Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52799
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

Abstract

mRNAs werden häufig Wirbel Axonen lokalisiert und ihre lokalen Übersetzung für Axon Wegfindung oder Verzweigung während der Entwicklung und für die Wartung, Reparatur oder Neurodegeneration in postdevelopmental Zeiten erforderlich. Hochdurchsatz-Analysen haben kürzlich ergeben, dass Axone haben ein dynamischer und komplexer Transkriptom als bisher erwartet. Diese Analyse jedoch wurde meist in kultivierten Neuronen, wo Axone aus den somato-dendritischen Fächern isoliert werden getan. Es ist praktisch unmöglich, eine solche Isolation in ganze Gewebe in vivo zu erreichen. So um die Rekrutierung von mRNAs und ihre funktionelle Relevanz in einem ganzen Tier überprüfen, Transkriptom Analysen sollten im Idealfall mit Techniken, die die Visualisierung von mRNAs in situ ermöglichen kombiniert werden. In jüngster Zeit neuartige ISH Technologien, die RNAs in einer Einzelmolekülebene zu erfassen, wurden entwickelt. Dies ist besonders wichtig bei der Analyse der subzellulären Lokalisierung von mRNADa lokalisierten RNAs werden in der Regel in geringen Mengen gefunden. Hier beschreiben wir zwei Protokolle zur Detektion axonally lokalisierte mRNAs unter Verwendung eines neuen hochempfindlichen RNA ISH Technologie. Wir haben RNAscope ISH mit axonalen Gegenfärbung in Kombination mit Fluoreszenz Immunhistochemie oder histologische Farbstoffe, um die Rekrutierung von ATF4 mRNA um Axone in vivo in der reifen Maus und menschliche Gehirne zu überprüfen.

Introduction

Axonalen mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung ermöglichen Axone auf extrazelluläre Reize in einem zeitlich und räumlich akuten Weise 1 reagieren. Intra-axonale Proteinsynthese wird am besten im Zusammenhang mit der Entwicklung des Nervensystems, wo sie eine entscheidende Rolle bei Wachstumskegel Verhalten 2-8 spielt verstanden Axon Pathfinding 9-11 und retrograde Signalisierungs 12,13. Aber weit weniger ist über die funktionelle Bedeutung der axonalen Proteinsynthese in post-Entwicklungs Neuronen bekannt sind, wenn axonalen mRNA und Ribosom Niveaus stark verringert 14,15. Mature Wirbel Axone haben lange geglaubt, translational inaktiv 16 zu sein. Die jüngsten Studien zeigen, dass lokale Übersetzung wird in reifen Axone unter pathologischen Bedingungen reaktiviert. Zum Beispiel wird eine Untergruppe von mRNAs zu regenerierenden Axonen nach einer Nervenverletzung und intra axonalen Proteinsynthese ist für die korrekte Regeneration dieser Axone 17 erforderlich rekrutiert. Darüber hinaus unsere Gruppe has gezeigt, dass bestimmte mRNAs sind Axone rekrutiert, nachdem lokale Engagement in der Alzheimer-Krankheit Aß-Peptid 1-42, und lokale Übersetzung des Transkriptionsfaktors ATF4 ist verpflichtet, die neurodegenerative Effekte von Aß 1-42 von Axonen zu der neuronalen Soma 18 propagieren. Schließlich Hochdurchsatz-Analysen haben ergeben, dass reife Axone haben ein komplexer und dynamischer als erwartet Transkriptom 18-21, vor allem unter pathologischen Bedingungen. Im Lichte dieser Untersuchungen wurde ein hochempfindliche und spezifische Methode zum Nachweis axonally lokalisierte mRNAs im adulten Nervensystem erforderlich ist.

Ein Großteil der Arbeit an mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung in reifen Axone wurde an kultivierten Neuronen durchgeführt. Dies gilt vor allem für die Transkriptom-Analysen, da spezialisierte Kultivierungsverfahren bestehen, dass die Isolierung der Axone von der somato-dendritischen Raum 18-20 ermöglichen. Obwohl solche Studien haben wertvolle Ins gegebenight in die Rolle des lokalen Übersetzung in reifen Axone, die Frage, ob kultivierten Neuronen glaubwürdig die Situation in vivo oder mRNA Rekrutierung ist eine adaptive Reaktion von Axonen zu Kultivierungsbedingungen ist noch offen. Nur wenige Studien haben Hinweise auf mRNA Anwerbung für den Axonen in vivo fällig gestellt. Zum Beispiel hat das Transkript der olfaktorischen Markerprotein in Axonen bei erwachsenen sensorischen Neuronen 22 erfasst wurde. Ein Transgen, das die 3'-UTR von β-Actin mRNA Axonen in den peripheren und zentralen Nervensystems Neuronen in Mäusen transportiert und vor Ort nach dem Entwicklungsperioden 23 übersetzt. Lamin B2 mRNA an retinalen Axonen lokalisiert in Xenopues laevis Kaulquappen und seine Erschöpfung wirkt Axon Wartung nach axonalen Entwicklung 21. Störung des axonalen Transport der mRNA-Codierung für Cytochrom C Oxidase IV verändert Mausverhalten 24. Schließlich wird ATF4 mRNA in ein erwachsener gefundenXON-Fluß von Mäusen und menschlichen Gehirnen im Rahmen von Aß 1-42 induzierte Neurodegeneration 18.

