Abstract
mRNA's worden vaak gelokaliseerd op gewervelde axonen en hun lokale vertaling nodig is voor axon pathfinding of vertakking tijdens de ontwikkeling en voor onderhoud, reparatie of neurodegeneratie in postdevelopmental periodes. High throughput analyses hebben onlangs onthuld dat axonen hebben een meer dynamische en complexe transcriptoom dan eerder werd verwacht. Deze analyse, maar zijn meestal gedaan in gekweekte neuronen wanneer axonen kunnen worden geïsoleerd uit de somato-dendritische compartimenten. Het is vrijwel onmogelijk om dergelijke scheiding bereiken geheel weefsels in vivo. Aldus, teneinde de werving van mRNA en hun functionele relevantie verifiëren in een geheel dier, transcriptoom analyse idealiter worden gecombineerd met technieken die de visualisatie van mRNA in situ mogelijk. Onlangs hebben roman ISH technologieën die RNA's in een enkel-molecuul niveau te detecteren ontwikkeld. Dit is vooral belangrijk wanneer de analyse van de subcellulaire lokalisatie van mRNA, Omdat gelokaliseerde RNA's zijn doorgaans te vinden op een laag niveau. Hier beschrijven we twee protocollen voor de detectie van axonally-mRNA gelokaliseerd met behulp van een nieuwe ultragevoelige RNA ISH techniek. We hebben samen RNAscope ISH met axonen tegenkleuring met behulp van fluorescentie immunohistochemie of histologische kleurstoffen voor de aanwerving van ATF4 mRNA om axonen in vivo in de volwassen muis en menselijke hersenen te controleren.
Introduction
Axonal mRNA werving en lokale vertaling staat axonen te reageren op extracellulaire stimuli in een tijdelijk en ruimtelijk acute manier 1. Intra-axonen eiwitsynthese wordt het best begrepen in de context van neurodevelopment waar het speelt een cruciale rol in de groei kegel gedrag 2-8, axon pathfinding 9-11 en retrograde signalering 12,13. Maar veel minder bekend over de functionele betekenis van axonale eiwitsynthese in post-ontwikkelings neuronen bij axonale mRNA en ribosoom niveaus sterk gereduceerd 14,15. Volwassen gewervelde axonen hebben lange tijd gedacht translationeel inactief 16 te zijn. Echter, recente studies tonen aan dat de lokale vertaling wordt geactiveerd in volwassen axonen onder pathologische omstandigheden. Zo wordt een gedeelte van mRNA's gerekruteerd voor regenererende axons na zenuwletsel en intra-axonale eiwitsynthese is die voor een doelmatige regeneratie van axons die 17. Bovendien, onze groep has aangetoond dat specifieke mRNAs worden gerekruteerd voor axons na plaatselijke blootstelling aan de ziekte van Alzheimer Aß peptide 1-42 en lokale translatie van de transcriptiefactor ATF4 moet het neurodegeneratieve effect van Aß 1-42 propageren van axonen in de neuronale soma 18. Tenslotte hebben high throughput analyse bleek dat de volwassen axonen een complexer en dynamische transcriptoom dan verwacht 18-21, in het bijzonder onder pathologische omstandigheden. Gezien deze studies, een zeer gevoelige en specifieke methode voor het opsporen axonally gelokaliseerde mRNA's in het volwassen zenuwstelsel nodig.
Veel van het werk op mRNA werving en lokale vertaling in het volwassen axonen is uitgevoerd op gekweekte neuronen. Dit geldt vooral voor transcriptoom analyse sindsdien gespecialiseerd kweekmethoden bestaan die de isolatie van axonen van de somato-dendritische compartimenten 18-20 toe. Hoewel dergelijke studies waardevolle ins hebben gegevenechts in de rol van de lokale vertaling in volwassen axonen, de vraag of gekweekte neuronen getrouw beeld geeft van de situatie in vivo of als mRNA recruitment is een adaptieve reactie van axonen te kweken voorwaarden is nog open. Weinig studies hebben het bewijs van mRNA rekrutering axonen rijpen in vivo voorzien. Zo is het transcript coderend voor het olfactorische markereiwit aangetroffen in neuronen van volwassen sensorische neuronen 22. Een transgen met de 3 'UTR van β-actine mRNA wordt getransporteerd naar axonen in het perifere en centrale zenuwstelsel neuronen bij muizen en lokaal vertaald naar ontwikkelings- periode 23. Lamin b2 mRNA is gelokaliseerd op het netvlies axonen in Xenopues laevis kikkervisjes en de uitputting van invloed axon onderhoud na axonale ontwikkeling 21. Interferentie met het axonale transport van het mRNA dat codeert voor cytochroom C oxidase IV verandert muisgedrag 24. Tenslotte ATF4 mRNA wordt gevonden bij volwassen eenXON van muizen en menselijke hersenen in het kader van Aß 1-42 geïnduceerde neurodegeneratie 18.
