 2 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 4 gotas de reagente de AMP 3 para cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas duas vezes com 1x erah tampão durante 2 minutos à TA.
- Adicionar 4 gotas de AMP 4 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 4 gotas de AMP 5 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme e incubar 30 min a RT.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 4 gotas de AMP 6 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme e incubar 15 min a RT.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
- Misturar um volume igual de BROWN-1 e BROWN-2 reagentes (incluído no Kit de Reagentes CISH), adicione ~ 120 ml de solução para cada fatia do cérebro, cubra com parafilme e incubar 10 minutos à temperatura ambiente.
- Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente e enxaguar uma vez em água destilada.
NOTA: As etapas críticas: as seguintes etapas são fundamentais paraobter uma contracoloração axonal óptima sem mascarando a presença de grânulos de ARN. - Antes de executar counterstain verificar a presença de mRNA de interesse sob um microscópio de campo claro. Definir zonas de referência em amostras de cérebro nas quais a monitorizar a presença de pontos lacrimais durante todo o procedimento de contraste.
- Pré-aqueça o Luxol rápido solução de azul a 60 o C.
- Colocar as lâminas em Luxol azul rápido e incubar 30 min a 60 o C.
- Lavar várias vezes em água destilada.
- Dip slides para várias vezes em solução de carbonato de lítio 0.05% para iniciar a diferenciação.
- Dip desliza duas vezes em fresco etanol a 75%.
- Enxágüe em água destilada.
- Verifique fatias de cérebro sob um microscópio de campo claro. Note-se que a matéria cinzenta e branca deve começar a ser distinguíveis grânulos e RNA ainda visíveis como azul escuro / puncta preto. Verifique se axónios começam a aparecer como fibras de luz azul.
- Repita os passos 2.2.28 a 2.2.32. Perform incubações com Luxol solução de azul rápido em 10-20 mínimo de etapas, acompanhando atentamente a counterstain ea presença de grânulos de RNA. Nota: Tipicamente, contracoloração óptima é adquirido em 60 - 90 minutos (tempo total de incubação), mas o tempo pode ser encurtado se suspeita-se que os grânulos de ARN pode ser mascarado pela Luxol rápido mancha azul (ver Figura 2 para os exemplos).
- Incubar as lâminas em solução de violeta de cresilo, durante 10 min à TA.
- Lavar as lâminas em água destilada.
- Dip slides para 5 a 10 vezes em etanol a 70%.
- Desidratar fatias do cérebro através de 3 mudanças rápidas de etanol a 100%.
- Numa hotte, fatias de cérebro claras através da incubação de duas vezes em xileno agente de remoção alternativa, durante 2 minutos e uma terceira vez durante 5 min à TA.
- Mount fatias cerebrais em meio de montagem permanente à base de xileno.
- Analisar amostras sob um microscópio de campo claro.
- Antes de começar preparar os materiais necessários:
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Representative Results
Uma breve resumo dos procedimentos descritos acima é mostrado na Figura 1.
Detecção óptima de mRNA ATF4 grânulos em axónios colinérgicos usando desmascaramento induzida por calor
Ao avaliar a localização axonal de ARNm, que é crítico para ser capaz de identificar os axónios e para ser capaz de visualizar baixas RNAs abundantes. A tecnologia de ARN ISH aqui descrito permite a detecção de RNAs com uma resolução de uma única molécula. Os protocolos padrão, utilizando esta tecnologia sugerem a combinação de dois processos de desmascaramento para detectar eficientemente ARN alvo: e calor induzido desmascaramento-28 induzida por protease. No entanto, quando ISH é combinada com imuno-histoquímica para identificar os axônios, desmascaramento induzida pela protease pode não resultar na detecção de antígeno ideal 29.