Hochdurchsatz-Transkriptom Analysen haben sich als nützlich zu sein, um mRNA-Profilen in isolierten Axone in vitro zu identifizieren, sondern haben ihre Grenzen für die in-vivo-Studien, da im ganzen Gewebe Axone sind nie isoliert gefunden, aber mit neuronalen Zellkörpern, Gliazellen und anderen Zelltypen vermischt. Folglich müssen derartige Analysen mit bildgebenden Verfahren, die die subzelluläre Lokalisation von mRNAs bestätigen kombiniert werden. RNA in situ-Hybridisierung (RNA-ISH) erlaubt die Detektion und Darstellung von spezifischen RNA-Sequenzen, die in Zellen und Geweben. Jedoch waren ursprünglichen RNA ISH Assays nur für die Identifizierung von zahlreicheren RNAs 25, was selten der Fall axonally lokalisierten mRNAs geeignet. In den letzten Jahrzehnten zunehmenden Bemühungen in die Entwicklung neuer Technologien, die den Nachweis der mRNAs ermöglichen an der Einzelmolekülebene gesetzt 27). Der Hauptunterschied zwischen den oben genannten Techniken und das hier beschrieben wird, ist, daß die später verwendet 20 Doppel Z-Struktur (nicht linear) Sonden, die typischerweise Ziel ~ 1 kb Region der RNA von Interesse sicherzustellen Spezifität und geringem Hintergrundniveaus. Sonden werden dann mit Vorverstärker und Verstärker-Sequenzen, die schließlich fluoreszenzmarkierte oder mit Enzymen, die chromogene Reaktionen ermöglichen konjugiert hybridisiert. Diese Amplifikationsschritte Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu anderen Technologien ISH 28. Hier beschreiben wir zwei Protokolle mit RNAscope kombiniert entweder mit Fluoreszenz Immunzytochemie oder histologische Farbstoffe ermöglicht axonalen Gegenfärbung. Beide Protokolle sind geeignet zur axonalen Lokalisierung ATF4 mRNA in der Erwachsenen mo visualisierenverwenden und das menschliche Gehirn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle tierischen Verfahren wurden durch die IACUC der Columbia University und der geltenden Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt wurden befolgt. Hinweis: Bereiten Sie alle für die ISH Verfahren in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser verwendeten Puffer. Diese Empfehlung ist nicht unbedingt notwendig, nachdem ISH abgeschlossen ist, aber es wird vorgeschlagen, dass Puffer noch in autoklaviertem bidestilliertem Wasser hergestellt und / oder durch Filtern sterilisiert.

1. Nachweis der ATF4 mRNA lokalisiert Cholinerge Axone im Gehirn erwachsener Mäuse mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) durch Immunhistochemie Gefolgt