Hoge doorvoer transcriptoom analyses hebben bewezen nuttig te zijn om mRNA profielen in geïsoleerde axonen in vitro te identificeren, maar hebben beperkingen voor in vivo studies sinds geheel weefsels axonen zijn nooit gevonden in afzondering, maar vermengd met neuronale cellichamen, gliacellen en andere celtypen. Derhalve dergelijke analyses moeten worden gecombineerd met beeldvormende technieken die de subcellulaire lokalisatie van mRNA te bevestigen. RNA in situ hybridisatie (ISH RNA) maakt de detectie en visualisatie van specifieke RNA sequenties in cellen en weefsels. Echter, originele RNA ISH assays alleen geschikt voor de identificatie van zeer overvloedige RNAs 25, hetgeen zelden het geval axonally gelokaliseerde mRNA's. Voor de laatste decennia toenemende inspanningen hebben in het ontwikkelen van nieuwe technologieën die de detectie van mRNA mogelijk maken bij de single-molecule niveau gezet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de IACUC van Columbia University en de geldende richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd. Opmerking: Bereid alle buffers gebruikt voor de ISH procedures in RNase-vrij of-DEPC behandeld water. Deze aanbeveling is niet strikt noodzakelijk nadat ISH is voltooid, maar het wordt gesuggereerd dat buffers nog steeds worden bereid in geautoclaveerde dubbel gedestilleerd water en / of gesteriliseerd door filtering.
1. Detectie van ATF4 mRNA gelokaliseerd Cholinerge axonen in de volwassen hersenen van muizen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) Gevolgd door immunohistochemie
- Monstervoorbereiding voor paraformaldehyde vaste bevroren hersenen plakjes
- Voor het volgende voorbeeld bereiden segmenten van vaste bevroren muis hersenen.
- Kortom, offeren 9 maanden oude muizen door anesthesie met ketamine (100 mg kg -1 lichaamsgewicht) en xylazine (10 mg kg -1 lichaam Weight) gevolgd door transcardial infusie van 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7,4).
- Verwijder hersenen en post-fix in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur bij 4 ° C.
- Na fixatie, wassen monsters driemaal in PBS en cryoprotect in 30% sucrose in PBS (pH 7,4) gedurende 24 uur bij 4 oC
- Insluiten hersenen in OCT bevriezen verbinding, serieel gedeelte aan 20 urn op een cryostaat en monteren op poly-D-lysine behandelde microscoopglaasjes. Houd hersencoupes bij -20 ° C tot gebruik.
- Verwijder-paraformaldehyde vaste hersenen segmenten van vriezer en lucht drogen gedurende 30 min bij RT.
- Was driemaal met 1 x PBS.
- In een zuurkast, re-fix hersencoupes 20 min met 4% paraformaldehyde bij RT.
LET OP: LET OP: 4% paraformaldehyde is giftig en moeten worden behandeld en weggegooid adequaat volgende protocollen. - Was driemaal met 1 x PBS.
- Uitdrogen hersenen plakjes.
- Bereid 50%, 75% en 100%ethanoloplossingen.
- Dompel de glaasjes in 50% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Dompel de glaasjes in 75% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Dompel de glaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Dompel slides in vers 100% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Als alternatief kan objectglaasjes worden opgeslagen in 100% ethanol bij -20 o C tot 1 maand.
- Voor het volgende voorbeeld bereiden segmenten van vaste bevroren muis hersenen.
- FISH assay gevolgd door immunohistochemie met behulp van warmte-geïnduceerde antigen / RNA ontmaskering
- Voordat u begint te bereiden alle benodigde materialen:
- Verwarm de oven voor hybridisatie 40 o C en plaats een bak met gedistilleerd water in de oven om een vochtige omgeving te creëren.
- Neem een dia doos en plaats papieren handdoeken gedrenkt in gedestilleerd water naar binnen om de doos dia bevochtigen. Plaats de doos dia in de hybridisatie oven.
- Verwijder probes (zowel negatief als doel probes) vanaf koelkast en verwarm ze in de hybridisatie-oven gedurende 10 min. Laat de sondes afkoelen down bij KT.
- Equilibreren amplificatiereagentia AMP 4/1 (in het Fluorescent Multiplex Reagent Kit) bij kamertemperatuur.
