Abstract
mRNA sono spesso localizzate a assoni vertebrati ed è richiesta la loro traduzione locale per assone pathfinding o ramificazione durante lo sviluppo e per la manutenzione, la riparazione o la neurodegenerazione in periodi postdevelopmental. Analisi High Throughput hanno recentemente rivelato che gli assoni hanno un trascrittoma più dinamico e complesso di quanto previsto in precedenza. Queste analisi, tuttavia sono stati per lo più fatto in neuroni in coltura dove gli assoni possono essere isolate dai compartimenti somato-dendritiche. E 'praticamente impossibile raggiungere tale isolamento nei tessuti interi in vivo. Pertanto, al fine di verificare l'assunzione di mRNA e la loro rilevanza funzionale in un animale intero, analisi trascrittoma dovrebbero idealmente essere combinati con tecniche che permettono la visualizzazione di mRNA in situ. Recentemente, sono state sviluppate tecnologie ISH nuove che rilevano RNAs a livello di singola molecola. Ciò è particolarmente importante quando si analizza la localizzazione subcellulare di mRNA, RNA poiché localizzati trovano tipicamente a livelli bassi. Qui si descrive due protocolli per la rilevazione di mRNA assoni-localizzate utilizzando una nuova tecnologia ultrasensibile RNA ISH. Abbiamo unito RNAscope ISH con assonale di contrasto utilizzando la fluorescenza immunoistochimica o coloranti istologici per verificare l'assunzione di ATF4 mRNA di assoni in vivo nel topo matura e cervello umano.
Introduction
Assonale reclutamento mRNA e traduzione locali consentono assoni di rispondere agli stimoli extracellulari in maniera temporalmente e spazialmente acuta 1. Intra-assonale sintesi proteica si comprende meglio nel contesto del neurosviluppo in cui svolge un ruolo cruciale nella crescita comportamento cono 2-8, assone Pathfinding 9-11 e retrogrado segnalazione 12,13. Ma molto meno si sa circa il significato funzionale di assonale sintesi proteica nei neuroni post-sviluppo quando i livelli di mRNA e ribosomi assonale sono notevolmente ridotte 14,15. Assoni vertebrati maturi sono stati a lungo pensato di essere traslazione attivo 16. Tuttavia, studi recenti indicano che la traduzione locale viene riattivato negli assoni maturi in condizioni patologiche. Per esempio, un sottoinsieme di mRNA viene reclutato per assoni rigeneranti seguente è richiesta lesioni nervose e intra-assonale sintesi proteica per la corretta rigenerazione di questi assoni 17. Inoltre, il nostro gruppo has dimostrato che specifici mRNA sono reclutati per assoni dopo l'esposizione locale per la malattia di Alzheimer peptide Ap 1-42, e la traduzione locale del fattore di trascrizione ATF4 è necessaria per propagare gli effetti neurodegenerativi di Ap 1-42 da assoni al soma neuronale 18. Infine, le analisi di throughput elevato hanno rivelato che gli assoni maturi hanno un trascrittoma più complesso e dinamico di quanto previsto 18-21, soprattutto in condizioni patologiche. Alla luce di questi studi, un metodo altamente sensibile e specifico per rilevare è necessario mRNA assoni localizzati nel sistema nervoso adulto.
Gran parte del lavoro sul reclutamento mRNA e traduzione locali negli assoni maturi è stata eseguita su neuroni in coltura. Ciò è particolarmente vero per le analisi del trascrittoma in quanto esistono metodi di coltura specializzate che permettono l'isolamento degli assoni dalla somato-dendritica vano 18-20. Anche se questi studi hanno dato ins preziosiight nel ruolo della traduzione locale di assoni maturi, la questione se i neuroni in coltura rappresentano fedelmente la situazione in vivo o se mRNA reclutamento è una risposta di adattamento degli assoni a condizioni di coltura è ancora aperta. Pochi studi hanno fornito prove di mRNA assunzioni a maturare assoni in vivo. Ad esempio, la trascrizione che codifica per la proteina marcatore olfattivo è stato rilevato in assoni nei neuroni sensoriali adulti 22. Un transgene contenente la 3 'UTR di β-actina mRNA viene trasportato assoni nei neuroni del sistema nervoso centrale e periferico in topi e si traduce localmente dopo periodi di sviluppo 23. Lamin b2 mRNA è localizzato a assoni retinici in Xenopues laevis girini e il suo esaurimento colpisce assone manutenzione dopo lo sviluppo assonale 21. Interferenza con il trasporto assonale della codifica mRNA per citocromo C ossidasi IV altera il comportamento del mouse 24. Infine, ATF4 mRNA si trova in adultiXON di topi e cervelli umani nel contesto di Ap 1-42 indotta neurodegenerazione 18.