  1. Probenvorbereitung für die Para fixierten gefrorenen Hirnschnitten
    1. Für das folgende Beispiel, bereiten Scheiben von festen gefrorenen Gehirn der Maus.
      1. Kurz gesagt, zu opfern, 9 Monate alten Mäusen durch Anästhesie mit Ketamin (100 mg kg -1 Körpergewicht) und Xylazin (10 mg kg -1 Körper weigHT) von transkardialer Infusion von 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) folgte.
      2. Gehirne und post-fix in 4% Paraformaldehyd zu entfernen für 24 Stunden bei 4 o C
      3. Nach der Fixierung, Waschen Proben dreimal in PBS und in 30% cryoprotect Saccharose in PBS (pH 7,4) für 24 Stunden bei 4 ° C.
      4. Betten Sie Gehirne in OCT Einfrieren Verbindung, seriell Schnitt bei 20 & mgr; m auf einem Kryostaten und montieren auf Poly-D-Lysin behandelten Objektträgern. Halten Hirnschnitten bei -20 o C bis zur Verwendung.
    2. Entfernen Parafesthirnschnitten aus dem Gefrierschrank und der Luft trocknen für 30 min bei RT.
    3. Dreimal mit 1x PBS waschen.
    4. In einer Abzugshaube, Re-fix Hirnschnitten 20 min mit 4% Paraformaldehyd bei RT.
      HINWEIS: ACHTUNG: 4% Paraformaldehyd ist giftig und muss behandelt und entsorgt werden entsprechend folgenden Sicherheitsprotokolle.
    5. Dreimal mit 1x PBS waschen.
    6. Entwässern Hirnschnitten.
      1. Vorbereitung 50%, 75% und 100%Ethanollösungen.
      2. Einzutauchen Folien in 50% Ethanol für 5 Minuten bei RT.
      3. Einzutauchen Folien in 75% Ethanol für 5 Minuten bei RT.
      4. Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT.
      5. Einzutauchen Folien in frischem 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT. Hinweis: Alternativ können Folien in 100% Ethanol bei -20 ° C bis zu 1 Monat gelagert werden.
  2. FISH-Test, gefolgt von Immunhistochemie unter Verwendung von Hitze-induzierte Antigen / RNA Demaskierung
    1. Vor dem Start bereiten alle erforderlichen Material:
      1. Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und legen Sie eine Schale mit destilliertem Wasser in den Ofen, um eine feuchte Umgebung schaffen.
      2. Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen.
      3. Sonden (sowohl negative als auch Zielsonden) Entfernen von Kühlschrank und erwärmen diese im Hybridisierungsofen für 10 min. Lassen Sie die Proben abkühlen down bei RT.
      4. Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-4 (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) bei RT.
      5. Bereiten Antigen-Retrieval-Lösung: 10 mM Natriumcitrat (pH 6), 0,05% Tween 20 Hinweis: Lösung kann bei RT auf unbestimmte Zeit gespeichert und für zukünftige Färbung verwendet werden.
      6. Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser.
        HINWEIS: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden. 50x Waschpuffer könnte auszufällen. Wenn ja, Wärme 50x Waschpuffer bei 40 ° C für 10 Minuten vor der Herstellung der Lösung, 1x.
    2. Folien aus 100% Ethanol und Luft trocknen entfernen 5 min bei RT.
    3. Bereiten Sie eine Coplin-Gefäß mit 50 ml Antigen-Retrieval-Lösung. Tauchen Sie Folien in Antigen-Retrieval-Lösung und kochen Sie sie für 10 Minuten in einem Mikrowellenofen.
      HINWEIS: Alternativ Ort horizontal gleitet in einer 100 mmDurchmesser runde Glasschale, die 100 ml Retrieval-Lösung.
      1. Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit destilliertem Wasser und legen Sie sie in der Mikrowelle.
        HINWEIS: Das Wasser wird "Puffer" die Hitze bei der Durchführung Entlarvung.
      2. Objektträger in Antigen-Retrieval-Lösung in der Mikrowelle. Boil gleitet bei hoher Leistung für 5 Minuten. Unmittelbar nach Proben gestoppt Kochen, gleitet Wärme wieder bei hoher Leistung für zusätzliche 5 min.
      3. Cool down Folien bei RT.
        HINWEIS: kritischer Schritt: siedendem Dauer und Verfahren ist vom Anwender festgelegt werden, abhängig von den Mikrowelleneigenschaften. Je schneller das Kochen beginnt desto höher die Chancen der Lösung Verdunstung. In diesem Fall empfiehlt es sich, dass die Proben für kürzere Zeiträume mehr als zweimal, um eine Gesamt Demaskierung von 10 min abgeschlossen gekocht. Im Gegenteil, wenn der Heizbetrieb mit mittlerer oder niedriger Leistung durchgeführt wird, Demaskierung kann einmal für 10 min durchgeführt werden. Allerdings, wenn Proben nicht kochen continuously für eine Gesamtmenge von etwa 10 min wird diese in Teil Demaskierung sowohl der Ziel-RNA und Protein führen zu detektieren.
    4. Wash gleitet dreimal mit 1x PBS.
    5. In 2 - 3 Tropfen (~ 100 & mgr; l) des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt. Hinweis: Das dapB Sondensatz richtet sich an ein bakterielles Gen und sollte keine Säugetier-RNA zu erkennen.
    6. Fügen Sie 2-3 Tropfen der Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt. Hinweis: ein Sondensatz Targeting-Reste 20 - 1381 der Maus ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet.
    7. Deckgläser mit Parafilm zu Sonde Verdunstung zu vermeiden, legen Sie sie in der befeuchteten Objektträger Box in der Hybridisierungsofen inkubieren sie bei 40 ° C für 2 Stunden.
      HINWEIS: Optional: zusätzliche Hirnschnitten mit einem Sondensatz Targeting Maus Polr2A hybridisiert und als positive Kontrollen verwendet werden.
    8. Wash slides zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    9. Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 1-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen.
    10. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    11. Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 2-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen.
    12. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    13. Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 3-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen.
    14. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    15. Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 4-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in dieDia-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen.
    16. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und zweimal mit 1 × PBS.
    17. Hinzuzufügen 100-200 ul (oder genügend Volumen, um vollständig zu bedecken Slices) einer Blockierlösung, die 3 mg / ml BSA, 100 mM Glycin und 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) auf die Objektträger, bedecken sie mit Parafilm und Inkubation für 30 min bei RT.
    18. In 100 bis 200 & mgr; l Anti-ChAT-Antikörper in Blockierungslösung (1/100) auf die Objektträger verdünnt, decken Sie sie mit Parafilm und Inkubation für 2 Tage bei 4 o C Stellen Sie sicher, dass Hirnschnitten nicht austrocknen. Falls erforderlich, erneut bewerben anti-ChAT-Antikörperlösung zu Hirnschnitten von 24 Stunden nach der Inkubation.
    19. Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT.
    20. In 100 bis 200 & mgr; l der geeigneten Alexa-konjugierten Sekundärantikörper (. ZB Alexa-594 Esel anti-Ziege für dieses spezielle Beispiel) auf die Objektträger, Deckel mit Parafilm und Incubaß für 1 h bei RT.
    21. Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT.
    22. Wash gleitet einmal mit destilliertem Wasser.
    23. Berg Träger mit DAPI haltigen Eindeckmedium.
    24. Visualisieren Hirnschnitten unter dem Fluoreszenzmikroskop.