- Bereid antigen retrieval oplossing: 10 mM natriumcitraat (pH 6), 0,05% Tween 20. Opmerking: Solution kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen en voor onbepaalde tijd worden gebruikt voor toekomstige kleuring.
- Bereid 1x wasbuffer verdunnen van de 50x voorraad-oplossing (opgenomen in de TL-Multiplex Reagent Kit) in RNase-vrij of-DEPC behandeld water.
OPMERKING: 1x wasbuffer kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende 1 maand en worden gebruikt voor toekomstige kleuring. 50x wasbuffer zou neerslaan. Dan hitte 50x wasbuffer bij 40 ° C gedurende 10 min voor het bereiden van de 1 x oplossing.
- Verwijder dia's van 100% ethanol en drogen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid een Coplin potje met 50 ml van antigen retrieval oplossing. Dompel slides in antigeenterugtrekking oplossing en kook ze gedurende 10 min in een magnetron.
OPMERKING: U plaats schuift horizontaal in een 100 mmdiameter ronde glazen schaaltje met 100 ml van retrieval oplossing.- Vul een 1 L beker met gedestilleerd water en plaats het in de magnetron.
LET OP: Het water zal 'buffer' van de warmte bij het uitvoeren van ontmaskering. - Plaats de dia's in antigen retrieval oplossing in de magnetron. Kook glijdt op hoog vermogen gedurende 5 minuten. Onmiddellijk nadat de monsters zijn gestopt koken, hitte glijdt weer op hoog vermogen voor extra 5 min.
- Afkoelen glijbanen bij RT.
OPMERKING: Kritische stap: kooktijd en de procedure moeten worden bepaald door de gebruiker, afhankelijk van de microgolf eigenschappen. Hoe sneller het koken begint hoe groter de kans op oplossing verdampen. In dit geval wordt aanbevolen dat de monsters worden gekookt gedurende kortere tijdsperioden meer dan tweemaal totaal ontmaskering tijd van 10 minuten voltooid. Integendeel, wanneer verwarming wordt uitgevoerd bij gemiddeld of laag vermogen, ontmaskering worden eenmaal uitgevoerd gedurende 10 min. Indien de monsters niet koken continuously voor een totaal van ongeveer 10 minuten, kan dit leiden tot partiële ontmaskering van zowel het doelwit RNA en eiwitten te detecteren.
- Vul een 1 L beker met gedestilleerd water en plaats het in de magnetron.
- Was dia driemaal met 1 x PBS.
- Voeg 2-3 druppels (~ 100 ul) van de dapB probeset die hersenplakjes gebruikt om achtergrondkleuring te beoordelen. Opmerking: De dapB sonde set richt zich op een bacterieel gen en mag geen zoogdieren RNA herkennen.
- Voeg 2-3 druppels van de targeting probeset die hersenplakjes gebruikt om het RNA van belang te detecteren. Opmerking: a probe set targeting resten 20 - 1381 van de muis ATF4 mRNA wordt in dit voorbeeld.
- Cover dia's met parafilm om sonde verdamping te voorkomen, plaats ze in de dia doos bevochtigde in de hybridisatie oven en incubeer ze op 40 o C gedurende 2 uur.
Opmerking: optionele: extra hersenen plakjes kan worden gehybridiseerd met een sonde set targeting muis Polr2A en gebruikt als positieve controles. - Wash slides tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 2-3 druppels amplificatiereagens AMP 1-FL elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 30 min in hybridisatie oven.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 2-3 druppels amplificatiereagens AMP 2-FL elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 15 min in hybridisatie oven.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 2-3 druppels amplificatiereagens AMP 3-FL elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 30 min in hybridisatie oven.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 2 - 3 druppels amplificatiereagens AMP 4-FL op elke hersenen slice, dekken dia's met parafilm, plaats ze in dedia doos en incubeer bij 40 ° C gedurende 15 min in hybridisatie oven.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en tweemaal met 1 x PBS.
- Naar 100-200 gl (of voldoende volume volledig te bedekken plakken) van een blokkerende oplossing die 3 mg / ml BSA, 100 mM glycine en 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) op de objectglaasjes, bedek ze met parafilm en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Naar 100-200 ul anti-ChAT antilichaam verdund in blokkerende oplossing (1/100) op de objectglaasjes, bedek ze met parafilm en incubeer gedurende 2 dagen bij 4 oC Zorg ervoor dat de hersenen plakjes niet uitdrogen. Indien nodig, re-toepassing anti-ChAT antilichaam oplossing voor de hersenen plakjes 24 uur na incubatie.
- Was glijdt driemaal in 1x PBS gedurende 5 min bij RT.