Alta velocità effettiva analisi del trascrittoma hanno dimostrato di essere utile per identificare i profili di mRNA in assoni isolati in vitro, ma hanno limitazioni per studi in vivo in quanto nei tessuti interi assoni non si trovano mai isolatamente, ma mescolati con i corpi cellulari neuronali, cellule gliali e altri tipi di cellule. Pertanto, tali analisi devono essere combinati con tecniche di imaging che confermano la localizzazione subcellulare di mRNA. RNA ibridazione in situ (ISH RNA) permette la rilevazione e visualizzazione di specifiche sequenze di RNA in cellule e tessuti. Tuttavia, i saggi originali RNA ISH erano adatte solo per l'identificazione di RNA altamente abbondanti 25, che è raramente il caso di mRNA assoni localizzate. Negli ultimi decenni ci si è messi in via di sviluppo nuove tecnologie che permettono la rilevazione di mRNA a livello di singola molecola
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Protocol
Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC della Columbia University e le linee guida applicabili per la cura e l'uso di animali da laboratorio sono stati seguiti. Nota: Preparare tutti i buffer utilizzati per le procedure ISH in acqua RNase-free o DEPC trattati. Questa raccomandazione non è strettamente necessario dopo ISH è stato completato, ma si suggerisce che buffer sono ancora preparati in acqua bidistillata autoclave e / o sterilizzati grazie al filtro.
1. Individuazione di ATF4 mRNA localizzata a colinergica assoni nel Adult mouse cervello utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) Seguito da immunoistochimica
- Preparazione del campione per le fette di cervello congelati paraformaldeide-fisso
- Per il seguente esempio, preparare le fette di cervello di topo congelati fissi.
- In breve, sacrifica 9 mesi di età i topi da anestesia con ketamina (100 mg kg -1 di peso corporeo) e xilazina (10 mg kg -1 corpo weigHT), seguita da un'infusione transcardial del 4% paraformaldeide in PBS (pH 7,4).
- Rimuovere cervelli e post-fix in paraformaldeide al 4% per 24 ore a 4 ° C.
- Dopo la fissazione, lavare campioni tre volte in PBS e cryoprotect a 30% di saccarosio in PBS (pH 7,4) per 24 ore a 4 ° C.
- Cervelli Incorpora in ottobre congelamento composto, in serie sezione a 20 micron su un criostato e montare su poli-D-lisina vetrini da microscopio trattati. Tenere fettine di cervello a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Rimuovere paraformaldeide-fisso fette di cervello dal congelatore e asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare tre volte con PBS 1x.
- In una cappa aspirante, ri-fix cervello affetta 20 min con paraformaldeide 4% a temperatura ambiente.
NOTA: ATTENZIONE: 4% paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato ed eliminato in modo appropriato seguendo protocolli di sicurezza. - Lavare tre volte con PBS 1x.
- Disidratare fettine di cervello.
- Preparare 50%, 75% e 100%Soluzioni di etanolo.
- Immergere vetrini in etanolo al 50% per 5 minuti a RT.
- Immergere vetrini in etanolo al 75% per 5 minuti a RT.
- Immergere vetrini in etanolo al 100% per 5 minuti a RT.
- Immergere i vetrini in fresco 100% di etanolo per 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: In alternativa, i vetrini possono essere conservati in 100% di etanolo a -20 ° C fino a 1 mese.
- Per il seguente esempio, preparare le fette di cervello di topo congelati fissi.
- Saggio FISH seguita da immunoistochimica utilizzando calore indotta antigene / RNA smascheramento
- Prima di iniziare preparare tutto il materiale necessario:
- Riscaldare il forno di ibridazione a 40 ° C e posizionare una vaschetta contenente acqua distillata in forno per creare un ambiente umidificato.
- Prendete una scatola di diapositive e mettere gli asciugamani di carta imbevuti di acqua distillata all'interno per umidificare la casella di scorrimento. Posizionare la casella di scorrimento nel forno di ibridazione.
- Rimuovere sonde (entrambe le sonde negativi e target) da frigo e riscaldare in forno di ibridazione per 10 min. Lasciate raffreddare le sonde down a temperatura ambiente.