2. Nachweis von ATF4 mRNA lokalisiert, um Axone in Human Brain Proben unter Verwendung chromogener in situ Hybridisierung (CISH) von Luxol Fast Blue und Kresylviolett Gegenfärbung Gefolgt

  1. Probenvorbereitung für die Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettete menschliche Gehirnproben
    1. Bake Scheiben in einem Trockenofen bei 60 ° C für 1 Stunde.
    2. Entparaffinieren Hirnschnitten in einem Abzug.
      HINWEIS: ACHTUNG: Reagenzien sind giftig und müssen behandelt werden und verworfen folgenden die entsprechenden Sicherheitsrichtlinien
      1. Tauchen Sie Folien in Xylol alternativen Clearingstelle, zweimal für 10 min.
      2. Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol zweimal für 1 min.
      3. EINir-trockenen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ können Proben bei Raumtemperatur getrocknet werden, O / N, sondern muss innerhalb von 24 Stunden verwendet werden.
  2. Diaminobenzidin (DAB) -basierte chromogenen ISH Assay gefolgt von Luxol schnell blau und Kresylviolett Fleck mit wärmeinduzierten und Protease-induzierte RNA Demaskierung
    1. Vor Beginn der Vorbereitung benötigte Materialien:
      1. Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und setzen Sie ein Fach destilliertes Wasser, das um eine feuchte Umgebung schaffen.
      2. Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen.
      3. Bereiten 1x vorbehandeln 2 durch Verdünnen der 10x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser. Wenn Vorbehandlung auf einer heißen Platte durchgeführt wird, werden 100 ml Vorbehandlung Lösung zu einem Durchmesser von 100 mm Glasschale, um die Kontaktfläche zwischen der Schüssel und der heißen Platte zu erhöhen (falls Vorbehandlungin der Mikrowelle durchgeführt wird, kann ein Coplin-Gefäß statt dessen verwendet werden, wie in 1.2.3 angegeben). Wärme Lösung auf 100 o C und halten Sie sie koch nicht länger als 30 Minuten vor dem Untertauchen Proben.
      4. Wärme negativen und positiven Proben 10 min bei 40 ° C und Abkühlen auf RT.
      5. Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-6 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) bei RT.
      6. Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in destilliertem Wasser. Hinweis: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden.
    2. In ~ 4 Tropfen (~ 120 & mgr; l) von 1 vorbehandeln zu jeder Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
    3. 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser waschen.
    4. Führen wärmeinduzierten Demaskierung:
      1. Objektträger, um heiße vorbehandeln 2 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) Lösung und kochen für 15 Minuten. Hinweis: Boiling können auf einer heißen Platte Gewährleistung durchgeführt werdenkontinuierliche Kochen oder in der Mikrowelle folgenden kritischen Schritte in 1.2.3 angegeben).
    5. Dias zu destilliertem Wasser sofort übertragen und waschen 3 bis 5 mal.
    6. Wasch gleitet 3 bis 5 mal mit frischem 100% Ethanol.
    7. Luft trocknen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ Scheiben getrocknet werden O / N.
    8. Führen Sie Protease-induzierte Demaskierung:
      1. 4 Tropfen vorbehandeln 3 (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), Deckel mit Parafilm und Inkubation 30 min bei 40 o C im Hybridisierungsofen.
    9. Wash gleitet 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser.
    10. 4 Tropfen des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt.
    11. 4 Tropfen des Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt.
      Hinweis: eine Sondensatz Targeting-Reste 15 - 1256 des menschlichen ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet. OPTIONAL: zusätzliche Hirnschnitten können hyb seinmit einer Sonde, Satz gegen Menschen PPIB ridized und als positive Kontrollen verwendet.
    12. Die Objektträger in der Folie Box und Inkubation für 2 Stunden. bei 40 o C im Hybridisierungsofen.
    13. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    14. 4 Tropfen AMP 1 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen.
    15. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    16. 4 Tropfen AMP 2 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen.
    17. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    18. 4 Tropfen AMP 3 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen.
    19. Wash gleitet zweimal mit 1x warH-Puffer für 2 min bei RT.
    20. 4 Tropfen AMP 4 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen.
    21. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    22. 4 Tropfen AMP 5 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 30 min bei RT.
    23. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    24. 4 Tropfen AMP 6-Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 15 min bei RT.
    25. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
    26. Mix gleichen Volumen BROWN BROWN-1 und-2-Reagenzien (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), fügen ~ 120 & mgr; l-Lösung in jede Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation 10 min bei RT.
    27. Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und einmal in destilliertem Wasser spülen.
      HINWEIS: kritische Schritte: die folgenden Schritte sind entscheidend für dieeine optimale axonalen Gegenfärbung zu erhalten, ohne Maskierung der Anwesenheit von RNA-Granulat.
    28. Vor der Durchführung Gegenfärbung das Vorhandensein von mRNA von Interesse unter einem Hellfeldmikroskop überprüfen. Bestimmung von Referenzflächen in den Gehirnproben, in denen das Vorhandensein von puncta gesamten Kontrastfärbungsverfahren zu überwachen.
    29. Vorheizen Luxol schnelle Blau-Lösung bei 60 o C.
    30. Die Objektträger in Luxol schnell blau und Inkubation 30 min bei 60 o C.
    31. Spülen Sie mehrmals in destilliertem Wasser.
    32. Dip Slides mehrfach in 0,05% Lithiumcarbonat-Lösung, um die Differenzierung zu starten.
    33. Dip Slides zweimal in frischem 75% Ethanol.
    34. Spülen in destilliertem Wasser.
    35. Überprüfen Hirnschnitten unter einem Hellfeldmikroskop. Beachten Sie, dass grauer und weißer Substanz beginnen sollte, zu unterscheiden und RNA-Granulat noch als dunkelblau / schwarz puncta sichtbar sein. Überprüfen Sie, dass Axone beginnen, wie hellblau Fasern erscheinen.
    36. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.28 bis 2.2.32. Perform Inkubationen mit Luxol Fast Blue-Lösung in 10 bis 20 min Schritten sorgfältige Überwachung der Gegenfärbung und die Anwesenheit von RNA Granulate. Hinweis: In der Regel wird eine optimale Gegenfärbung in 60 erworben - 90 min (Gesamt Inkubationszeit), aber die Zeit kann verkürzt werden, wenn der Verdacht besteht, dass RNA-Granulat kann durch die Luxol schnell Bläue (siehe Abbildung 2 für Beispiele) maskiert werden kann.
    37. Folien Kresylviolett Lösung inkubieren für 10 min bei RT.
    38. Spülen Sie gleitet in destilliertem Wasser.
    39. Dip Schlitten 5 bis 10 mal in 70% Ethanol.
    40. Entwässern Hirnschnitten bis 3 schnelle Änderungen von 100% Ethanol.
    41. In einer Abzugshaube, klar Hirnschnitten durch Inkubation zweimal in Xylol alternative Clearingstelle für 2 min und ein drittes Mal für 5 Minuten bei RT.
    42. Berg Hirnschnitten in Xylol-basierte permanentes Fixiermittel.
    43. Analysieren Sie die Proben unter einem Hellfeldmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eine kurze Zusammenfassung der oben beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