- Voeg 100-200 ul van de juiste Alexa-geconjugeerd secundair antilichaam (bijv., Alexa-594 ezel anti-geit voor dit specifieke voorbeeld) naar de dia's, dek af met parafilm en incubaten gedurende 1 uur bij KT.
- Was glijdt driemaal in 1x PBS gedurende 5 min bij RT.
- Was de dia's één keer met gedestilleerd water.
- Mount dia's met DAPI met montage medium.
- Visualiseer hersenen plakjes onder een fluorescentiemicroscoop.
- Voordat u begint te bereiden alle benodigde materialen:
2. Detectie van ATF4 mRNA gelokaliseerd Axons in Human Brain Monsters met Chromogene In Situ hybridisatie (CISH) Gevolgd door Luxol Fast Blue en cresylviolet Tegenkleuring
- Monstervoorbereiding voor formaline gefixeerd in paraffine ingebedde menselijke hersenmonsters
- Bak segmenten in een droogoven bij 60 ° C gedurende 1 uur.
- Deparaffinize hersenen plakjes in een zuurkast.
LET OP: LET OP: reagentia zijn giftig en moeten worden behandeld en weggegooid na de juiste beveiliging richtlijnen- Dompel de glaasjes in xyleen alternatief clearing-agent tweemaal gedurende 10 min.
- Dompel de glaasjes in 100% ethanol tweemaal gedurende 1 minuut.
- EENir-droge schijfjes 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Als alternatief kunnen monsters worden gedroogd bij kamertemperatuur O / N maar moeten binnen 24 uur worden gebruikt.
- Diaminobenzidine (DAB) -gebaseerde chromogenic ISH assay gevolgd door Luxol snel blauw en cresylviolet vlek met behulp van warmte-geïnduceerde en protease-geïnduceerde RNA ontmaskering
- Voordat u begint te bereiden benodigde materialen:
- Verwarm de oven voor hybridisatie 40 o C en plaats een bak met gedestilleerd water om een vochtige omgeving te creëren.
- Neem een dia doos en plaats papieren handdoeken gedrenkt in gedestilleerd water naar binnen om de doos dia bevochtigen. Plaats de doos dia in de hybridisatie oven.
- Bereid 1x voorbehandelen 2 door verdunning van de 10x voorraad-oplossing (inbegrepen in de CISH Reagent Kit) in RNase-vrij of-DEPC behandeld water. Als voorbehandeling wordt uitgevoerd op een hete plaat, voeg 100 ml voorbehandelen oplossing voor een 100 mm diameter glazen schotel naar het contactvlak tussen de schotel en de verwarmingsplaat te verhogen (als voorbehandelingwordt uitgevoerd in een magnetron kan een Coplin pot in plaats daarvan worden gebruikt zoals gespecificeerd in 1.2.3). Verwarm oplossing 100 o C en houd het mengsel niet langer dan 30 minuten vóór onderdompeling samples.
- Warmte negatieve en positieve sondes 10 min bij 40 o C en afkoelen bij RT.
- Equilibreer amplificatiereagentia AMP 1-6 (inbegrepen in de CISH reagens Kit) bij RT.
- Bereid 1x wasbuffer verdunnen van de 50x voorraad-oplossing (inbegrepen in de CISH Reagent Kit) in gedestilleerd water. Opmerking: 1 x wasbuffer kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende 1 maand en worden gebruikt voor toekomstige kleuring.
- Voeg ~ 4 druppels (~ 120 ul) van voorbehandeling 1 tot elke hersenplakje, dek af met parafilm en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Was 3-5 maal in vers gedestilleerd water.
- Voer warmte-geïnduceerde ontmaskering:
- Overdracht dia's hot voorbehandelen 2 (inbegrepen in de CISH Reagent Kit) oplossing en kook gedurende 15 minuten. Opmerking: Boiling kan worden uitgevoerd op een hete plaat zorgencontinue koken of in een magnetron volgende kritische stappen gespecificeerd in 1.2.3).
- Onmiddellijk over objectglaasjes gedestilleerd water en was 3-5 keer.
- Wash slides 3-5 maal in vers 100% ethanol.
- Air-droge schijfjes 5 min bij RT. Opmerking: Als alternatief plakken kan worden gedroogd O / N.
- Voer-protease veroorzaakte ontmaskering:
- Voeg 4 druppels voorbehandelen 3 (opgenomen in het CISH Reagent Kit), dek af met parafilm en incubeer 30 minuten bij 40 ° C in hybridisatie oven.
- Wash slides 3-5 maal in vers gedestilleerd water.
- Voeg 4 druppels dapB probeset die hersenplakjes gebruikt om achtergrondkleuring te beoordelen.
