Abstract
mRNAはしばしば、脊椎動物軸索に局在していると、地元の翻訳は、軸索の経路探索やpostdevelopmental期間中、開発中の分岐やメンテナンスのため、修理または神経変性のために必要とされます。ハイスループット分析は最近、軸索は、以前に予想以上にダイナミックで複雑なトランスクリプトームを持っていることを明らかにしました。これらの分析は、しかし、主に軸索はsomato樹状コンパートメントから単離することができる培養神経細胞で行われてきました。これは、in vivoでの組織全体でそのような分離を達成することは事実上不可能です。したがって、mRNAの採用や、動物全体におけるそれらの機能的関連性を検証するために、トランスクリプトーム解析は、理想的には、 その場でのmRNAの可視化を可能にする技術と組み合わせる必要があります。最近では、単一分子レベルでのRNAを検出する新規なISH技術が開発されています。 mRNAの細胞内局在を分析する際に特に重要です、ローカライズされたRNAは、典型的には、低レベルで見出されているからです。ここでは、新規の超RNA ISH技術を使用して、軸索に局在するmRNAの検出のための2つのプロトコルを記述します。我々は、成熟したマウスとヒトの脳におけるin vivoでの軸索にATF4 mRNAの募集を検証するために、蛍光免疫組織化学または組織学的染料を使用して軸索対比でRNAscope ISHを組み合わせています。
Introduction
軸索のmRNAの募集とローカル翻訳は、時間的および空間的に急性様式1に細胞外刺激に応答する軸索を可能にします。イントラ軸索タンパク質合成は、最良の軸索は、9-11を経路探索し、逆行12,13シグナリング 、それは成長円錐の動作2-8において重要な役割を果たしている神経発達の文脈で理解されています。軸索のmRNAとリボソームのレベルが大幅に14,15に減少している場合にははるかに少ないが、ポスト発達神経細胞における軸索タンパク質合成の機能的意義について知られています。成熟した脊椎動物の軸索は、長い16翻訳不活性であると考えられてきました。しかし、最近の研究では、地元の翻訳は、病理学的条件の下で成熟した軸索に再活性化されることを示しています。例えば、mRNAのサブセットは、神経損傷およびイントラ軸索タンパク質合成は、これらの軸索17の正確な再生のために必要とされる以下の再生軸索に補充されます。さらに、当社グループヘクタールSは、特定のmRNAがアルツハイマー病ペプチドAβ1-42へのローカルの暴露後に軸索に動員されることを実証し、転写因子ATF4のローカル翻訳は軸索のニューロンの細胞体18へのAβ1-42の神経変性作用を伝播するために必要です。最後に、ハイスループット分析は、成熟した軸索は、特に病理学的条件下で、18-21予想以上に複雑で動的なトランスクリプトームを持っていることを明らかにしました。これらの研究に照らして、成体の神経系において軸索局在化するmRNAを検出するための高感度かつ特異的な方法が必要とされています。
成熟した軸索におけるmRNA動員およびローカル翻訳の作業の多くは培養ニューロンに行われています。特殊な培養方法はsomato樹状区画18-20からの軸索の単離を可能にする存在するため、トランスクリプトーム解析のために、これは特にそうです。このような研究は、貴重なインを与えているが、成熟した軸索の現地翻訳の役割にIGHTは、培養神経細胞を忠実に生体内でまたはmRNAの募集は、培養条件への軸索の適応応答である場合は、状況を表しているかどうかの質問はまだ開いています。いくつかの研究は、in vivoで軸索を成熟mRNAの動員の証拠を提供しました。例えば、嗅覚マーカータンパク質をコードする転写物は、成人の感覚ニューロンにおける軸索22で検出されています。 βアクチンのmRNAの3 'UTRを含む導入遺伝子は、マウスにおいて、末梢および中枢神経系ニューロンにおける軸索に輸送され、局所的に発達期間23の後に翻訳されます。ラミンB2 mRNAはXenopuesにおける網膜軸索に局在しているオタマジャクシをアフリカツメガエル、その枯渇は軸索の開発21た後、軸索の維持に影響を与えます。チトクロームCオキシダーゼIVをコードするmRNAの軸索輸送との干渉は、マウスの動作24を変化させます。最後に、ATF4 mRNAが成人aで発見されましたAβ1-42との関連で、マウスとヒトの脳のxonsは、神経変性18を誘発しました。
ハイスループットのトランスクリプトーム分析は、 インビトロで 、単離された軸索中のmRNAプロファイルを同定するために有用であることが証明さが、全体の組織の軸索における以降のインビボ研究は単独で見つからないが、神経細胞体、グリア細胞および他の細胞型と混在んために限界があるています。したがって、このような分析は、mRNAの細胞内局在を確認する画像技術と組み合わせされなければなりません。 in situハイブリダイゼーション （RNA ISH） における RNAは、細胞および組織中の特定のRNA配列の検出および視覚化を可能にします。ただし、元のRNA ISHアッセイは、まれにしか軸索ローカライズされたmRNAのためのケースではありません非常に豊富RNAを25の同定に適していました。努力を増加させる最後の数十年のために、単一分子レベルでのmRNAの検出を可能にする新たな技術の開発に置かれています
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Protocol
すべての動物の手順はコロンビア大学のIACUCによって承認されたと実験動物の管理と使用に適用可能なガイドラインに従いました。注：RNaseフリーまたはDEPC処理水でISH手順に使用されるすべてのバッファを準備します。この推奨は、ISHが完了した後に厳密には必要ではないが、それは、バッファがまだオートクレーブ再蒸留水中で調製および/または濾過により滅菌されていることが示唆されています。
免疫組織化学が続くin situハイブリダイゼーション （FISH） の蛍光を用いて、1成体マウスの脳内コリン作動性軸索にATF4 mRNAの局在の検出を
- パラホルムアルデヒド固定凍結脳切片のためのサンプル調製
- 次の例では、固定された冷凍マウスの脳からのスライスを用意します。
- 簡単に述べると、ケタミンで麻酔により9ヶ月齢のマウスを屠殺（100mgのキログラム-1体重）およびキシラジン（10mgの量kg -1ボディweigHT）をPBS中の4％パラホルムアルデヒド（pH7.4）中のtranscardial注入しました。
- 4 O℃で24時間、4％パラホルムアルデヒドで脳とポストフィックスを削除します
- 固定後、4 O℃で24時間、PBS（pH7.4）中でサンプルを30％スクロースPBSで三回洗浄しcryoprotect
- 10月に埋め込む脳をクリオスタット上で20ミクロンでシリアル部、化合物を凍結し、ポリ-D-リジン処理した顕微鏡スライド上にマウントします。使用するまで-20 O C で脳スライスをしてください。
- RTで30分間冷凍庫空気乾燥からパラホルムアルデヒド固定脳スライスを削除します。
- 1×PBSで3回洗浄します。
- ヒュームフードでは、再修正脳を室温で4％パラホルムアルデヒドで20分をスライス。
注：注意：4％パラホルムアルデヒドは毒性があり、安全性のプロトコルに従って適切に処理して廃棄しなければなりません。 - 1×PBSで3回洗浄します。
- 脳スライスを脱水。
- 50％、75％および100％の準備エタノール溶液。
- RTで5分間、50％エタノールでスライドを浸し。
- RTで5分間、75％エタノールでスライドを浸し。
- RTで5分間、100％エタノールでスライドを浸し。
- 室温で5分間、新鮮な100％エタノールでスライドを浸し。注：また、スライドは1ヶ月までのC oを -20℃の100％エタノール中で保存することができます。
- 次の例では、固定された冷凍マウスの脳からのスライスを用意します。
- FISHアッセイは、熱誘導抗原/ RNAのアンマスキングを使用して、免疫組織化学が続きます
- 開始する前に必要なすべての材料を準備します。
- 40°Cのへのハイブリダイゼーションオーブンを加熱し、加湿環境を作成するために、オーブンで蒸留水を入れたトレイを置きます。
- スライドボックスを取り、内側スライドボックスを加湿するために蒸留水に浸したペーパータオルを置きます。ハイブリダイゼーションオーブンでスライドボックスを配置します。
- 冷蔵庫からプローブ（陰性とターゲットプローブの両方）を取り外し、10分間のハイブリダイゼーションオーブンでそれらを加熱します。プローブはダウを冷ましますRTでN。
- RTで（蛍光マルチプレックス試薬キットに含まれる）増幅試薬AMP 1-4を平衡化します。
- 抗原回復溶液を調製：10mMのクエン酸ナトリウム（pHは6）、0.05％ツイーン20を注：溶液が無期限にRTで保存することができ、将来の染色のために使用されます。
- RNaseフリーまたはDEPC処理水に（蛍光マルチプレックス試薬キットに含まれる）50×ストック溶液を希釈し、1×洗浄バッファーを準備します。
注：1×洗浄緩衝液は、1ヶ月間室温で保存することができ、将来の染色のために使用されます。 50倍の洗浄緩衝液は沈殿することがあります。 10分間、40°Cの時そうである場合、熱50X洗浄緩衝液1×溶液を調製する前に。
- 室温で5分間、100％エタノールと空気乾燥からスライドを削除します。
- 抗原回復溶液50 mlを含有するコプリンジャーを準備します。抗原回復溶液中にスライドを浸漬し、電子レンジで10分間、それらを沸騰。
注：代わりに100ミリメートルに水平にスライドを置きます検索溶液100mlを含有する直径丸いガラス皿。- 蒸留水で1リットルのビーカーを記入し、電子レンジに入れてください。
注：アンマスキングを行う際に水が熱を「バッファ」になります。 - 電子レンジ内部の抗原回復溶液中でスライドを配置します。沸騰を5分間高出力で摺動します。サンプルが沸騰停止した直後に、熱が余分に5分間のハイパワーで再びスライドします。
- 室温でスライドをクールダウン。
注：重要なステップ：沸騰時間および手順は、マイクロ波の特性に応じて、ユーザによって決定されるべきです。速く沸騰が高い溶液の蒸発の可能性を開始します。この場合には、サンプルは10分間2回の合計アンマスキング時間を完了するために、より多くのより短い期間で煮沸することをお勧めします。加熱が中または低電力で行われた場合、逆に、マスク解除を10分間一回行うことができます。しかし、場合にサンプルがcontinuouslを沸騰しません約10分の合計yが、これは、検出されるべき標的RNAとタンパク質の両方の部分的なアンマスキングをもたらすかもしれません。
- 蒸留水で1リットルのビーカーを記入し、電子レンジに入れてください。
- 洗浄は、1×PBSで3回スライドさせます。
- バックグラウンド染色を評価するために使用されるものの脳切片に設定のdapBプローブの3滴（約100μl）を- 2を加えます。注： のdapBのプローブセットは、細菌の遺伝子を標的とし、任意の哺乳動物のRNAを認識すべきではありません。
- 関心のあるRNAを検出するために使用されるもの脳切片に設定ターゲッティングプローブの3滴 - 2を加えます。注：残基20ターゲッティングプローブセット-マウスATF4のmRNAの1381は、この例で使用されます。
- パラフィルムでカバースライドを、プローブの蒸発を防ぐため、ハイブリダイゼーションオーブン内の加湿スライドボックスに置き、2時間40 O C でそれらをインキュベートします。
注：オプション：追加の脳切片は、マウスPolr2Aを標的プローブセットとハイブリダイズし、ポジティブコントロールとして使用することができます。 - ウォッシュSLIデ回室温で2分間、1×洗浄緩衝液で。
- 、各脳スライスに増幅試薬AMPの3滴1-FLパラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで30分間、40°Cのでインキュベート- 2を追加します。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- 、各脳スライスに増幅試薬AMP 3滴の2-FLパラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで15分間40°Cのでインキュベート- 2を追加します。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- 、各脳スライスに増幅試薬AMP 3滴の3-FLパラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで30分間、40°Cのでインキュベート- 2を追加します。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- 2追加 - 各脳スライスに増幅試薬AMP 4-FLの3滴を、それらを配置し、パラフィルムでスライドをカバースライドボックスとは、ハイブリダイゼーションオーブンで15分間40°Cのインキュベート。
- 洗浄は、再度1×PBSでRTとで2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- 100追加 - スライドに3 mg / mlのBSA、100mMのグリシンおよび0.25％トリトンX-100 PBS中液（pH7.4）を含有するブロッキング溶液を（完全にスライスをカバーするか、十分な体積）200μLを、パラフィルムでそれらをカバーしRTで30分間インキュベートします。
- 、スライドに溶液（1/100）をブロックに希釈した抗のChAT抗体200μlのパラフィルムでそれらをカバーし、4 O℃で2日間インキュベート- 100を追加します。脳切片が乾燥しないことを確認します。必要に応じて、24時間インキュベーションした後の脳切片に対する抗のChAT抗体溶液を再適用します。
- 洗浄は、室温で5分間、1×PBSで3回スライドします。
- 100追加-適切なアレクサ結合二次抗体を200μlを（ 例えば 、この特定の例のためのAlexa-594ロバ抗ヤギ）のスライドには、パラフィルムおよびincubでカバーRTで1時間食べました。
- 洗浄は、室温で5分間、1×PBSで3回スライドします。
- 洗浄を蒸留水で1回スライドします。
- マウントは、DAPI含有マウント培地で摺動します。
- 蛍光顕微鏡下で脳切片を視覚化。
- 開始する前に必要なすべての材料を準備します。
ルクソールファーストブルーとクレシルバイオレット対比が続くin situハイブリダイゼーション （CISH） で発色を用いてヒト脳試料中の軸索にATF4 mRNAの局在の2検出
- ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト脳サンプルのためのサンプル調製
- 1時間60°Cの時の乾燥オーブンで焼くスライス。
- ヒュームフード内で脱パラフィン脳切片。
注：注意：試薬は、毒性であり、適切なセキュリティガイドラインに従って取り扱い、廃棄しなければなりません- 10分間二回キシレン代替クリアリング剤でスライドを浸し。
- 1分間、二回、100％エタノール中でスライドを浸し。
- AIR乾燥スライスRTで5分。注：別の方法として、サンプルは、RT Oで乾燥されることがあり/ Nが、24時間以内に使用しなければなりません。
- ジアミノベンジジン（DAB）は、熱誘導およびプロテアーゼ誘発性RNAのアンマスキングを使用して、ルクソールファースト青とクレシルバイオレット染色に続いて発色ISHアッセイをベース
- 開始する前に、必要な材料を準備します。
- 40°Cのへのハイブリダイゼーションオーブンを加熱し、加湿環境を作成するために、蒸留水を含有するトレイを置きます。
- スライドボックスを取り、内側スライドボックスを加湿するために蒸留水に浸したペーパータオルを置きます。ハイブリダイゼーションオーブンでスライドボックスを配置します。
- RNaseフリーまたはDEPC処理水（CISH試薬キットに含まれる）10×ストック溶液を希釈することにより、1×前処理2を準備します。前処理は、ホットプレート上で行われる場合、前処理の場合（皿と熱板との間の接触面を増加させるために直径100mmのガラス皿に前処理溶液100mlを加えます）1.2.3で指定されたコプリンジャーの代わりに使用することができ、マイクロ波中で行われます。 100°Cまでの熱ソリューションは、サンプルを浸漬する前に、もう30分以上沸騰それ を維持しません。
- 40°Cの時の熱負と正のプローブ10分間、室温でクールダウン。
- RTで（CISH試薬キットに含まれる）増幅試薬AMP 1-6を平衡化します。
- 蒸留水に（CISH試薬キットに含まれる）50×ストック溶液を希釈1×洗浄バッファーを準備します。注：1×洗浄緩衝液は、1ヶ月間室温で保存することができ、将来の染色のために使用されます。
- パラフィルムで覆い、室温で10分間インキュベート、各脳スライスに前処理1の〜4滴（〜120μl）を追加します。
- 新鮮な蒸留水で3〜5回洗浄します。
- 熱によるマスク解除を実行します。
- （CISH試薬キットに含まれています）ホット前処理2に転送するスライド溶液に15分間、沸騰。注意：沸騰を確実にホットプレート上で行うことができます連続沸騰または1.2.3で指定された重要なステップを以下の電子レンジで）。
- すぐに蒸留水にスライドを転送し、3〜5回洗浄します。
- 洗浄は、新鮮な100％エタノールで3~5回スライドします。
- 室温で空気乾燥スライス5分。注意：またはスライスは、O / N乾燥させることができます。
- プロテアーゼ誘発性脱マスキングを実行します。
- （CISH試薬キットに含まれる）前処理3の4滴を追加し、パラフィルムでカバーし、ハイブリダイゼーションオーブンで40 O℃で30分間インキュベートします。
- 洗浄は、新鮮な蒸留水で3〜5回をスライド。
- バックグラウンド染色を評価するために使用されるものの脳切片に設定のdapBプローブの4滴加えます。
- 関心のあるRNAを検出するために使用されるもの脳切片に設定ターゲッティングプローブの4滴加えます。
注：残基15ターゲッティングプローブセット-ヒトATF4のmRNAの1256は、この例で使用されます。オプション：追加の脳スライスはHYBすることができますヒトPPIBを標的プローブセットでridized 正の対照として使用しました。 - スライドボックス内にスライドを置き、2時間インキュベートします。ハイブリダイゼーションオーブンで40 O C で 。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- 各脳切片にAMP 1試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで30分間、40 O C でインキュベートします。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- 各脳切片にAMP 2試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで15分間、40 O C でインキュベートします。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- 各脳切片にAMP 3試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで30分間、40 O C でインキュベートします。
- 洗浄は、1×で二回したスライドします室温で2分間の時間バッファ。
- 各脳切片にAMP 4試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドをカバーし、スライドボックスでそれらを配置し、ハイブリダイゼーションオーブンで15分間、40 O C でインキュベートします。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- 各脳切片にAMP 5試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドを覆い、室温で30分間インキュベートします。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- 各脳切片にAMP 6試薬の4滴を追加し、パラフィルムでスライドを覆い、室温で15分間インキュベートします。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドします。
- （CISH試薬キットに含まれる）BROWN-1とBROWN-2試薬を等量混ぜ、各脳スライスに溶液の〜120μlを添加、パラフィルムで覆い、室温で10分間インキュベートします。
- 洗浄は、室温で2分間の1×洗浄緩衝液で2回スライドし、蒸留水で一回洗浄します。
注：重要なステップ：次の手順は、に重要ですRNA顆粒の存在を隠蔽することなく、最適な軸索対比を得ます。 - 明視野顕微鏡下で、目的のmRNAの存在を確認対比実行する前に。対比手順を通して涙点の存在を監視するには、脳試料中の参照領域を定義します。
- 60 O℃で予熱ルクソールファーストブルー溶液
- 場所スライドルクソールファーストブルーで、60 O℃で30分間インキュベート
- 蒸留水で数回洗浄します。
- ディップは、分化を開始するために、0.05％炭酸リチウム溶液に数回スライドさせます。
- ディップは、新鮮な75％エタノールで二回スライドします。
- 蒸留水ですすいでください。
- 明視野顕微鏡下で脳スライスを確認してください。グレーと白質はダークブルー/ブラック涙点として、まだ目に見える区別可能とRNA顆粒であることを開始すべきであることに注意してください。軸索は水色繊維として現れる始めることを確認します。
- 繰り返しは2.2.32に2.2.28を繰り返します。 Perfor慎重に対比し、RNA顆粒の存在を監視し、20分の段階、 - 10ルクソールファーストブルー溶液とMのインキュベーション。注意：一般的に、最適な対比が60で取得した-それは、RNA顆粒をルクソールファーストブルー染色（例については、 図2を参照）によってマスクされる可能性があることが疑われる場合に90分（総インキュベーション時間）が、時間を短縮することができます。
- RTで10分間クレシルバイオレット溶液でスライドをインキュベートします。
- 蒸留水でスライドを洗浄します。
- ディップを70％エタノール中で5〜10倍のスライド。
- 100％エタノールの3迅速な変化によって脳切片を脱水。
- ヒュームフードでは、2分間、室温で5分間、三度目のキシレン代替クリアリング剤で二回インキュベートすることにより明確な脳スライス。
- キシレン系永久封入剤でマウント脳切片。
- 明視野顕微鏡下でサンプルを分析します。
- 開始する前に、必要な材料を準備します。
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Representative Results
上記の手順の概要は図1に示されています。
ATF4 mRNAの最適な検出は、熱誘導アンマスキングを使用して、コリン作動性軸索に顆粒
mRNAの軸索の局在を評価する際には、軸索を識別することができるように、低豊富なRNAを可視化できることが重要です。ここで説明するRNA ISH技術は、単一分子分解能でのRNAの検出を可能にします。プロテアーゼ誘発性及び熱誘導アンマスキング28：この技術を使用して標準的なプロトコルは、効率的に標的RNAを検出するための2つのアンマスキングの手順の組み合わせを提案します。 ISHは、軸索を識別するために、免疫組織化学と組み合わせた場合しかし、プロテアーゼ誘発性脱マスクは、最適な抗原検出29をもたらさない可能性があります。
使用した抗体は、Cを認識することができなかったので、ここで説明した第一のプロトコルでは、プロテアーゼ消化は、回避されました正のmRNA顆粒が検出されたが、コリン（holine）アセチルトランスフェラーゼ（チャット）は、典型的には、中隔海馬経路（ 図2AおよびB）から発生する歯状回の軸索で見つかりました。 10mMのクエン酸塩緩衝液（pH 6）と熱による検索が、一方、抗のChAT抗体によって認識されるエピトープの完全性を確保し、効率的に標的mRNAのChAT染色軸索（ 図2C及びD）で検出されました。 （ 図2）ここに示された結果は、mRNAの募集とローカル翻訳は海馬にAβ1-42オリゴマーの注入によって誘発された成体マウスの歯状回におけるATF4の存在を示します。前の証拠は、ATF4 mRNAが基底条件18の下、インビトロまたはインビボで軸索で検出されず、したがって、そのような実験的パラダイムが示されていないことを示唆しています。
ATF4の最適な検出熱誘導およびプロテアーゼ誘発性脱マスクの両方を使用して、軸索におけるmRNA顆粒
プロテアーゼ前処理が必要な場合には有用ではないかもしれない暴露する誘導された熱を実行する際に、抗体ベースのタンパク質検出がRNA ISH技術と互換性があることを示し、上記の結果、一方。第2節では、典型的には、脳試料31,32に使用される組織学的染色と組み合わせて、以前公開された手順28,30を次の軸索内ATF4 mRNAの検出を説明しています。
この手順の重要なステップは、CISHにより染色された軸索におけるmRNA顆粒の存在をマスキングせずにルクソールファーストブルー（LFB）を使用して有髄線維の最適な対比です。この目的のために使用される試薬は、60〜90分のインキュベーション時間以下LFBとの最適な対比を可能にします。対比染色は、両方の温度およびインキュベーション時間が減少する失敗する可能性がある（ 図3Aおよびインセット、およびデータを示さず）AmRNAの顆粒がまだ表示されますが、ND、その軸索の局在を検証することはできません。一方、定期的に正の顆粒の存在を監視することなく60°Cの 60分以上のための脳サンプルをインキュベートすると、色素（ 図3Bおよび挿入図）によって、目的のmRNAの不可逆的なマスキングになる可能性があります。従って、サンプルを30分間LFB中でインキュベートされ、そのさらなるインキュベーションは、軸索およびRNA顆粒（ 図3D-F）の両方の最適な染色を得るために、サンプルごとに10〜20分をチェックする段階的に行われることをお勧めします。 ATF4正顆粒が明確に検出することができ、これらのガイドライン次の両方の制御（ 図3D）およびアルツハイマー病（ 図3F）は、脳試料中。
図1.要約ワークフローRNA ISHの軸索対比が続く。ステップは黒で描か例示の2つの手順で共通です。青で強調表示の手順は、赤で強調表示されるものは、発色ISHにより染色ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルに特異的であるのに対し、蛍光ISHによって染色パラホルムアルデヒド固定サンプルに固有のものです。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ATF4 mRNAについて図2.魚は成体マウスの歯状回にコリン作動性軸索に局在する。魚はコリンアセチルトランスフェラーゼの抗体検出（チャット）が続くプロテアーゼによって誘発される（L EFTパネル）または熱誘導（右のパネル）脱マスクを用いて実施しました。 antibODYは、プロテアーゼ処理を行ったときにチャットを認識することができませんでした。非標的プローブ（ のdapB）と、顕微鏡の設定と画像調整同じものを使用してATF4 -targetingプローブを用いて得られた結果の例が示されている。不明な軸索 の局在化とATF4陽性顆粒は疑問符で示されているローカライズされた顆粒は」とマークされている間OK "。スケールバーは20μm。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ATF4 mRNAについて図3. CISHは、ヒト海馬で有髄軸索に局在する。ISHの後、軸索は、ルクソールファーストブルー（LFB）で対比して、神経細胞の細胞体は、クレシルバイオレットで対比染色しました。温度の両方（A及び挿入図は、4時間40°CのでLFBで染色したサンプルを表す。）場合は、次善のLFB染色が生じる可能性があり、インキュベーション時間（図示せず）に減少している、または対比は、短いインキュベーション期間（Bと挿入図の後にチェックされていない場合）。非標的プローブ（ のdapB）またはATF4 -targetingプローブを使用してISHと組み合わせた最適なLFB染色の例としては、（CFおよび挿入図）が示されています。画像取得は、自動的に最良の信号対雑音比のために調整した。局所的な顆粒が「OK」とマークされている間は不明軸索ローカリゼーションとATF4陽性顆粒は疑問符で示されています。スケールバーは50μmには、10ミクロンをインセット。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
このレポートでは、軸索ローカライズATF4 mRNAの検出で高解像度のISH技術の使用を記載しています。これらおよび以前発表された研究は、この技術は、組織中の抗体ベースのタンパク質検出、あるいは胚全体33と互換性があることを示しています。重要なことは、最近34海馬ニューロンの樹状突起内のアークのmRNAの検出のために使用されてきました。また、組織染色のための組織学的染料と組み合わせることができます。最後に、複数の標的のRNA 28,30,33の同時検出に適しています。これらの知見は、高解像度のRNA ISH技術の汎用性を例示し、元のプロトコルに若干の修正は、この方法の感度を低下させません。
単一分子分解能で組織中の目的のmRNAを検出するためのZ構造のプローブの使用を記載するオリジナルのプロトコルは、mRNAを含むアンマスキングのための2つのステップを示唆する30,35沸騰プロテアーゼ消化およびサンプル。ここでは、プロテアーゼによって誘発される負アンマスキングがsepto海馬経路（ 図2AおよびB）から生じるコリン作動性軸索でチャットの成功抗体ベースの検出にどのように影響するかを示しています。そこで、このステップを除外し、軸索の対比は、抗体の使用を含んでいる場合にのみ熱誘導アンマスキングを行うことにしました。 （ 図2C及びD）に示すように、コリン作動性軸索は、抗のChAT抗体で可視化することができ、ATF4 mRNAの顆粒は、検出回避プロテアーゼ消化し ました。 ATF4 mRNAの陽性検出がネガティブプローブから得られたバックグラウンド蛍光に基づいていることに注意してください。余分な制御は、RNアーゼを用いて脳サンプルを処理し、それらの特異性を試験するために、マウスATF4プローブとそれらをプローブすることによって、この時点で含めることができます。このステップは、しかし、ので、ここで説明した手順に含まれていませんこの同じ技術、マウスの海馬18におけるsiRNAの注射後の軸索におけるATF4 mRNAの完全な枯渇を使用して、前の証拠を示し、。このような結果は、ここで使用ISHプローブの特異性を示します。負のプローブよりも他のコントロールの使用は、特定の科学的な質問に基づいて評価されるべきです。最後に、熱による検索がで置換されたまたは軸索対比のために使用される抗体の要件に応じてプロテアーゼによって誘発される非マスクと組み合わせることがあります。一つまたは他の手順またはその両方の組み合わせを使用しての選択は、経験的に、ユーザによって決定されるべきです。
ヒト脳試料中のプロテアーゼおよび熱によるマスク解除を行う場合には、組織学的染料は、抗体ベースの軸索対比を置き換えることができます。ここでは、その後、元のプロトコルが30を対比組織のためにヘマトキシリンの使用を示唆しているが、このような色素は、軸索の染色には適していません。このように、ルクソールFASTブルーミエリン化軸索を染色するために使用し、クレシルバイオレットは、神経細胞体を可視化するために使用されました。未満では2時間で完了することができるためと分化が最適化されている場合Klueverとバレラ31によって開発されたLFBは、水色汚れが暗く表示されたmRNAの顆粒を阻害しない（ 図3C-F）その他の汚れの上に選ばれましたブラウンブラックドット。 90分- （ 図3）に示すように、60 O、60℃でサンプルをインキュベートしたときに、最適なLFBの対比を達成することができます。しかしながら、分化が注意深く監視することができ、mRNAの顆粒が常に表示されるように、インキュベーションを段階的に実行されることをお勧めします。このような本レポートで選択されたDABベースの発色反応と互換性がない場合がありBielchowskyのかBodianの銀染色収率灰黒色軸索染色36のような他の組織学的技術。多分、このような染色技術は、RNA CISHアッセイと組み合わされるべきですそれは、速い赤色または緑色HRP 30などの代替染料の使用を可能にします。 RNA ISHアッセイおよび軸索汚れの適切な組み合わせを選択することは、経験的に、ユーザによって決定されるべきです。
プロテアーゼ消化が実行されている場合は、このレポートで説明した第1の手順の1つの制限は、免疫組織化学による失敗したタンパク質の検出です。この制限は、プロテアーゼによって誘発される脱マスキングを回避することによって克服することができます。熱誘導アンマスキングを行う軸索局在ATF4の特定の場合には、コリン作動性軸索でのバックグラウンドレベル以上のmRNA顆粒を検出するのに十分でした。しかし、これは必要になることがあり関心とプロテアーゼ消化の他のmRNAのためのケースではないかもしれません。その場合、軸索の対比は、ここで記載の抗のChAT抗体以外の抗体を使用して行われるべきです。プロトコルのセクション2で説明したように別の方法として、抗体ベースの対比は、組織学的染料によって置換されることがあります。
30と明視野顕微鏡下で、目的のmRNAを検出するために利用可能な他の染料があります。
プロトコルの項で述べたように、両方の手順の重要なステップの一つは、熱誘導アンマスキングです。沸騰をマイクロ波中で実行される場合、デバイスの特性に応じて、溶液の蒸発の可能性があります。ソリューションの蒸発を避けるために、1.2.3と2.2.4で指定された手順に従ってください。パラフィンのために埋め込まれたのに対し、固定凍結組織のためにアンマスキングの10分は、十分です15分間煮沸組織が推奨されます。サンプルが推奨される時間のために継続的に沸騰しない場合は、この部分的なアンマスキングになる可能性があります。しかし、このような炊飯器やホットプレートなどの他のデバイスではなく、マイクロ波の選択された場合時間は多少異なる場合が可能性があります。沸騰期間は、方法に応じて、ユーザによって決定されるべきです。
もう一つの重要なステップは、LFBの対比です。これは、青色色素の強度は、mRNA顆粒の可視化を妨害しないことが重要です。元のプロトコル31にいくつかの変更は、例えば、温度（ 図3A）またはインキュベーション時間（データは図示せず）を減少させるように、染料の強度を低減するために行われた、しかし、我々は明らかにヒト脳サンプル中の有髄軸索を区別することができませんでした。一方、提案した温度（60 O℃）でLFB溶液中でサンプルをインキュベートすることは有髄軸索の最適な染色を生じました。それしかし対比は慎重に手順2.2.28-2.2.36に指定されLFBが関心のmRNAをマスクしていないことを確認するために、すべての回でのRNA顆粒の存在を監視する段階的に行われることをお勧めです。
最後に、サンプルが完全に乾くことはありません。このレポートに記載された方法は、試薬の蒸発の可能性を増加させる40°Cの 、で複数のインキュベーション工程を伴います。プロトコールに記載されているように、サンプルは、蒸発を避けるために、すべてのステップでパラフィルムでカバーされるべきです。
要約すると、高解像度のRNA ISHおよび他のISH法の開発は、in vivoで成体軸索に局在化するものを含む低豊富な転写産物の可視化を可能にしています。これは、それらが翻訳非アクティブと見なされたとして大幅に見落とされた大人の軸索における長年のmRNAへの局在化および翻訳のため以来、特に重要です。
結論として、私たちは、新規とPRを提示しますATF4の検出および哺乳類の脳の成人軸索に潜在的に多くの他のmRNAのための技術をomising。 RNAscopeは、mRNAの局在化に対する今後の研究を促進し、in vivoでの地元の翻訳の生物学的意義を解明するのに役立ちます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
References
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).