Optimale Erkennung von ATF4 mRNA Granulat in cholinergischen Axonen mit wärmeinduzierten Demaskierung

Bei der Beurteilung axonale Lokalisation mRNAs ist es kritisch, in der Lage, die Axone zu identifizieren und um niedrige reichlich RNAs zu visualisieren. Die hier beschriebene RNA ISH Technologie ermöglicht die Erkennung von RNAs in einer Einzelmolekülauflösung. Standardprotokollen unter Verwendung dieser Technologie schlagen die Kombination von zwei Verfahren, die Demaskierung Ziel-RNAs effizient detektieren: Protease-induzierte und wärmeinduzierte Demaskierung 28. Wenn jedoch ISH mit Immunhistochemie kombiniert, um Axone zu identifizieren, Protease-induzierte Demaskierung möglicherweise nicht in optimaler Antigennachweis 29 führen.

In dem hier beschriebenen ersten Protokoll wurde Proteaseverdau vermieden, da der verwendete Antikörper konnte c erkennenholine Acetyltransferase (ChAT), die typischerweise in Axonen des Gyrus dentatus aus der septohippocampalen Weg (2A und B), gefunden, obwohl positive mRNA Granulate erkannt wurden. Wärmeinduzierten Abruf mit 10 mM Citratpuffer (pH 6), andererseits gewährleistet die Integrität der durch die Anti-ChAT-Antikörper erkannte Epitop und Ziel-mRNA wurde effizient in ChAT-gefärbte Axone (2C und D) detektiert. Die hier präsentierten Ergebnisse (Abbildung 2) zeigen die Anwesenheit von ATF4 im Gyrus dentatus von erwachsenen Mäusen, wo mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung wurden durch Infusion von Aß 1-42 Oligomeren in den Hippocampus induziert. Vorherige Hinweise darauf, dass ATF4 mRNA nicht in Axonen in vitro oder in vivo unter basalen Bedingungen 18 erfaßt, und somit eine solche experimentelle Paradigma nicht dargestellt ist.