- Voeg 4 druppels van de targeting probeset die hersenplakjes gebruikt om het RNA van belang te detecteren.
Opmerking: Een probeset targeting resten 15 - 1256 van de menselijke ATF4 mRNA wordt in dit voorbeeld. OPTIE: extra hersenen plakjes kan hyb zijnridized met een sonde set targeting mens PPIB en gebruikt als positieve controles. - Plaats objectglaasjes in de schuifkast en incubeer gedurende 2 uur. bij 40 o C in hybridisatie oven.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 druppels AMP 1 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 30 min in hybridisatie oven.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 druppels AMP 2 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 15 min in hybridisatie oven.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 druppels AMP 3 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 30 min in hybridisatie oven.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wash buffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 druppels AMP 4 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 15 min in hybridisatie oven.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 druppels AMP 5 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 druppels AMP 6 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Meng gelijke volume van BROWN-1 en 2-BROWN reagentia (in het CISH Reagent Kit), voeg ~ 120 ul oplossing aan elke hersenplakje, dek af met parafilm en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en eenmaal spoelen met gedestilleerd water.
OPMERKING: kritische stappen: de volgende stappen zijn cruciaal voorEen optimale axonale tegenkleuring verkrijgen zonder het maskeren van de aanwezigheid van RNA granules. - Voor het uitvoeren van tegenkleuring de aanwezigheid van mRNA van belang te controleren onder een helderveld microscoop. Definieer referentiegebieden in de hersenen monsters om de aanwezigheid van puncta gehele tegenkleuring procedure te volgen.
- Verwarm Luxol snel blauwe oplossing bij 60 o C.
- Plaats de glaasjes in Luxol snel blauw en incubeer 30 minuten bij 60 o C.
- Spoel verschillende keren in gedestilleerd water.
- Dip dia meermaals 0,05% lithiumcarbonaatoplossing differentiatie starten.
- Dip dia's twee keer in vers 75% ethanol.
- Spoel in gedestilleerd water.
- Controleer de hersenen plakjes onder een helderveld microscoop. Merk op dat de grijze en witte stof moet beginnen te onderscheiden en RNA korrels nog steeds zichtbaar als donkerblauw / zwart puncta zijn. Controleer of axonen start verschijnen als het licht blauwe vezels.
- Herhaal stap 2.2.28 tot 2.2.32. Perform incubaties met Luxol snelle blauwe oplossing in 10-20 min stappen zorgvuldig toezicht op de tegenkleuring en de aanwezigheid van RNA korrels. Opmerking: Doorgaans wordt een optimale tegenkleuring verworven in 60-90 min (totale incubatietijd), maar kan worden verkort als het vermoeden bestaat dat RNA korrels kunnen worden gemaskeerd door de Luxol snelle blauwe vlek (zie figuur 2 voor voorbeelden).
- Incubeer dia's in cresylviolet oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel de dia's in gedestilleerd water.
- Dip dia 5-10 maal in 70% ethanol.
- Uitdrogen hersencoupes tot 3 snelle veranderingen van 100% ethanol.
- In een zuurkast, duidelijk hersencoupes door tweemaal te incuberen in xyleen alternatieve klaringsmiddel gedurende 2 min en een derde keer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Mount hersenen plakjes in-xyleen gebaseerde permanente montage medium.
- Analyseer monsters onder een helderveld microscoop.
- Voordat u begint te bereiden benodigde materialen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een korte samenvatting van de hierboven beschreven werkwijzen is weergegeven in figuur 1.
Optimale detectie van ATF4 mRNA korrels in cholinerge axonen het gebruik van warmte-geïnduceerde ontmaskering
Bij de beoordeling axonale lokalisatie van mRNA, is het essentieel om te kunnen axonen identificeren en kunnen lage overvloedige RNAs visualiseren. Het RNA ISH techniek beschreven maakt de detectie van RNA in een enkel molecuul resolutie. Standaardprotocollen met deze techniek suggereert de combinatie van beide procedures te ontmaskeren doelwit RNA efficiënt detecteren: protease-geïnduceerde en geïnduceerde warmte unmasking 28. Wanneer echter ISH gecombineerd met immunohistochemie op axonen identificeren-protease veroorzaakte ontmaskering misschien niet tot optimaal antigeendetectie 29.
In het eerste protocol beschreven, werd protease digestie vermeden, aangezien het antilichaam dat niet c herkennenholine acetyltransferase (ChAT) typisch in axons van de dentate gyrus die door de septohippocampal mechanisme (figuur 2A en B), maar positief mRNA granules werden gedetecteerd. Warmte geïnduceerde retrieval met 10 mM citraatbuffer (pH 6), anderzijds, gezorgd voor de integriteit van de epitoop herkend door het anti-ChAT antilichaam en doel mRNA werd efficiënt gedetecteerd in ChAT-gekleurde axons (figuur 2C en D). De hier gepresenteerde resultaten (Figuur 2) tonen de aanwezigheid van ATF4 in de dentate gyrus van volwassen muizen waarbij mRNA rekrutering en lokale translatie werden geïnduceerd door infusie van Aß 1-42 oligomeren in de hippocampus. Vorige aanwijzingen dat ATF4 mRNA niet gedetecteerd in axons in vitro of in vivo onder basale omstandigheden 18 ervan, zodat de experimentele paradigma wordt niet getoond.
Optimale detectie van ATF4mRNA granules in axons waarbij zowel warmte geïnduceerde en geïnduceerde protease unmasking
Overwegende dat het bovenstaande blijkt dat antilichaam-gebaseerde eiwit detectie is compatibel met RNA ISH-technologie bij het uitvoeren van warmte opgewekt ontmaskeren zou het niet handig zijn als protease pre-behandeling nodig is beschreven resultaten. Hoofdstuk 2 beschrijft de detectie van ATF4 mRNA binnen axonen volgende eerder gepubliceerde procedures 28,30 in combinatie met histologische vlekken doorgaans gebruikt voor de hersenen monsters 31,32.
Een cruciale stap in deze procedure is de optimale tegenkleuring van gemyeliniseerde vezels met Luxol snel blauw (LFB), zonder het maskeren van de aanwezigheid van mRNA korrels in axonen gekleurd door CISH. Reagentia voor dit doel mogelijk optimale tegenkleuring LFB na incubatietijden van 60 tot 90 min. Tegenkleuring kan mislukken wanneer zowel de temperatuur en incubatietijden worden verlaagd (Figuur 3A en inzet en data niet getoond) eennd hoewel mRNA granules nog steeds zichtbaar zijn, hun axonale lokalisatie kan niet worden gecontroleerd. Anderzijds, incuberen hersenstalen gedurende 60 minuten of langer bij 60 ° C zonder controle op de aanwezigheid van positieve korrels periodiek kan onherstelbare maskeren van het mRNA van belang door de kleurstof (Figuur 3B en inzet). Daarom wordt geadviseerd om geïncubeerd in LFB gedurende 30 min en dat verdere incubatie wordt uitgevoerd stapsgewijs controleren van de monsters elke 10 tot 20 minuten om een optimale kleuring van zowel de axons en de RNA granules (Figuur 3D-F) te verkrijgen. Naar aanleiding van deze richtlijnen ATF4 positieve korrels kan duidelijk worden waargenomen, zowel in de controle (figuur 3D) en de ziekte van Alzheimer (figuur 3F) hersenen monsters.
Figuur 1. Samengevat workflowRNA ISH gevolgd door axonen tegenkleuring. Stappen afgebeeld in zwart zijn gemeenschappelijk voor de twee procedures geïllustreerd. Stappen in het blauw zijn specifiek voor-paraformaldehyde gefixeerde monsters gekleurd door fluorescerende ISH terwijl die rood gemarkeerd zijn specifiek voor formaline gefixeerde in paraffine ingebedde monsters gekleurd door chromogene ISH. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. FISH voor ATF4 mRNA gelokaliseerd aan cholinerge axonen in de dentate gyrus van volwassen muizen. FISH werd uitgevoerd met behulp van protease-geïnduceerde (l eft paneel) of warmte-geïnduceerde (rechter paneel) ontmaskering gevolgd door antilichaam detectie van choline acetyltransferase (ChAT) . De ANTIBody nagelaten om te chatten herkennen wanneer protease behandeling werd uitgevoerd. Voorbeelden van resultaten verkregen met een niet gerichte probe (dapB) en ATF4 -targeting probe volgens dezelfde microscoop instellingen en aanpassingen beeld getoond. ATF4 -positieve granules met onduidelijke axonale lokalisatie aangeduid met vraagtekens terwijl gelokaliseerde granules worden gemarkeerd als " OK ". Schaalbalk 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. CISH voor ATF4 mRNA gelokaliseerd gemyeliniseerde axonen in het menselijk hippocampus formatie. Na ISH, werden axonen tegengekleurd met Luxol snel blauw (LFB) en neuronale somata werden tegengekleurd met cresylviolet. Suboptimale LFB kleuring zou kunnen ontstaan als beide temperaturen (A en inzet monsters gekleurd met LFB bij 40 o C gedurende 4 uren vertegenwoordigt.) En incubatietijd (niet getoond) worden verminderd, of als tegenkleuring niet wordt gecontroleerd na korte perioden (B inzet incubatie ). Voorbeelden van optimale LFB kleuring gecombineerd met ISH via een niet gerichte probe (dapB) of ATF4 -targeting probe getoond (CF en bijvoegsels). Beeldvorming werd automatisch aangepast voor de beste signaal-ruisverhouding. ATF4 -positieve granules met onduidelijke axonale lokalisatie aangeduid met vraagtekens terwijl gelokaliseerde granules worden gemarkeerd als "OK". Schaalbalk 50 micrometer, bijvoegsels 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport beschrijven we het gebruik van een hoge-resolutie ISH techniek voor de detectie van axonally gelokaliseerde ATF4 mRNA. Deze en eerdere gepubliceerde studies tonen aan dat deze technologie is compatibel met de antilichaam-gebaseerde eiwit detectie in weefsels of zelfs hele embryo 33. Belangrijk is onlangs gebruikt voor de detectie van mRNA in Arc dendrieten van hippocampale neuronen 34. Het kan ook worden gecombineerd met histologische kleurstoffen voor weefselkleuring. Tenslotte is het geschikt voor de gelijktijdige detectie van meerdere doelwit RNA 28,30,33. Deze bevindingen illustreren de veelzijdigheid van hoge-resolutie RNA ISH technologieën en kleine wijzigingen van de oorspronkelijke protocollen niet de gevoeligheid van deze methode verminderen.
Originele protocollen die het gebruik van Z-structuur probes voor mRNA van interesse te detecteren in weefsels in één molecuul resolutie suggereren twee stappen mRNA ontmaskeren waarbijprotease spijsvertering en sample kokend 30,35. Hier laten we zien hoe protease-geïnduceerde negatieve ontmaskeren beïnvloedt de gekozen antilichaam-gebaseerde detectie van ChAT cholinerge axons die door de septo hippocampus-mechanisme (figuur 2A en B). Dus, hebben we besloten om deze stap uit te sluiten en uit te voeren alleen warmte-geïnduceerde ontmaskering als axonen tegenkleuring betrokken het gebruik van antilichamen. Zoals getoond (figuur 2C en D), kan cholinergische axons worden gevisualiseerd met een anti-ChAT antilichaam en ATF4 mRNA granules detecteerbaar vermijden protease digestie. Merk op dat de positieve detectie van ATF4 mRNA is gebaseerd op de achtergrond fluorescentie verkregen uit de negatieve probe. Een extra besturing kunnen op dit punt door het behandelen hersenmonsters met RNases en sonderen met de muis ATF4 probes om hun specificiteit te testen. Deze stap is echter niet opgenomen in de procedures besproken sindsvorige bewijs tonen, met behulp van deze zelfde technologie, een volledige uitputting van ATF4 mRNA in axonen volgende siRNA injectie in de muis hippocampus 18. Dergelijke resultaten demonstreren de specificiteit van de ISH sondes die hier gebruikt. Het gebruik van knoppen, met uitzondering van de negatieve sondes moeten worden geëvalueerd op basis van specifieke wetenschappelijke vragen. Tenslotte kan door warmte geïnduceerde retrieval gesubstitueerd zijn met of in combinatie met protease veroorzaakte ontmaskering afhankelijk van de eisen van het antilichaam voor axon tegenkleuring. De keuze om een of andere procedure of een combinatie van beide moet empirisch worden bepaald door de gebruiker.
Bij het uitvoeren van protease en warmte-geïnduceerde ontmaskering in de menselijke hersenen monsters, kan histologische kleurstoffen antilichamen gebaseerde axonen tegenkleuring vervangen. Hoewel het oorspronkelijke protocol hier gevolgd suggereert het gebruik van hematoxyline voor tissue tegenkleuring 30 dergelijke kleurstof is niet geschikt voor axon kleuring. Aldus luxol fast blue werd gebruikt om gemyeliniseerde axonen vlekken en cresylviolet werd gebruikt om neuronale cellichamen visualiseren. LFB, ontwikkeld door Kluever en Barrera 31, werd verkozen boven andere vlekken omdat in minder dan 2 uur worden ingevuld en differentiatie geoptimaliseerd (Figuur 3C-F) de lichtblauwe vlek niet interfereert met de mRNA granules die zo donker verschijnen bruin-zwarte stippen. Zoals weergegeven (figuur 3) kan uiterst LFB tegenkleuring worden uitgevoerd bij incubatie monsters bij 60 ° C gedurende 60-90 min. Het wordt echter aanbevolen dat de incubatie wordt uitgevoerd stapsgewijs zodat differentiatie zorgvuldig kan worden gecontroleerd en mRNA korrels zijn altijd zichtbaar. Andere histologische technieken zoals Bielchowsky of Bodian's zilverkleuring opbrengst grijs-zwart axon kleuring 36 die niet compatibel zijn met de DAB-gebaseerde chromogene reactie in dit rapport gekozen zou kunnen zijn. Waarschijnlijk dergelijke kleurtechnieken worden gecombineerd met RNA CISH assayswaardoor het gebruik van andere kleurstoffen zoals snel rood of groen HRP 30. Het kiezen van de juiste combinatie van RNA ISH assays en axonaal vlekken moeten empirisch worden bepaald door de gebruiker.