- Equilibrare i reagenti di amplificazione AMP 1-4 (incluso nel kit fluorescente Multiplex Reattivo) a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di recupero dell'antigene: 10 mm di citrato di sodio (pH 6), 0,05% di Tween 20. Nota: soluzione può essere conservata a temperatura ambiente a tempo indeterminato e possono essere usate per la futura colorazione.
- Preparare il tampone di lavaggio 1x diluendo la soluzione 50x azione (incluso nel kit fluorescente Multiplex Reattivo) in acqua RNase-free o DEPC trattati.
NOTA: il tampone di lavaggio 1x può essere conservato a temperatura ambiente per 1 mese e possono essere usate per la futura colorazione. Tampone di lavaggio 50x potrebbe precipitare. Se è così, il calore 50x tampone di lavaggio a 40 ° C per 10 min prima di preparare la soluzione 1x.
- Estrarre i vetrini da 100% di etanolo e asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare una vaschetta Coplin contenente 50 ml di soluzione di recupero dell'antigene. Immergere i vetrini in soluzione recupero dell'antigene e lessateli per 10 minuti in un forno a microonde.
NOTA: In alternativa luogo scorre orizzontalmente in un 100 millimetriDiametro piatto di vetro rotondo contenente 100 ml di soluzione di recupero.- Riempire un bicchiere 1 L con acqua distillata e metterlo nel forno a microonde.
NOTA: L'acqua "tampone" il calore durante l'esecuzione di smascheramento. - Porre i vetrini in soluzione recupero dell'antigene all'interno del forno a microonde. Bollire scorre ad alta potenza per 5 min. Subito dopo i campioni hanno smesso di bollire, calore scivola di nuovo ad alta potenza per extra di 5 min.
- Raffreddare i vetrini a temperatura ambiente.
NOTA: PUNTO CRITICO: ebollizione durata e procedura dovrebbero essere specificati dall'utente, a seconda delle caratteristiche microonde. Il più veloce l'ebollizione inizia maggiore è la probabilità di soluzione evaporazione. In questo caso si raccomanda che i campioni sono bolliti per periodi di tempo più brevi più di due volte per completare un tempo smascheramento totale di 10 min. Al contrario, se si esegue il riscaldamento a potenza media o bassa, smascheramento può essere eseguita una volta per 10 min. Tuttavia, se i campioni non bollire continuously per un totale di circa 10 minuti, questo può comportare smascheramento parziale sia del RNA e proteine bersaglio da rilevare.
- Riempire un bicchiere 1 L con acqua distillata e metterlo nel forno a microonde.
- Lavare i vetrini tre volte con PBS 1x.
- Aggiungere 2-3 gocce (~ 100 microlitri) della sonda dapB impostato su quelle fette di cervello utilizzate per valutare la colorazione di fondo. Nota: La sonda set dapB si rivolge a un gene batterico e non deve rilevare alcuna RNA mammiferi.
- Aggiungere 2 - 3 gocce di sonda targeting impostati a quelle fettine cerebrali utilizzati per rilevare l'RNA di interesse. Nota: un set di sonde di targeting residui 20 - 1.381 del mouse ATF4 mRNA viene utilizzato in questo esempio.
- Coprire i vetrini con parafilm per evitare sonda evaporazione, metterli nella casella diapositiva umidificata all'interno del forno di ibridazione e incubare a 40 ° C per 2 ore.
NOTA: OPTIONAL: fettine di cervello aggiuntivi possono essere ibridate con un set di sonde di targeting del mouse Polr2A e utilizzati come controlli positivi. - Wash slides due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2-3 gocce di amplificazione reattivo AMP 1-FL a ogni fetta cerebrale, coprire i vetrini con parafilm, metterli in scatola diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2-3 gocce di amplificazione reattivo AMP 2-FL a ogni fetta cerebrale, coprire i vetrini con parafilm, metterli in scatola diapositive e incubare a 40 ° C per 15 minuti nel forno di ibridazione.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2-3 gocce di amplificazione reattivo AMP 3-FL a ogni fetta cerebrale, coprire i vetrini con parafilm, metterli in scatola diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2-3 gocce del reagente di amplificazione AMP 4 FL a ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli inscivolo box e incubare a 40 ° C per 15 min in forno ibridazione.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente e due volte con PBS 1x.
- Aggiungere 100-200 microlitri (o volume sufficiente a coprire completamente fette) di una soluzione di saturazione contenente 3 mg / ml BSA, glicina 100 mM e 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) per le diapositive, coprire con parafilm e incubare per 30 minuti a RT.