Optimale Erkennung von ATF4mRNA-Granulat in Axone unter Verwendung von sowohl thermisch induzierten und Protease-induzierte Demaskierung

Die oben zeigen, dass Antikörper-basierte Proteinnachweis ist mit RNA ISH Technologie kompatibel bei der Durchführung von Wärme induziert Demaskierung es nicht sinnvoll sein könnte, wenn Protease-Vorbehandlung erforderlich beschriebenen Ergebnisse. Abschnitt 2 beschreibt Nachweis von mRNA in ATF4 Axone folgenden zuvor veröffentlichten Verfahren 28,30 kombiniert mit histologischen Färbungen in der Regel für Hirnproben 31,32 verwendet.

Ein entscheidender Schritt in diesem Verfahren ist die optimale Gegenfärbung der markhaltigen Fasern mit Luxol schnell blau (LFB) ohne Maskierung die Anwesenheit von mRNA Granulat in Axonen von CISH gefärbt. Reagenzien für diesen Zweck verwendet werden, erlauben eine optimale Gegenfärbung mit LFB folgenden Inkubationszeiten von 60 bis 90 min. Gegenfärbung könnte, wenn beide Temperatur und Inkubationszeiten verringert werden scheitern (3A und Einsatz und Daten nicht gezeigt) einnd zwar mRNA Körnchen sichtbar bleiben, kann ihre axonalen Lokalisierung nicht verifiziert werden. Auf der anderen Seite, Inkubieren Gehirnproben für 60 min oder länger bei 60 ° C ohne die Überwachung der Anwesenheit von Granula periodisch könnte zu irreversiblen Maskierung der mRNA von Interesse durch den Farbstoff (3B und Einfügung) führen. Es wird daher empfohlen, alle Proben in LFB für 30 min inkubiert und die weitere Inkubation durchgeführt wird stufenweise die Überprüfung der Proben alle 10 bis 20 Minuten, um eine optimale Färbung sowohl der Axone und die RNA-Granulat (3D-F) zu erhalten. Nach diesen Richtlinien ATF4 positive Granulat kann eindeutig erkannt werden sowohl in Steuerung (3D) und Alzheimer (Abbildung 3F) Gehirnproben.

Abbildung 1
Abbildung 1 zusammengefasst WorkflowRNA ISH gefolgt von axonalen Gegenfärbemittel. Steps in schwarz dargestellt sind bei den beiden Verfahren beispielhaft dargestellt. Schritte blau markiert spezifisch für Para-fixierten Proben durch Fluoreszenz ISH während die rot markiert spezifisch für Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Proben durch chromogene ISH gefärbt sind gefärbt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. FISH für ATF4 mRNA lokalisiert an cholinerge Axone im Gyrus dentatus von erwachsenen Mäusen. FISH wurde mit Protease-induzierte (l inks Platte) oder wärmeinduzierten (rechts) Demaskierung gefolgt von Antikörper-Nachweis von Cholin Acetyltransferase (ChAT) . Die ANTIBody Der Chat erkennen, wenn Protease-Behandlung durchgeführt wurde. Beispiele von Ergebnissen mit einem nicht-Targeting-Sonde (dapB) und die ATF4 -targeting Sonde mit dem gleichen Mikroskopeinstellungen und Bildkorrekturen erhalten werden angezeigt. ATF4 -positiven Granulat mit unklaren axonale Lokalisation sind mit Fragezeichen angezeigt, während lokalisierte Granulat wird als "markiert Ok ". Maßstabsleiste 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. CISH für ATF4 mRNA lokalisiert auf markhaltigen Axonen im menschlichen Hippocampus. Nach ISH wurden Axone mit Luxol schnell blau (LFB) gegengefärbt und neuronalen Somata wurden mit Kresylviolett gegengefärbt. Suboptimalen LFB Färbung könnte resultieren, wenn sowohl die Temperatur (A und einliegende stellen Proben mit LFB für 4 Stunden gefärbt bei 40ºC.) Und Inkubationszeit (nicht gezeigt) verringert, oder wenn Gegenfärbung wird nach kurzen Inkubationszeiten (B und Einsatz geprüft ). Beispiele für optimale LFB Färbung kombiniert mit ISH Verwendung einer nicht-Zielsonde (dapB) oder ATF4 -targeting Sonde gezeigt (CF und -einsätze). Bilderfassung wurde automatisch nach dem besten Signal-zu-Rausch-Verhältnis. ATF4 -positiven Granulat mit unklaren axonalen Lokalisierung eingestellt werden mit Fragezeichen angezeigt, während lokalisierte Granulat wird als "ok" markiert. Maßstabsleiste 50 um, einfügungen 10 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung eines hochauflösenden ISH Technologie bei der Erkennung von axonally lokalisiert ATF4 mRNA. Diese und frühere veröffentlichte Studien zeigen, dass diese Technik mit Antikörper-basierte Proteinnachweis in Geweben oder sogar ganzen Embryonen 33 kompatibel. Wichtiger ist, es wurde kürzlich zur Detektion von mRNA im Arc Dendriten der hippocampalen Neuronen 34 eingesetzt. Es kann auch mit histologischen Farbstoffe zur Gewebefärbung kombiniert werden. Schließlich ist es für die gleichzeitige Detektion von mehreren Ziel-RNAs 28,30,33. Diese Ergebnisse veranschaulichen die Vielseitigkeit des hochauflösenden RNA ISH Technologien und geringfügige Modifikationen an der ursprünglichen Protokolle nicht die Empfindlichkeit des Verfahrens zu verringern.