No primeiro protocolo aqui descrito, a digestão da protease foi evitado, uma vez que o anticorpo utilizado não conseguiu reconhecer choline acetiltransferase (ChAT) tipicamente encontrados em axónios do giro denteado decorrentes da via septohippocampal (Figura 2A e B), embora tenham sido detectados grânulos positivos de ARNm. Recuperação com 10 mM de tampão de citrato (pH 6) induzida pelo calor, por outro lado, assegurada a integridade do epitopo reconhecido pelo anticorpo anti-ChAT e alvo de ARNm foi detectada eficientemente em axónios manchado de ChAT (Figura 2C e D). Os resultados aqui apresentados (Figura 2) mostra a presença de ATF4 no giro dentado de ratos adulto onde o recrutamento de ARNm e tradução local foram induzidas por infusão de Ap 1-42 oligómeros no hipocampo. Anterior evidência sugere que ATF4 ARNm não é detectada em axónios in vitro ou in vivo sob condições basais 18, e assim um paradigma experimental deste tipo não é mostrado.
Detecção ideal de ATF4grânulos de ARNm em axónios usando desmascaramento tanto induzida por calor e induziu-protease
Considerando que os resultados descritos acima mostram que a detecção de proteína de anticorpo com base é compatível com a tecnologia de RNA ISH ao realizar calor induzido desmascarar ele pode não ser útil se protease pré-tratamento é necessário. A Seção 2 descreve a detecção de ATF4 mRNA dentro axônios seguindo procedimentos previamente publicados 28,30 combinadas com manchas histológico normalmente utilizados para amostras cerebrais 31,32.
Um passo crítico neste procedimento é a counterstain ideal de fibras mielinizadas usando Luxol azul rápido (LFB) sem mascarar a presença de grânulos de mRNA em axônios manchadas por CISH. Os reagentes utilizados para esta finalidade permitir contracoloração óptima com LFB seguintes tempos de incubação de 60 a 90 min. Contracoloração pode falhar quando ambos os tempos e temperaturas de incubação são diminuídos (Figura 3A e inserir, e dados não mostrados) umnd embora grânulos de mRNA ainda será visível, sua localização axonal não pode ser verificada. Por outro lado, a incubação de amostras de cérebro de 60 minutos ou mais a 60 ° C, sem o controlo da presença de grânulos positivos periodicamente pode resultar em mascaramento irreversível do mRNA de interesse, o corante (Figura 3B e baixo-relevo). Assim, recomenda-se que as amostras são incubadas no LFB durante 30 minutos e ainda mais que a incubação é realizada por passos verificando as amostras a cada 10 a 20 minutos para se obter uma coloração óptima de ambos os axónios e os grânulos de ARN (Figura 3D-F). Seguindo essas orientações ATF4 grânulos positivos podem ser claramente detectados tanto no controle (Figura 3D) e doença (Figura 3F) amostras de cérebro de Alzheimer.
Fluxo de trabalho Figura 1. Resumidode ARN ISH seguido de contracoloração axonal. passos representados a preto são comuns para os dois procedimentos exemplificados. Passos destacadas em azul são específicos para amostras fixadas em paraformaldeído manchadas por ISH fluorescente enquanto aqueles destacados em vermelho são específicos para amostras embebidos em parafina fixadas em formalina manchadas por ISH cromogénico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. FISH para ATF4 ARNm localizada axónios colinérgicos no giro dentado de ratinhos adultos. FISH foi realizada utilizando induzida por protease (l painel EFT) ou desmascaramento induzida pelo calor (painel da direita), seguido por detecção de anticorpos de colina-acetiltransferase (ChAT) . O ANTIBOdy não conseguiu reconhecer ChAT quando o tratamento protease foi realizada. Exemplos de resultados obtidos com uma sonda não-alvo (dapB) eo ATF4 -targeting sonda usando as mesmas configurações de microscópio e ajustes de imagem serão mostrados. ATF4 grânulos -positivas com localização axonal claro são indicadas com pontos de interrogação, enquanto grânulos localizados são marcados como " OK ". Scale bar 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. CISH para ATF4 mRNA localizada axônios mielinizados na formação do hipocampo humano. Após ISH, axônios foram contrastadas com Luxol azul rápido (LFB) e somata neuronal foram contrastadas com violeta cresil. Coloração LFB Suboptimal pode resultar se tanto a temperatura (A e inserir representam amostras coradas com LFB a 40 o C durante 4 hrs.) E tempo de incubação (não mostrado) são diminuídos, ou quando contrastante não é verificada após períodos de incubação de curta duração (B e inserir ). Exemplos de coloração LFB ideal combinado com ISH utilizando uma sonda não-alvo (dapB) ou a sonda ATF4 -targeting são mostradas (CF e inserções). A aquisição das imagens foi ajustado automaticamente para o melhor relação sinal-ruído. ATF4 grânulos -positivas com localização axonal claro são indicadas com pontos de interrogação, enquanto grânulos localizados são marcados como "ok". Barra de escala de 50 mm, inserir 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste relatório, descreve-se a utilização de uma tecnologia de ISH alta-resolução na detecção de axonally localizada ATF4 ARNm. Estes estudos anteriores publicados e mostram que esta tecnologia é compatível com a detecção de proteína à base de anticorpo em tecidos de embriões inteiros ou mesmo 33. É importante notar que foi recentemente usada para a detecção de ARNm dentro do arco dendrites dos neurónios do hipocampo 34. Também podem ser combinados com corantes para a coloração histológica dos tecidos. Finalmente, ele é adequado para a detecção simultânea de múltiplos RNAs alvo 28,30,33. Estes resultados exemplificam a versatilidade de alta-resolução ISH tecnologias de ARN, e pequenas modificações para os protocolos originais sem diminuir a sensibilidade do presente método.
Protocolos originais que descrevem a utilização de sondas de Z-estrutura para detectar ARNm de interesse em tecidos com uma resolução única molécula sugerem dois passos para ARNm desmascarar envolvendodigestão da protease e a amostra em ebulição 30,35. Aqui nós mostramos como desmascarar negativamente induzida pela protease afeta o sucesso de detecção baseada em anticorpos de bate-papo no axónios colinérgicos decorrentes da via de septo-hipocampal (Figura 2 A e B). Assim, decidimos excluir esta etapa e executar apenas desmascaramento induzida por calor se contracoloração axonal envolveu a utilização de anticorpos. Como mostrado (Figura 2C e D), axônios colinérgicos pode ser visualizado com um anticorpo anti-ChAT e grânulos ATF4 eram detectáveis de mRNA evitando digestão protease. Note-se que a detecção positiva de ATF4 ARNm é baseada na fluorescência de fundo obtidas a partir da sonda negativa. Um controle adicional pode ser incluída neste ponto por tratamento de amostras de cérebro com RNases e sondando-los com as sondas do mouse ATF4, a fim de testar a sua especificidade. Este passo, contudo, não está incluído nos processos aqui discutidos desdemostra evidências anteriores, usando essa mesma tecnologia, uma depleção completa de ATF4 mRNA em axônios após a injecção siRNA no hipocampo de rato 18. Tais resultados demonstram a especificidade das sondas ISH utilizados aqui. O uso de controles, além das sondas negativos devem ser avaliados com base em determinadas questões científicas. Finalmente, a recuperação induzida pelo calor pode ser substituído por, ou combinado com desmascaramento induzida por proteases, dependendo dos requisitos do anticorpo utilizado para contracoloração axónio. A opção de utilizar um ou outro processo ou a combinação de ambos devem ser empiricamente determinadas pelo utilizador.
Ao realizar protease- e desmascaramento induzida por calor em amostras de cérebro humanos, corantes histológicos pode substituir à base de anticorpos counterstaining axonal. Embora o protocolo original aqui seguido sugere o uso de tecido com hematoxilina para contracoloração 30, tal corante não é adequado para a coloração do axónio. Assim, fas Luxolt azul foi utilizado para corar axónios mielinizados e violeta de cresilo foram usados para visualizar os corpos celulares neuronais. LFB, desenvolvido por Kluever Barrera e 31, foi escolhido em detrimento de outras manchas, porque pode ser completada em menos de 2 horas e, se a diferenciação é optimizado (Figura 3C-F), a mancha de luz azul não interfiram com os grânulos de ARNm que aparecem como escuro pontos marrom-pretas. Como mostrado (Figura 3), A contracoloração LFB óptima pode ser conseguida quando a incubação a 60 ° C durante 60-90 min. No entanto, é recomendável que a incubação é realizada por passos, de modo que a diferenciação pode ser cuidadosamente controlada e grânulos de ARNm são sempre visíveis. Outras técnicas histológicas tais como rendimento coloração de prata axônio cinza-escuro da de Bielchowsky ou Bodian coloração 36, que pode não ser compatível com a reacção cromogénica baseada DAB escolhido neste relatório. , Tais técnicas de coloração prováveis deve ser combinada com ARN CISH ensaiosque permitem a utilização de corantes alternativos, tais como o vermelho ou verde HRP 30 rápido. Escolhendo uma combinação apropriada de ARN e ensaios de manchas ISH axonais deve ser determinado empiricamente pelo utilizador.
Uma limitação do primeiro procedimento descrito no presente relatório é a detecção de proteínas vencida por imuno-histoquímica se digestão protease é realizada. Esta limitação pode ser superada, evitando desmascaramento induzida por protease. No caso particular de ATF4 axonally-localizada realizando desmascaramento induzida pelo calor foi suficiente para detectar grânulos de mRNA acima dos níveis de fundo em axónios colinérgicos. Este, porém, pode não ser o caso de outros mRNAs de interesse e digestão protease pode ser necessária. Se assim for, contracoloração axonal deve ser realizada utilizando outros do que o anticorpo anti-ChAT aqui descritos anticorpos. Alternativamente, counterstaining à base de anticorpos pode ser substituído por corantes histológicos como descrito na seção 2 do protocolo.
30.
Tal como indicado na secção de protocolo, um dos passos críticos de ambos os processos é o desmascaramento induzida pelo calor. Se a ferver é realizada em um forno de microondas, existem possibilidades de solução evaporação, dependendo das características do dispositivo. Siga as etapas especificadas em 1.2.3 e 2.2.4 para evitar solução de evaporação. Para congelado fixo tecido 10 min de desmascaramento deve ser suficiente, enquanto para embebidos em parafinatecidos em ebulição durante 15 minutos é recomendado. Se as amostras não ferver continuamente durante o tempo recomendado isso pode resultar em desmascaramento parcial. No entanto vezes pode variar ligeiramente se outros dispositivos, como uma panela de arroz ou um prato quente são escolhidos em vez de um forno de microondas. Duração de ebulição deve ser determinada pelo utilizador, dependendo do método.
Outro passo crítico é o counterstaining LFB. É importante que a intensidade do corante azul não interferir com a visualização dos grânulos de ARNm. Algumas modificações no protocolo original 31 foram realizados a fim de reduzir a intensidade do corante, tal como diminuir a temperatura (Figura 3A) ou o tempo de incubação (dados não apresentados), no entanto, não conseguiram distinguir claramente axónios mielinizados em amostras de cérebro humanos . Por outro lado, a incubação das amostras em solução LFB à temperatura sugerido (60 ° C) resultou na coloração óptima de axónios mielinizados. IstoNo entanto, é recomendado que counterstaining é realizado por etapas monitorando cuidadosamente a presença de grânulos de RNA em todos os momentos para garantir que LFB não mascara o mRNA de interesse, tal como especificado nas etapas 2.2.28-2.2.36.
Finalmente, as amostras nunca deve secar. Os métodos descritos no presente relatório envolvem múltiplos passos de incubação a 40 ° C, o que aumenta as possibilidades de evaporação do reagente. Tal como referido nos protocolos, as amostras devem ser cobertas com parafilme em todos os passos para evitar a evaporação.
Em resumo, o desenvolvimento de alta-resolução ARN ISH e outros métodos são ISH permitindo a visualização dos transcritos abundantes de baixo, incluindo aqueles localizada axónios adultos in vivo. Isto é especialmente importante desde há muitos anos a localização mRNA e tradução em axônios adultos foi muito negligenciado por serem considerados traducionalmente inativo.
Em conclusão, apresentamos um romance e promising tecnologia para a detecção de ATF4 e potencialmente muitas outras ARNm em axónios adultos do cérebro de mamíferos. RNAscope irá facilitar estudos futuros sobre a localização mRNA e vai ajudar a desvendar o significado biológico de sua tradução local in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
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