Een beperking van de eerste in dit rapport beschreven procedure is mislukt eiwitdetectie immunohistochemische als protease digestie wordt uitgevoerd. Deze beperking kan worden overwonnen door het vermijden van protease veroorzaakte ontmaskering. In het specifieke geval van axonally gelokaliseerd ATF4 presterende warmte geïnduceerde unmasking volstond om mRNA te detecteren granules boven achtergrondniveaus cholinerge axons. Dit is echter wellicht het geval voor andere mRNA van belang en proteasedigestie kunnen worden verlangd niet. Zo ja, zou axonale tegenkleuring worden uitgevoerd door andere dan de anti-ChAT antilichaam hierin beschreven antilichamen. Als alternatief kunnen antilichamen gebaseerde tegenkleuring worden vervangen door histologische kleurstoffen zoals beschreven in paragraaf 2 van het protocol.
30.
Zoals vermeld in de sectie protocol, een van de cruciale stappen van beide procedures is de warmte-geïnduceerde unmasking. Bij koken wordt uitgevoerd in een magnetron, zijn er kansen oplossing verdamping afhankelijk van de kenmerken van de inrichting. Volg de stappen aangegeven in 1.2.3 en 2.2.4 tot oplossing verdamping te voorkomen. Voor vaste ingevroren weefsel 10 min van ontmaskering moeten volstaan, terwijl voor paraffine ingebeddeweefsels koken gedurende 15 minuten wordt aanbevolen. Als monsters niet continu koken voor de aanbevolen tijd dat dit zou kunnen resulteren in een gedeeltelijke ontmaskering. Maar tijden kunnen enigszins afwijken als andere apparaten, zoals een rijstkoker of een hete plaat worden gekozen in plaats van een magnetron. Kooktijd moet worden bepaald door de gebruiker, afhankelijk van de methode.
Een andere belangrijke stap is de LFB tegenkleuring. Het is van belang dat de intensiteit van de blauwe kleurstof niet interfereert met de visualisatie van het mRNA granules. Sommige aanpassingen aan het oorspronkelijke protocol 31 werden uitgevoerd om de intensiteit van de kleurstof te verminderen, zoals het verlagen van de temperatuur (Figuur 3A) of de incubatietijd (data niet getoond), maar we geen duidelijk onderscheid gemyeliniseerde axonen in menselijke hersenmonsters . Anderzijds, de monsters te incuberen in LFB oplossing bij temperatuurvoorstel (60 ° C) resulteerde in een optimale kleuring van gemyeliniseerde axonen. Hijechter raadzaam tegenkleuring wordt uitgevoerd stapsgewijs zorgvuldig monitoren van de aanwezigheid van RNA granules te allen tijde te verzekeren dat LFB niet verhullen mRNA van belang zoals bepaald in stappen 2.2.28-2.2.36.
Tot slot moeten de monsters nooit uitdrogen. De in dit rapport beschreven werkwijzen omvatten verschillende incubatiestappen bij 40 o C, waardoor de kans op reagens verdamping toeneemt. Zoals in de protocollen moeten de monsters worden afgedekt met parafilm bij alle stappen verdamping plaatsvindt.
Samengevat, de ontwikkeling van hoge-resolutie RNA ISH ISH en andere methoden waardoor de visualisatie van lage overvloedige transcripten, met inbegrip van die gelokaliseerd volwassen neuronen in vivo. Dit is vooral belangrijk omdat vele jaren mRNA lokalisatie en translatie bij volwassen axons werd sterk hoofd gezien als ze translationeel als inactief beschouwd werden.
Tot slot presenteren we een nieuwe en promising technologie voor de detectie van ATF4 en mogelijk vele andere mRNA's in volwassen axons van de hersenen van zoogdieren. RNAscope zullen toekomstige studies op mRNA lokalisatie vergemakkelijken en zal helpen om de biologische betekenis van hun lokale vertaling in vivo te ontrafelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
References
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).