Original-Protokolle, welche die Verwendung von Z-Struktur Sonden an mRNAs von Interesse an einer Einzelmolekülauflösung erkennen in Geweben schlagen zwei Schritte zur mRNA Demaskierung mitProteaseverdau und Probe kochendem 30,35. Hier zeigen wir, wie Protease-induzierte demaskiert sich negativ auf die erfolgreichste Antikörper-basierte Erkennung von ChAT in cholinergischen Axonen, die aus der septo-Hippocampus-Weg (2A und B) betrifft. Daher haben wir uns entschieden, diesen Schritt durchzuführen auszuschließen und nur wärmeinduzierten Demaskierung wenn axonalen Gegenfärbung umfaßte die Verwendung von Antikörpern. Wie gezeigt ist (2C und D) konnten cholinergen Axone mit einem Anti-ChAT-Antikörper visualisiert und ATF4 mRNA Granulate nachweisbar Vermeidung Proteaseverdau. Man beachte, dass der positive Nachweis des ATF4 mRNA ist auf der Hintergrundfluoreszenz von der negativen Sonde erzielt wurden. Eine zusätzliche Kontrolle kann an dieser Stelle durch Behandlung von Gehirnproben mit RNasen und Sondieren mit der Maus ATF4 Sonden, um ihre Spezifität zu testen einbezogen werden. Dieser Schritt ist jedoch nicht in den da hier diskutierten Prozedurenvorherige Beweise zeigen, mit dem gleichen Technologie, eine komplette Erschöpfung der ATF4 mRNA in Axonen folgenden siRNA Injektion in den Hippocampus der Maus 18. Solche Ergebnisse zeigen die Spezifität der ISH-Sonden verwendet. Die Verwendung von Steuerelementen, die von den negativen Proben sollte basierend auf bestimmten wissenschaftlichen Fragestellungen ausgewertet werden. Schließlich könnte wärmeinduzierten Abruf durch substituierte oder mit Protease-induzierte Demaskierung kombiniert, abhängig von den Anforderungen der für Axon Gegenfärbung verwendeten Antikörper werden. Die Wahl der mit dem einen oder anderen Verfahren oder die Kombination von beiden ist empirisch von dem Benutzer bestimmt werden.

Bei der Durchführung von Protease und wärmeinduzierten Demaskierung im menschlichen Gehirn Proben können histologische Farbstoffe Antikörper-basierte axonalen Gegenfärbung zu ersetzen. Obwohl das ursprüngliche Protokoll hier gefolgt schlägt die Verwendung von Hämatoxylin Zur Gegen 30 Gewebes ist ein solches Farbstoff nicht geeignet für die Axon-Färbung. So Luxol fast blau wurde verwendet, um markhaltigen Axonen Fleck und Kresylviolett wurde zur neuronalen Zellkörpern zu visualisieren. LFB, durch Kluever und Barrera 31 entwickelt wurde, wurde über andere Flecken gewählt, weil es kann in weniger als 2 Stunden abgeschlossen werden, und wenn die Differenzierung optimiert (3C-F) der hellblaue Flecken nicht mit den mRNA-Granulat, das als dunkel erscheinen stören braun-schwarze Punkte. Wie dargestellt (Figur 3) kann eine optimale LFB Gegenfärbung durchgeführt werden, wenn die Inkubation Proben bei 60 ° C für 60 bis 90 min. Es wird jedoch empfohlen, dass die Inkubation durchgeführt, so dass schrittweise Differenzierung sorgfältig überwacht werden und mRNA Granulate sind immer sichtbar. Andere histologische Techniken wie Bielchowsky oder Bodian die Silberfärbung Ausbeute grau-schwarz Axon Färbung 36, die nicht mit der in diesem Bericht gewählten DAB-basierten Farbreaktion vereinbar sein könnte. Wahrscheinlich, wie Färbetechniken sollte mit RNA CISH-Tests kombiniert werdendass die Nutzung alternativer Farbstoffe ermöglichen, wie schnell rot oder grün HRP 30. Die Wahl der richtigen Kombination von RNA ISH-Tests und axonalen Flecken sollten empirisch durch Benutzer festgelegt werden.