- Aggiungere 100-200 ml di anticorpo anti-ChAT diluito in una soluzione bloccante (1/100) per le diapositive, coprire con parafilm e incubare per 2 giorni a 4 ° C. Assicurarsi che le fette di cervello non si asciugano. Se necessario, riapplicare soluzione di anticorpi anti-chat per fettine di cervello di 24 ore dopo l'incubazione.
- Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 100-200 ml di anticorpo secondario Alexa coniugato adeguato (es., Alexa-594 asino anti-capra per questo particolare esempio) per le diapositive, coprire con parafilm e incubmangiato per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini una volta con acqua distillata.
- Montare i vetrini con mezzo di montaggio-DAPI contenenti.
- Visualizzare fette di cervello sotto un microscopio a fluorescenza.
- Prima di iniziare preparare tutto il materiale necessario:
2. Individuazione di ATF4 mRNA localizzato a assoni in campioni di cervello umano per mezzo di ibridazione in situ (CISH) Seguito da Luxol Fast Blue e violetto cresolo Controcolorazione
- Preparazione dei campioni per i campioni di cervello umano inclusi in paraffina fissati in formalina
- Cuocere le fette in forno a secco a 60 ° C per 1 ora.
- Deparaffinare fettine di cervello in una cappa aspirante.
NOTA: ATTENZIONE: i reagenti sono tossici e devono essere gestiti e smaltiti seguendo le linee guida di sicurezza appropriate- Immergere i vetrini in xilene stanza di compensazione alternativa due volte per 10 min.
- Immergere i vetrini in etanolo al 100% due volte per 1 min.
- Lafette ir-secco 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: In alternativa i campioni possono essere asciugati a RT O / N, ma devono essere utilizzati entro 24 ore.
- Diamminobenzidina (DAB) a base di test ISH cromogenico seguito da Luxol veloce macchia blu-violetto e cresil utilizzando indotta dal calore e la proteasi indotta RNA smascheramento
- Prima di iniziare preparare i materiali necessari:
- Riscaldare il forno di ibridazione a 40 ° C e posizionare una vaschetta contenente acqua distillata per creare un ambiente umidificato.
- Prendete una scatola di diapositive e mettere gli asciugamani di carta imbevuti di acqua distillata all'interno per umidificare la casella di scorrimento. Posizionare la casella di scorrimento nel forno di ibridazione.
- Preparare 1x Pretrattare 2 diluendo la soluzione 10x (inclusa nel kit CISH reagente) in acqua RNase-free o DEPC trattati. Se pretrattamento viene eseguito su una piastra calda, aggiungere 100 ml di soluzione Pretrattare ad un piatto di vetro del diametro di 100 mm e aumentare la superficie di contatto tra il piatto e la piastra calda (se pretrattamentoviene eseguito in un forno a microonde, una vaschetta Coplin può essere utilizzato invece come specificato in 1.2.3). Soluzione di calore a 100 ° C e mantenerla non più di 30 min bollente prima sommergendo campioni.
- Calore sonde negativi e positivi 10 min a 40 ° C e raffreddare a temperatura ambiente.
- Equilibrare i reagenti di amplificazione AMP 1-6 (incluso nel kit CISH reagente) a temperatura ambiente.
- Preparare il tampone di lavaggio 1x diluendo la soluzione 50x azione (incluso nel kit di reagenti CISH) in acqua distillata. Nota: 1x tampone di lavaggio può essere conservato a temperatura ambiente per 1 mese e possono essere usate per la futura colorazione.
- Aggiungi ~ 4 gocce (~ 120 microlitri) di Pretrattare 1 per ogni fetta cerebrale, coprire con parafilm e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Lavare 3 a 5 volte in acqua distillata fresca.
- Eseguire smascheramento calore indotto:
- Trasferire i vetrini a caldo Pretrattare 2 (incluso nel kit di reagenti CISH) di soluzione e far bollire per 15 minuti. Nota: Boiling può essere eseguita su un piatto caldo per garantireebollizione continua o in un forno a microonde seguendo i punti critici indicati 1.2.3).
- Trasferire immediatamente i vetrini di acqua distillata e lavare 3 a 5 volte.
- Lavare i vetrini 3 a 5 volte a fresco al 100% di etanolo.
- Far asciugare le fette 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: O alternativa fette possono essere essiccati / N.
- Eseguire smascheramento proteasi indotta:
- Aggiungere 4 gocce di Pretrattare 3 (incluso nel kit di reagenti CISH), coprire con parafilm e incubare 30 minuti a 40 ° C in forno ibridazione.
- Lavare i vetrini da 3 a 5 volte in acqua fresca distillata.
- Aggiungere 4 gocce di sonda dapB impostato su quelle fette di cervello utilizzate per valutare la colorazione di fondo.
- Aggiungere 4 gocce di sonda di targeting impostato quelle fettine cerebrali utilizzati per rilevare l'RNA di interesse.
NOTA: Un set di sonde di targeting residui 15 - 1.256 del ATF4 mRNA umano è utilizzato in questo esempio. OPTIONAL: fettine di cervello aggiuntivi possono essere hybridized con un set di sonde di targeting PPIB umano e usati come controlli positivi. - Mettere diapositive nella casella di scorrimento e incubare per 2 ore. a 40 o C in forno ibridazione.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 gocce di AMP 1 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 gocce di AMP 2 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 15 minuti nel forno di ibridazione.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 gocce di AMP 3 reagenti per ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione.
- Lavare i vetrini due volte con 1x erah buffer per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 gocce di AMP 4 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 15 minuti nel forno di ibridazione.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 gocce di AMP 5 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm e incubare 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 gocce di AMP 6 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm e incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Mescolare uguale volume di BROWN-1 e BROWN-2 reagenti (incluso nel kit di reagenti CISH), aggiungere ~ 120 ml di soluzione per ogni fetta cerebrale, coprire con parafilm e incubare 10 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente e sciacquare una volta in acqua distillata.
NOTA: passaggi critici: i seguenti passaggi sono fondamentali perottenere un ottimale di contrasto assonale senza mascherare la presenza di granuli di RNA. - Prima di eseguire di contrasto verificare la presenza di mRNA di interesse al microscopio campo chiaro. Definire le aree di riferimento nei campioni di cervello in cui monitorare la presenza di puncta durante tutta la procedura di contrasto.
- Luxol Preriscaldare soluzione blu veloce a 60 ° C.
- Collocare i vetrini in Luxol blu veloce e incubare 30 minuti a 60 ° C.
- Sciacquare più volte in acqua distillata.
- Dip scorre più volte in 0,05% di soluzione di carbonato di litio per iniziare differenziazione.
- Dip vetrini due volte in fresco 75% di etanolo.
- Risciacquare in acqua distillata.
- Controllare fettine di cervello al microscopio campo chiaro. Si noti che la materia grigia e bianca dovrebbe iniziare ad essere granuli distinguibili e RNA ancora visibili come blu scuro / puncta nero. Verificare che gli assoni alla prima comparsa come luce blu fibre.
- Ripetere i passaggi da 2.2.28 a 2.2.32. Perform incubazione con Luxol veloce soluzione di blu in 10-20 min passi, controllando attentamente la di contrasto e la presenza di granuli di RNA. Nota: in genere, di contrasto ottimale è acquisito in 60-90 minuti (tempo totale di incubazione), ma il tempo può essere ridotto se si sospetta che i granuli di RNA potrebbero essere mascherati dalla Luxol veloce macchia blu (vedi figura 2 per gli esempi).
- Incubare i vetrini in soluzione violetto cresolo per 10 minuti a RT.
- Sciacquare i vetrini in acqua distillata.
- Dip vetrini da 5 a 10 volte in 70% di etanolo.
- Disidratare fettine di cervello attraverso 3 rapidi cambi di etanolo al 100%.
- In una cappa aspirante, chiare fettine cerebrali incubando due volte in xilene agente di compensazione alternativa a 2 min e una terza volta per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Fettine di Monte cerebrali in mezzo di montaggio permanente basato xilene.
- Analizzare i campioni al microscopio campo chiaro.
- Prima di iniziare preparare i materiali necessari:
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Representative Results
Un breve riassunto delle procedure sopra descritte è mostrato nella figura 1.
Rilevazione ottimale di ATF4 mRNA granuli negli assoni colinergici con smascheramento indotta dal calore
Nel valutare la localizzazione assonale di mRNA, è fondamentale per poter identificare gli assoni e di essere in grado di visualizzare bassa RNAs abbondanti. La tecnologia di RNA ISH qui descritta consente il rilevamento di RNA ad una risoluzione di una singola molecola. Protocolli standard che utilizzano questa tecnologia suggeriscono la combinazione di due procedure di smascheramento di rilevare in modo efficiente RNA bersaglio: proteasi-indotta e calore indotta smascheramento 28. Tuttavia, quando ISH è combinato con l'immunoistochimica per identificare gli assoni, smascheramento proteasi indotta potrebbe non comportare ottimale rilevazione dell'antigene 29.
Nel primo protocollo qui descritto, la digestione proteasica è stato evitato, poiché l'anticorpo utilizzato non riconosceva cacetiltransferasi holine (chat) di solito si trovano negli assoni dei giro dentato derivanti dal percorso septohippocampal (Figura 2A e B), anche se sono stati rilevati granuli mRNA positivi. Recupero con 10 mM tampone citrato (pH 6) indotta calore, invece, assicurata l'integrità dell'epitopo riconosciuto dagli anticorpi anti-ChAT e mRNA è stato rilevato in modo efficiente assoni ChAT macchiate (Figura 2C e D). I risultati presentati qui (Figura 2) mostrano la presenza di ATF4 nel giro dentato di topi adulti dove mRNA reclutamento e la traduzione locale sono stati indotti da infusione di Ap 1-42 oligomeri nell'ippocampo. Prove precedenti suggerisce che ATF4 mRNA non viene rilevato in assoni in vitro o in vivo in condizioni basali 18, e quindi un tale paradigma sperimentale non è mostrato.
Rilevazione ottimale di ATF4granuli mRNA in assoni utilizzando sia smascherare indotta dal calore e la proteasi indotta
Considerando che i risultati sopra descritti mostrano che l'anticorpo basato la rilevazione di proteine è compatibile con la tecnologia dell'RNA ISH durante l'esecuzione di calore indotta smascheramento potrebbe non essere utile se è necessario proteasi pre-trattamento. Sezione 2 descrive il rilevamento di ATF4 mRNA all'interno assoni seguendo le procedure precedentemente pubblicati 28,30 combinate con macchie istologiche tipicamente utilizzati per i campioni di cervello 31,32.
Un passo importante in questa procedura è la di contrasto ottimale delle fibre mieliniche utilizzando Luxol blu veloce (LFB) senza mascherare la presenza di granuli di mRNA negli assoni colorati con CISH. Reagenti utilizzati per questo scopo permettono di contrasto ottimale con LFB seguenti tempi di incubazione di 60 a 90 min. Di contrasto non potrebbe riuscire quando entrambe le volte di temperatura e di incubazione sono diminuiti (figura 3A e inserto, e dati non mostrato) unand sebbene granuli di mRNA saranno ancora visibili, la loro localizzazione assonale non può essere verificata. D'altra parte, incubando cervello campioni per 60 min o più a 60 o C senza monitorare la presenza di granuli positivi periodicamente potrebbe comportare mascheramento irreversibile del mRNA di interesse dal colorante (Figura 3B e riquadro). Si raccomanda pertanto che i campioni vengono incubati in LFB per 30 min e che un'ulteriore incubazione viene effettuata gradualmente controllando i campioni ogni 10 a 20 minuti per ottenere una colorazione ottimale sia degli assoni e granuli di RNA (Figura 3D-F). Seguendo queste linee guida ATF4 granuli positivi possono essere chiaramente individuati sia nel controllo (Figura 3D) e malattia (figura 3F) campioni di cervello di Alzheimer.
Flusso di lavoro Figura 1. Riassuntidi RNA ISH seguito di contrasto assonale. Passi raffigurati in nero sono comuni alle due procedure esemplificati. Passi evidenziate in blu sono specifiche per i campioni paraformaldeide fissati colorati con ISH fluorescente mentre quelli evidenziati in rosso sono specifici per i campioni inclusi in paraffina fissati in formalina colorati con ISH cromogenico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. FISH per ATF4 mRNA localizzata assoni colinergici nel giro dentato di topi adulti. FISH è stata effettuata utilizzando proteasi indotta (l pannello EFT) o smascherare indotta dal calore (pannello di destra), seguita da rilevazione di anticorpi di colina acetiltransferasi (ChAT) . Il ANTIBody non ha riconosciuto chiacchierare quando è stato effettuato il trattamento della proteasi. Vengono mostrati esempi di risultati ottenuti con una sonda non-targeting (dapB) e sonda il ATF4 -targeting utilizzando le stesse impostazioni microscopio e le regolazioni dell'immagine. ATF4 granuli -positive con localizzazione assonale chiaro sono indicati con punti interrogativi, mentre granuli localizzati sono contrassegnati come " ok ". Scala bar 20μm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. CISH per ATF4 mRNA localizzata assoni mielinizzati nella formazione dell'ippocampo umano. A seguito di ISH, gli assoni sono stati di contrasto con Luxol blu veloce (LFB) e somata neuronali sono state di contrasto con violetto cresolo. Subottimale colorazione LFB potrebbe provocare sia la temperatura (A e inserto rappresentano campioni colorati con LFB a 40 o C per 4 ore.) E il tempo di incubazione (non mostrato) sono diminuiti, o quando di contrasto non è verificata dopo brevi periodi di incubazione (B e inserto ). Esempi di ottima colorazione LFB combinato con ISH utilizzando una sonda non-targeting (dapB) o la sonda ATF4 -targeting sono mostrati (CF e inserti). Acquisizione immagine è stata regolata automaticamente per la migliore rapporto segnale-rumore. ATF4 granuli -positive con localizzazione assonale chiaro sono indicati con punti interrogativi, mentre granuli localizzati sono contrassegnati come "ok". Scala bar 50 micron, Profili laterali 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo rapporto si descrive l'uso di una tecnologia ISH ad alta risoluzione per il rilevamento di assoni localizzato ATF4 mRNA. Questi ed precedenti studi pubblicati dimostrano che questa tecnologia è compatibile con la rilevazione di proteine a base di anticorpi in tessuti o addirittura embrioni interi 33. Importante, è stato recentemente utilizzato per il rilevamento di Arc mRNA all'interno dendriti dei neuroni ippocampali 34. Può anche essere combinato con coloranti istologici per colorazione dei tessuti. Infine, è adatto per la rivelazione simultanea di destinazione multipla RNAs 28,30,33. Questi risultati esemplificano la versatilità di alta risoluzione tecnologie RNA ISH e piccole modifiche dei protocolli originali non diminuiscono la sensibilità di questo metodo.
Protocolli originali che descrivono l'uso di sonde Z-struttura per individuare mRNA di interesse nei tessuti con una risoluzione singola molecola suggeriscono due passi per mRNA smascherare coinvolgeproteasi digestione e campione bollente 30,35. Qui mostriamo come proteasi indotta smascherando negativamente colpisce la rilevazione a base di anticorpi di successo di chiacchiere in assoni colinergici derivanti dal percorso setto-ippocampale (Figura 2A e B). Così, abbiamo deciso di escludere questo passo ed eseguire solo smascherare indotta dal calore se di contrasto assonale comportato l'utilizzo di anticorpi. Come mostrato (Figura 2C e D), gli assoni colinergici possono essere visualizzati con un anticorpo anti-chat e granuli ATF4 mRNA erano rilevabili evitando proteasi digestione. Si noti che il rilevamento positivo di ATF4 mRNA si basa sulla fluorescenza di fondo ottenuto dalla sonda negativo. Un controllo supplementare può essere incluso in questo punto trattando campioni di cervello con RNasi e sondando con le sonde del mouse ATF4 al fine di testare la loro specificità. Questo passaggio non è tuttavia incluso nelle procedure qui dalprecedente spettacolo prove, utilizzando la stessa tecnologia, un esaurimento completo di ATF4 mRNA in assoni dopo l'iniezione siRNA nell'ippocampo di topo 18. Tali risultati dimostrano la specificità delle sonde ISH usati qui. L'uso di controlli, oltre alle sonde negativi deve essere valutata in base a particolari questioni scientifiche. Infine, dal recupero di calore indotta può essere sostituito con o combinate con smascheramento proteasi indotta a seconda delle esigenze del anticorpo utilizzato per assone controcolorazione. La scelta di utilizzare una o altra procedura o la combinazione di entrambi dovrebbero essere empiricamente determinata dall'utilizzatore.
Durante l'esecuzione di proteasi e smascherare calore indotta nei campioni del cervello umano, coloranti istologici può sostituire a base di anticorpi di contrasto assonale. Anche se il protocollo originale qui seguita suggerisce l'uso di ematossilina per il tessuto controcolorazione 30, tale colorante non è adatto per assone colorazione. Così, Luxol fast blu è stato utilizzato per colorare assoni mielinizzati e violetto cresolo è stato utilizzato per visualizzare corpi cellulari neuronali. LFB, sviluppato da Kluever e Barrera 31, è stata scelta tra altre macchie perché può essere completato in meno di 2 ore e se la differenziazione è ottimizzato (Figura 3C-F) alla luce blu macchia non interferisce con i granuli di mRNA che appaiono come scuro puntini marrone-nero. Come illustrato (figura 3), di contrasto ottimale LFB può essere eseguita quando incubando i campioni a 60 ° C per 60 - 90 min. Si raccomanda tuttavia che l'incubazione è effettuata per gradi in modo che la differenziazione può essere attentamente monitorato e granuli di mRNA sono sempre visibili. Altre tecniche istologiche, come l'argento rendimento colorazione assone grigio-nero del Bielchowsky o Bodian di colorazione 36 che potrebbero non essere compatibili con la reazione cromogenica basato DAB-scelto in questa relazione. , Tali tecniche di colorazione probabili dovrebbero essere combinati con l'RNA CISH saggiche consentono l'uso di coloranti alternativi come il fast rosso o verde HRP 30. Scegliere la combinazione appropriata di RNA ISH saggi e le macchie assonale dovrebbe essere empiricamente determinato dall'utente.
Una limitazione della prima procedura descritta nella presente relazione è la rilevazione delle proteine non riuscito di immunoistochimica se non viene eseguita proteasi digestione. Questa limitazione può essere superata evitando smascheramento proteasi indotta. Nel caso particolare di assoni-localizzato ATF4 eseguendo smascheramento indotta dal calore era sufficiente a rilevare i granuli di mRNA sopra i livelli di fondo in assoni colinergici. Questo però potrebbe non essere il caso per altri mRNA di interesse e la proteasi digestione potrebbe essere necessaria. In caso affermativo, di contrasto assonale deve essere eseguita utilizzando anticorpi diversi l'anticorpo anti-ChAT qui descritto. In alternativa, di contrasto a base di anticorpi potrebbe essere sostituito con coloranti istologici come descritto nella sezione 2 del protocollo.
30.
Come indicato nella sezione del protocollo, una delle fasi critiche di entrambe le procedure è smascheramento calore indotto. Se bollente viene eseguito in un forno a microonde, ci sono possibilità di soluzione evaporazione a seconda delle caratteristiche del dispositivo. Seguire i passaggi indicati in 1.2.3 e 2.2.4 per evitare l'evaporazione soluzione. Per fissa congelato tessuto 10 min di smascheramento dovrebbe essere sufficiente, mentre per paraffinatessuti bollente per 15 minuti è raccomandato. Se i campioni non bollire continuamente per il tempo consigliato questo potrebbe causare smascheramento parziale. Tuttavia i tempi potrebbero variare leggermente se altri dispositivi, come una pentola di riso o un piatto caldo sono scelti al posto di un forno a microonde. Durata ebollizione deve essere determinato dall'utente, a seconda del metodo.
Un altro passo importante è la LFB di contrasto. È importante che l'intensità del colorante blu non interferisce con la visualizzazione dei granuli di mRNA. Alcune modifiche al protocollo originale 31 sono stati eseguiti in modo da ridurre l'intensità del colorante, ad esempio diminuendo la temperatura (Figura 3A) o il tempo di incubazione (dati non mostrati), tuttavia non siamo riusciti a distinguere chiaramente assoni mielinizzati in campioni di cervello umano . D'altra parte, incubando i campioni in soluzione LFB alla temperatura suggerita (60 o C) determinato colorazione ottimale di assoni mielinizzati. Essoè comunque consigliabile di contrasto viene effettuata per gradi monitorando con attenzione la presenza di granuli di RNA in ogni momento per garantire che LFB non maschera l'mRNA di interesse, come specificato nei passaggi 2.2.28-2.2.36.
Infine, i campioni non devono mai asciugarsi. I metodi descritti in questo rapporto coinvolgono molteplici fasi di incubazione a 40 ° C, il che aumenta le possibilità di evaporazione reagente. Come indicato nei protocolli, i campioni devono essere coperte con parafilm in tutte le fasi per evitare l'evaporazione.
In sintesi, lo sviluppo di alta risoluzione RNA ISH e altri metodi ISH abilita la visualizzazione di trascritti basso abbondante, comprese quelle localizzato assoni adulti in vivo. Ciò è particolarmente importante in quanto per molti anni mRNA localizzazione a e alla traduzione nei assoni adulti è stato molto trascurato come sono stati considerati translationally inattiva.
In conclusione, vi presentiamo un romanzo e prtecnologia omising per il rilevamento di ATF4 e potenzialmente molti altri mRNA in assoni adulti del cervello dei mammiferi. RNAscope agevolerà i futuri studi sulla localizzazione mRNA e contribuirà a svelare il significato biologico della loro traduzione locale in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
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