Eine Beschränkung der in diesem Bericht beschriebenen ersten Verfahren ist die unterliegende Proteindetektion durch Immunhistochemie wenn Proteaseverdau erfolgt. Diese Einschränkung kann durch die Vermeidung von Protease-induzierte Demaskierung überwunden werden. In dem besonderen Fall der axonally lokalisierten ATF4 Führen wärmeinduzierten Demaskieren war ausreichend, um mRNA-Granulat über Hintergrundgehalte in cholinergen Axone erkennen. Dies kann jedoch nicht der Fall für andere mRNAs von Interesse und Proteaseverdau erforderlich sein können. Wenn ja, sollte axonalen Gegenfärbung erfolgte mit Ausnahme der Anti-ChAT-Antikörper hier beschriebenen Antikörper werden. Alternativ können Antikörper-basierten Gegenfärbung durch histologische Farbstoffe, wie in Abschnitt 2 des Protokolls beschrieben ersetzt werden.

30.

Wie in der Protokoll-Abschnitt erwähnt, ist einer der kritischen Schritte beider Verfahren der wärmeinduzierten Entlarvung. Wenn Sieden in einem Mikrowellengeführt wird, gibt es Chancen Lösung Verdunstung in Abhängigkeit von den Charakteristiken der Vorrichtung. Befolgen Sie die in 1.2.3 und 2.2.4 zu Lösung Verdunstung zu vermeiden Schritte. Für feste gefrorene Gewebe 10 min von Entlarvung sollte ausreichen, während für Paraffin eingebettetGewebe Sieden für 15 Minuten empfohlen. Wenn Proben nicht kontinuierlich für die empfohlene Zeit kochen könnte dies in Teil Entlarvung führen. Jedoch Zeiten konnten leicht variieren, wenn andere Geräte wie ein Reiskocher oder eine Kochplatte anstelle eines Mikrowellen ausgewählt. Sieden Dauer sollte durch den Benutzer bestimmt werden kann, abhängig von dem Verfahren.

Ein weiterer wichtiger Schritt ist die LFB Gegenfärbung. Es ist wichtig, dass die Intensität des blauen Farbstoffs nicht mit der Visualisierung der mRNA Granulate behindern. Einige Modifikationen an dem Original-Protokoll 31 wurden um die Intensität des Farbstoffs zu verringern, wie beispielsweise Verringerung der Temperatur (3A) oder die Inkubationszeit (Daten nicht gezeigt) durchgeführt, aber man konnte myelinisierten Axonen klare Unterscheidung in menschlichen Gehirnproben . Auf der anderen Seite, das Inkubieren der Proben in LFB Lösung bei der vorgeschlagenen Temperatur (60 ° C) ergab optimale Färbung von myelinisierten Axonen. Eswird jedoch empfohlen, dass die Gegenfärbung durchgeführt wird schrittweise sorgfältige Überwachung der Anwesenheit von RNA-Granulat jederzeit zu gewährleisten, dass LFB verdeckt nicht die mRNA von Interesse wie in den Schritten 2.2.28-2.2.36 spezifiziert.

Schließlich sollten die Proben nicht austrocknen. Die in diesem Bericht beschriebenen Verfahren umfassen mehrere Inkubationsschritte bei 40 o C, die die Chancen der Reagenz Verdunstung erhöht. Wie in den Protokollen angegeben, sollten Proben mit Parafilm in allen Stufen abgedeckt werden, um Verdampfung zu vermeiden.

Zusammenfassend ist die Entwicklung von hochauflösenden RNA ISH ISH und anderen Methoden ermöglicht die Visualisierung der Nieder reichlich Transkripte, einschließlich der Erwachsenen Axone in vivo lokalisiert. Dies ist besonders wichtig, da viele Jahre mRNA Lokalisierung und Übersetzung in der Erwachsenen Axone war stark übersehen, da sie als translational inaktiv waren.

Abschließend stellen wir eine neue und promising Technologie zum Nachweis von ATF4 und möglicherweise viele andere mRNAs in der Erwachsenen Axone des Gehirns von Säugetieren. RNAscope werden zukünftige Studien zur mRNA-Lokalisierung zu erleichtern und dazu beitragen, die biologische Bedeutung ihrer lokalen Übersetzung in vivo zu entwirren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) Advanced Cell Diagnostics - probe
custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) Advanced Cell Diagnostics - probe
negative control probe-DapB Advanced Cell Diagnostics 310043 probe
positive control probe-mouse Polr2A (optional) Advanced Cell Diagnostics 312471 probe
positive control probe-human PPIB (optional) Advanced Cell Diagnostics 313901 probe
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) Advanced Cell Diagnostics 320850 in situ hybridization kit
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) Advanced Cell Diagnostics 310035 in situ hybridization kit
Goat polyclonal anti-ChAT antibody Millipore AB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit American MasterTech KTLFB
Clearify clearing agent (xylene substitute) American MasterTech CACLEGAL
ProLong Gold mounting  medium with DAPI Life Technologies P36935
DPX mounting medium Sigma 6522

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Tags

Neuroscience Ausgabe 100 mRNA-Lokalisierung Axone, Erwachsenen Gehirn
Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C.,… More

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (100), e52799, doi:10.3791/52799 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter