Abstract
ARNm se localizan con frecuencia a los axones de vertebrados y de su traducción locales se requiere para pathfinding axón o ramificación durante el desarrollo y para el mantenimiento, la reparación o la neurodegeneración en períodos postdevelopmental. Análisis de alto rendimiento han revelado recientemente que los axones tienen un transcriptoma más dinámico y complejo de lo esperado. Estos análisis, sin embargo se han realizado principalmente en neuronas cultivadas, donde los axones pueden ser aislados de los compartimentos somato-dendrítica. Es prácticamente imposible de conseguir tal aislamiento en tejidos enteros en vivo. Por lo tanto, con el fin de verificar el reclutamiento de mRNAs y su relevancia funcional en un animal entero, los análisis del transcriptoma idealmente deben ser combinados con técnicas que permiten la visualización de mRNAs in situ. Recientemente, las tecnologías ISH novedosos que detectan ARN a nivel de una sola molécula se han desarrollado. Esto es especialmente importante cuando se analiza la localización subcelular de mRNA, ARN ya localizados se encuentran típicamente en niveles bajos. Aquí se describen dos protocolos para la detección de mRNAs axón localizadas utilizando un nuevo ultrasensible tecnología de ARN ISH. Hemos combinado RNAscope ISH con contratinción axonal mediante inmunohistoquímica de fluorescencia o colorantes histológicos para verificar el reclutamiento de ATF4 mRNA a los axones in vivo en el ratón madura y los cerebros humanos.
Introduction
Contratación ARNm axonal y la traducción local de los axones permiten responder a estímulos extracelulares de manera temporal y espacialmente aguda 1. La síntesis de proteínas intra-axonal se entiende mejor en el contexto del desarrollo neurológico en el que desempeña un papel crucial en el crecimiento de la conducta cono 2-8, axón pathfinding 9-11 y señalización retrógrada 12,13. Pero mucho menos se sabe acerca de la importancia funcional de la síntesis de proteínas axonal en las neuronas post-desarrollo cuando los niveles de ARNm y ribosomas axonal se reducen considerablemente 14,15. Axones vertebrados maduros durante mucho tiempo han sido considerados como translationally inactivos 16. Sin embargo, estudios recientes indican que la traducción locales se reactiva en los axones maduros en condiciones patológicas. Por ejemplo, un subconjunto de mRNAs es reclutado para regeneración de los axones se requiere lesión del nervio y la síntesis de proteínas intra-axonal para la regeneración correcta de estos axones 17 siguiente. Además, nuestro grupo has demostró que mRNAs específicos son reclutados a los axones después de que se requiere la exposición local a peptídico de la enfermedad de Alzheimer 1-42, y la traducción local de la ATF4 factor de transcripción para propagar los efectos neurodegenerativos de Aß 1-42 de axones a la soma neuronal 18. Finalmente, los análisis de alto rendimiento han revelado que los axones maduros tienen un transcriptoma más complejo y dinámico de lo esperado 18-21, especialmente bajo condiciones patológicas. A la luz de estos estudios, un método altamente sensible y específica para detectar que se necesita ARNm axón localizados en el sistema nervioso adulto.
Gran parte del trabajo en el reclutamiento de ARNm y la traducción local en axones maduros se ha realizado en las neuronas cultivadas. Esto es especialmente cierto para los análisis de transcriptoma ya que existen métodos de cultivo especializados que permiten el aislamiento de los axones de el compartimiento somato-dendrítica 18-20. Aunque estos estudios han dado valiosos complementosvuelo en el papel de la traducción local en axones maduros, la cuestión de si las neuronas cultivadas representan fielmente la situación in vivo o si ARNm reclutamiento es una respuesta adaptativa de los axones a condiciones de cultivo sigue abierta. Pocos estudios han proporcionado pruebas de la contratación ARNm para madurar axones in vivo. Por ejemplo, la que codifica para la proteína marcadora olfativo transcripción se ha detectado en los axones en las neuronas sensoriales adultas 22. Un transgén que contiene el 3 'UTR del mRNA β-actina se transporta a los axones en las neuronas del sistema nervioso periférico y central en los ratones y se traduce localmente después de períodos de desarrollo 23. ARNm Lamin b2 se localiza en los axones de la retina en Xenopues laevis renacuajos y su agotamiento afecta mantenimiento axón después del desarrollo axonal 21. Interferencia con el transporte axonal de la codificación de ARNm para citocromo C oxidasa IV altera el comportamiento del ratón 24. Por último, ATF4 ARNm se encuentra en un adultoXON de ratones y cerebros humanos en el contexto de Aß 1-42 inducida por la neurodegeneración 18.
Análisis del transcriptoma alto rendimiento han demostrado ser útiles para identificar perfiles de mRNA en los axones aislados in vitro, pero tienen limitaciones para los estudios in vivo, ya que en los tejidos enteros axones no se encuentran en forma aislada, sino entremezclados con cuerpos celulares neuronales, células gliales y otros tipos de células. Por lo tanto, este tipo de análisis tienen que ser combinado con técnicas de imagen que confirman la localización subcelular de mRNAs. ARN hibridación in situ (ISH ARN) permite la detección y visualización de las secuencias de ARN específicos en células y tejidos. Sin embargo, los ensayos originales ARN ISH eran adecuadas sólo para la identificación de los muy abundantes ARN 25, que rara vez es el caso de los ARNm axón localizadas. Desde hace décadas el aumento de los esfuerzos se han puesto en el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan la detección de ARNm en el nivel de una sola molécula
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Protocol
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC de la Universidad de Columbia y las directrices aplicables para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos. Nota: Preparar todos los tampones utilizados para los procedimientos de ISH en RNasa libre de agua o tratada con DEPC. Esta recomendación no es estrictamente necesario después de ISH se ha completado, pero se sugiere que los tampones todavía se preparan en agua doblemente destilada esterilizada en autoclave y / o esterilizados por filtración.
1. Detección de ATF4 mRNA localizada a colinérgica axones en el ratón adulto cerebro usando Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) Seguido por inmunohistoquímica
- Preparación de muestras para las secciones de cerebro congeladas paraformaldehído-fijo
- Para el siguiente ejemplo, preparar rodajas de cerebro de ratones congelados fijos.
- En pocas palabras, sacrificar los ratones 9 meses de edad, por la anestesia con ketamina (100 mg kg -1 de peso corporal) y xilazina (10 mg kg -1 weig cuerpoht) seguido de una infusión transcardial de 4% de paraformaldehído en PBS (pH 7,4).
- Retire cerebros y post-fix en paraformaldehído al 4% durante 24 horas a 4 ° C
- Después de la fijación, lavar las muestras tres veces en PBS y cryoprotect en 30% de sacarosa en PBS (pH 7,4) durante 24 horas a 4 o C.
- Cerebros Insertar en octubre congelación compuesto, en serie sección a 20 micras en un criostato y montar en poli-D-lisina tratados portaobjetos de microscopio. Mantenga rodajas de cerebro a -20 ° C hasta su uso.
- Eliminar rodajas de cerebro paraformaldehído fijo de congelador y aire seco durante 30 min a TA.
- Lavar tres veces con PBS 1x.
- En una campana de extracción, re-fix cerebro rebanadas 20 min con paraformaldehído al 4% a TA.
NOTA: PRECAUCIÓN: 4% de paraformaldehído es tóxico y debe manejarse y desecharse adecuadamente siguiendo los protocolos de seguridad. - Lavar tres veces con PBS 1x.
- Deshidratar rodajas de cerebro.
- Preparar 50%, 75% y 100%soluciones de etanol.
- Sumergir los portaobjetos en etanol al 50% durante 5 min a RT.
- Sumergir los portaobjetos en etanol al 75% durante 5 min a RT.
- Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 min a RT.
- Sumergir los portaobjetos en etanol fresco 100% durante 5 min a RT. Nota: Como alternativa, las diapositivas se pueden almacenar en etanol al 100% a -20 ° C hasta 1 mes.
- Para el siguiente ejemplo, preparar rodajas de cerebro de ratones congelados fijos.
- Prueba FISH seguido por inmunohistoquímica utilizando antígeno / ARN desenmascaramiento inducida por calor
- Antes de comenzar la preparación de todo el material necesario:
- Calentar el horno de hibridación a 40 ° C y colocar una bandeja que contiene agua destilada en el horno para crear un ambiente humidificado.
- Tome una caja portaobjetos y colocar toallas de papel empapado en agua destilada dentro para humidificar el cuadro diapositiva. Coloque la caja portaobjetos en el horno de hibridación.
- Eliminar sondas (ambas sondas negativos y objetivo) de la nevera y calentar en el horno de hibridación para 10 min. Deja que se enfríen las sondas down a RT.
- Equilibrar reactivos de amplificación AMP 1.4 (incluido en el Kit Fluorescente Multiplex Reactivo) a TA.
- Preparar la solución de recuperación de antígeno: 10 mM de citrato sódico (pH 6), 0,05% de Tween 20. Nota: La solución puede ser almacenada a temperatura ambiente indefinidamente y se utiliza para la tinción futuro.
- Preparar el tampón de lavado 1x diluyendo la solución 50x social (incluido en el Kit Fluorescente Multiplex reactivo) en agua libre de RNasa o tratada con DEPC.
NOTA: 1x tampón de lavado se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes y se utiliza para la tinción futuro. Tampón de lavado 50x podría precipitar. Si es así, el calor 50x tampón de lavado a 40 ° C durante 10 minutos antes de preparar la solución 1x.
- Retirar los portaobjetos de etanol 100% y aire seco durante 5 min a RT.
- Prepara una jarra Coplin que contiene 50 ml de solución de recuperación de antígeno. Sumergir los portaobjetos en solución de recuperación de antígenos y hervir durante 10 minutos en un horno de microondas.
NOTA: También se desliza horizontalmente en lugar de 100 mmplato de cristal redondo de diámetro que contiene 100 ml de solución de recuperación.- Llenar un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada y colóquelo en el microondas.
NOTA: El agua se "amortiguar" el calor al realizar desenmascaramiento. - Colocar los portaobjetos en solución de recuperación de antígenos dentro del microondas. Hervir desliza a alta potencia durante 5 minutos. Inmediatamente después de las muestras han dejado de ebullición, el calor se desliza de nuevo a alta potencia de descuento del 5 min.
- Enfriar diapositivas a RT.
NOTA: CRÍTICA PASO: hervir la duración y el procedimiento deben ser determinados por el usuario, dependiendo de las características de microondas. La más rápida es la ebullición comienza mayores serán las posibilidades de solución de evaporación. En este caso, se recomienda que las muestras se hirvieron durante períodos de tiempo más cortos más de dos veces para completar un tiempo total de desenmascaramiento 10 min. Por el contrario, si calentamiento se realiza a una potencia media o baja, desenmascaramiento puede realizarse una vez por 10 min. Sin embargo, si las muestras no hervir continuously para un total de aproximadamente 10 min, esto podría resultar en desenmascaramiento parcial de tanto el ARN diana y la proteína a detectar.
- Llenar un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada y colóquelo en el microondas.
- Lavar los portaobjetos tres veces con PBS 1x.
- Añadir 2 - 3 gotas (~ 100 l) de la sonda dapB ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para evaluar la tinción de fondo. Nota: La sonda conjunto dapB dirige a un gen bacteriano y no debe reconocer ninguna ARN de mamífero.
- Añadir 2 - 3 gotas de la sonda de focalización ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para detectar el ARN de interés. Nota: un conjunto de sonda focalización residuos 20 - 1381 del ratón ATF4 mRNA se utiliza en este ejemplo.
- Diapositivas Cubra con parafina para evitar la evaporación de la sonda, los colocan en el cuadro de diapositivas humidificado en el interior del horno de hibridación y los incuban a 40 ° C durante 2 horas.
NOTA: OPCIONAL: rodajas de cerebro adicionales pueden hibridar con una sonda conjunto dirigido ratón POLR2A y utilizaron como controles positivos. - Lavar slides dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 1-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 2-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 3-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 4-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colóquelos en lacaja de portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT y dos veces con PBS 1x.
- Añadir 100 a 200 l (o un volumen suficiente para cubrir completamente rebanadas) de una solución de bloqueo que contenía 3 mg / ml de BSA, glicina 100 mM y 0,25% de Triton X-100 en PBS (pH 7,4) a los portaobjetos, cubrir con parafilm y se incubar durante 30 min a TA.
- Añadir 100 a 200 l de anticuerpo anti-ChAT diluido en solución de bloqueo (1/100) a las diapositivas, cubrirlos con parafilm y se incuba durante 2 días a 4 ° C. Asegúrese de que las secciones de cerebro no se sequen. Si es necesario, vuelva a aplicar la solución de anticuerpo anti-chat para cortes de cerebro 24 horas después de la incubación.
- Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min a TA.
- Añadir 100 a 200 l de anticuerpo secundario conjugado con Alexa adecuado (. Por ejemplo, Alexa-594 burro anti-cabra para este ejemplo en particular) a las diapositivas, cubrir con parafilm y incubcomió durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min a TA.
- Lavar los portaobjetos una vez con agua destilada.
- Monte desliza con medio de montaje que contiene DAPI.
- Visualizar rodajas de cerebro bajo un microscopio de fluorescencia.
- Antes de comenzar la preparación de todo el material necesario:
2. Detección de ATF4 mRNA localizada a axones en muestras de cerebro humano utilizando cromogénico hibridación in situ (CISH) Seguido por Luxol Fast azul y violeta de cresilo Counterstaining
- Preparación de muestras para muestras de cerebro humano incluidas en parafina fijado en formol
- Rebanadas Hornear en un horno seco a 60 ° C durante 1 hora.
- Desparafinar rodajas de cerebro en una campana de humos.
NOTA: PRECAUCIÓN: Los reactivos son tóxicos y deben manejarse y se desecha siguiendo las pautas de seguridad apropiadas- Sumergir los portaobjetos en cámara de compensación alternativa xileno dos veces durante 10 minutos.
- Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% dos veces durante 1 min.
- LArodajas de IR-seca 5 min a TA. Nota: Como alternativa, las muestras pueden ser secadas a RT O / N, pero deben utilizarse dentro de las 24 hrs.
- Diaminobencidina (DAB) a base de ensayo de ISH cromogénico seguido por luxol rápido azul y violeta de cresilo mancha utilizando ARN desenmascaramiento inducida proteasa inducida por el calor y
- Antes de comenzar la preparación de materiales necesarios:
- Calentar el horno de hibridación a 40 ° C y colocar una bandeja que contiene agua destilada para crear un ambiente humidificado.
- Tome una caja portaobjetos y colocar toallas de papel empapado en agua destilada dentro para humidificar el cuadro diapositiva. Coloque la caja portaobjetos en el horno de hibridación.
- Prepare 1x Pretrate 2 diluyendo la solución 10x (incluido en el Kit de CISH reactivo) en agua libre de RNasa o tratada con DEPC. Si el pretratamiento se lleva a cabo en una placa caliente, añadir 100 ml de solución de pretratamiento a un plato de vidrio de diámetro 100 mm para aumentar la superficie de contacto entre el plato y la placa caliente (si pretratamientose realiza en un horno de microondas, un tarro Coplin puede utilizarse en lugar como se especifica en 1.2.3). Solución de calor a 100 ° C y mantenerla no más de 30 minutos hirviendo antes de sumergir las muestras.
- Calor sondas negativos y positivos 10 min a 40 ° C y enfriar a temperatura ambiente.
- Equilibrar reactivos de amplificación AMP 1.6 (incluido en el Kit de CISH Reactivo) a TA.
- Preparar el tampón de lavado 1x diluyendo la solución 50x social (incluido en el kit de reactivos CISH) en agua destilada. Nota: 1x tampón de lavado se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes y se utiliza para la tinción futuro.
- Añadir ~ 4 gotas (~ 120 mu l) de Pretrate 1 a cada rebanada de cerebro, cubrir con parafilm y se incuba a TA durante 10 min.
- Lavar 3 a 5 veces en agua destilada fresca.
- Realizar desenmascaramiento inducida por calor:
- Diapositivas de traslado hasta el caliente Trate previamente 2 (incluido en el kit de reactivos CISH) de solución y hervir durante 15 minutos. Nota: de ebullición se puede realizar en un plato caliente garantizandoebullición continua o en el microondas siguiendo los pasos críticos especificados en 1.2.3).
- Transferir inmediatamente diapositivas a agua destilada y lavar 3 a 5 veces.
- Lavar los portaobjetos 3 a 5 veces en etanol al 100% fresco.
- Rodajas de aire seco 5 min a temperatura ambiente. Nota: O Alternativamente rebanadas se pueden secar / N.
- Realizar desenmascaramiento inducida proteasa-:
- Añadir 4 gotas de Pretrate 3 (incluido en el kit de reactivos CISH), cubrir con parafilm y se incuba 30 minutos a 40 ° C en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos de 3 a 5 veces en agua destilada fresca.
- Añadir 4 gotas de la sonda dapB ajustado a esas rodajas de cerebro utilizadas para evaluar la tinción de fondo.
- Añadir 4 gotas de la sonda de focalización ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para detectar el ARN de interés.
NOTA: Una sonda conjunto dirigido residuos 15 - 1256 del ARNm ATF4 humano se utiliza en este ejemplo. OPCIONAL: rodajas de cerebro adicionales pueden ser hybridized con una sonda conjunto dirigido PPIB humana y se utiliza como controles positivos. - Coloque las diapositivas en el cuadro de diapositivas y se incuba durante 2 horas. a 40 ° C en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Añadir 4 gotas de AMP 1 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Añadir 4 gotas de AMP 2 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Añadir 4 gotas de AMP 3 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos dos veces con 1x erah tampón durante 2 minutos a RT.
- Añadir 4 gotas de AMP 4 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Añadir 4 gotas de AMP 5 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Añadir 4 gotas de AMP 6 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm y se incuba 15 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
- Mezclar un volumen igual de BROWN-1 y BROWN-2 reactivos (incluido en el Kit Reactivo de CISH), añadir ~ 120 l de solución a cada rebanada de cerebro, cubrir con parafilm y se incuba 10 min a TA.
- Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT y enjuagar una vez en agua destilada.
NOTA: Los pasos críticos: los siguientes pasos son fundamentales paraobtener una contratinción axonal óptima sin enmascarar la presencia de gránulos de ARN. - Antes de realizar contratinción comprobar la presencia de ARNm de interés bajo un microscopio de campo claro. Definir las áreas de referencia en las muestras de cerebro en el que monitorean la presencia de puntos lagrimales durante todo el procedimiento de contraste.
- Luxol Precaliente solución de azul rápido a 60 ° C.
- Coloque los portaobjetos en luxol azul rápido e incubar 30 minutos a 60 ° C
- Enjuague varias veces en agua destilada.
- Dip desliza varias veces en solución de carbonato de litio 0,05% para iniciar la diferenciación.
- Dip desliza dos veces en etanol fresco 75%.
- Enjuague con agua destilada.
- Compruebe rodajas de cerebro con un microscopio de campo claro. Tenga en cuenta que la materia gris y blanca debería empezar a ser gránulos distinguibles y ARN todavía visibles como / puntos lagrimales negro azul oscuro. Verifique que los axones comienzan a aparecer como fibras de color azul claro.
- Repita los pasos del 02/02/28 a 02/02/32. Perform incubaciones con solución de azul luxol rápido en 10 a 20 pasos min, controlando cuidadosamente la contratinción y la presencia de gránulos de ARN. Nota: Por lo general, de contraste óptimo se adquiere en 60 a 90 minutos (tiempo total de incubación), pero el tiempo se puede acortar si se sospecha que los gránulos de ARN pueden ser enmascarados por la luxol mancha azul rápido (ver Figura 2 para ver ejemplos).
- Incubar los portaobjetos en una solución de violeta de cresilo durante 10 min a RT.
- Enjuague los portaobjetos en agua destilada.
- Dip desliza 5 a 10 veces en etanol al 70%.
- Deshidratar rodajas de cerebro a través de 3 cambios rápidos de etanol al 100%.
- En una campana de humos, rodajas de cerebro claras por incubando dos veces en cámara de compensación alternativa xileno durante 2 minutos y una tercera vez durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Rebanadas Monte cerebrales en medio de montaje permanente a base de xileno.
- Analizar las muestras en un microscopio de campo claro.
- Antes de comenzar la preparación de materiales necesarios:
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Representative Results
Un breve resumen de los procedimientos descritos anteriormente se muestra en la Figura 1.
Detección óptima de ATF4 ARNm gránulos en los axones colinérgicos usando desenmascaramiento inducida por calor
Al evaluar la localización axonal de los ARNm, es fundamental para poder identificar a los axones y ser capaz de visualizar los ARN abundantes bajas. La tecnología de ARN ISH descrito aquí permite la detección de ARN a una resolución de una sola molécula. Los protocolos estándar utilizando esta tecnología sugieren la combinación de dos procedimientos de desenmascaramiento para detectar de manera eficiente ARN diana: y el calor inducido por desenmascaramiento 28 indujo proteasa. Sin embargo, cuando ISH se combina con técnicas de inmunohistoquímica para identificar los axones, desenmascaramiento inducida proteasa podría no resultar en la detección de antígeno óptima 29.
En el primer protocolo descrito aquí, se evitó la digestión de la proteasa, ya que el anticuerpo utilizado no reconoció cacetiltransferasa holine (chatear) se encuentran típicamente en los axones de la circunvolución dentada que surgen de la vía septohippocampal (Figura 2 A y B), aunque se detectaron gránulos de ARNm positivos. Recuperación con 10 mM tampón de citrato (pH 6) inducida por calor, por otra parte, garantiza la integridad del epítopo reconocido por el anticuerpo anti-ChAT y ARNm diana se detectó de manera eficiente en los axones ChAT-manchado (Figura 2C y D). Los resultados presentados aquí (Figura 2) muestran la presencia de ATF4 en el giro dentado de ratones adultos donde ARNm reclutamiento y de traducción local fueron inducidas por infusión de Aß 1-42 oligómeros en el hipocampo. La evidencia previa sugiere que ATF4 ARNm no se detecta en los axones in vitro o in vivo en condiciones basales 18, y por lo tanto no se muestra un paradigma tal experimental.
Detección óptima de ATF4gránulos de mRNA en los axones utilizando tanto desenmascaramiento inducida por el calor y la inducida por la proteasa-
Considerando que los resultados descritos anteriormente muestran que el anticuerpo basado detección de proteínas es compatible con la tecnología de ARN ISH al realizar inducida desenmascarando podría no ser útil si se requiere proteasa pre-tratamiento térmico. La sección 2 describe la detección de mRNA ATF4 dentro axones siguiendo procedimientos publicados previamente 28,30 combinados con tinciones histológicas usados típicamente para las muestras cerebrales 31,32.
Un paso crítico en este procedimiento es la de contraste óptimo de fibras mielinizadas utilizando luxol azul rápido (LFB) sin enmascarar la presencia de gránulos de ARNm en los axones manchados por CISH. Los reactivos utilizados para este propósito permiten contratinción óptima con LFB siguiente tiempos de incubación de 60 a 90 min. Contratinción puede fallar cuando se disminuyen las dos veces y temperatura de incubación (Figura 3A y inserción, y los datos no se muestra) unand aunque gránulos de ARNm seguirán siendo visibles, su localización axonal no puede ser verificada. Por otra parte, la incubación de muestras de cerebro de 60 minutos o más a 60 ° C sin la vigilancia de la presencia de gránulos positivos periódicamente podría resultar en enmascaramiento irreversible del ARNm de interés por el colorante (Figura 3B y recuadro). Por tanto, se recomienda que las muestras se incuban en LFB durante 30 min y que más de incubación es realizada en etapas de comprobar las muestras cada 10 a 20 min para obtener una tinción óptima tanto de los axones y los gránulos de ARN (Figura 3D-F). Siguiendo estas directrices gránulos ATF4 positivos pueden ser claramente detectadas tanto en el control (Figura 3D) y la enfermedad (Figura 3F) muestras de cerebro de Alzheimer.
Flujo de trabajo de la Figura 1. Resumidode ARN ISH seguido por contratinción axonal. etapas representadas en negro son comunes a los dos procedimientos ejemplificados. Pasos resaltados en azul son específicos de muestras de paraformaldehído-fijo manchados por ISH fluorescente mientras que los que se destacan en rojo son específicos de las muestras incluidas en parafina fijado en formol manchados por ISH cromogénico. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. FISH para ATF4 mRNA localizada a los axones colinérgicos en el giro dentado de ratones adultos. FISH se realizó utilizando inducida proteasa (l panel de EFT) o desenmascaramiento inducida por calor (panel derecho) seguido por la detección de anticuerpos de la colina acetiltransferasa (ChAT) . El antibody no reconoció de chat cuando se llevó a cabo el tratamiento de la proteasa. Se muestran ejemplos de los resultados obtenidos con una sonda no focalización (dapB) y la sonda de la ATF4 -targeting utilizando la misma configuración de microscopio y ajustes de imagen. ATF4 gránulos -positivas con localización axonal claro se indican con signos de interrogación mientras gránulos localizados se marcan como " OK ". Barra de escala 20μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. CISH para ATF4 ARNm localiza en los axones mielinizados en la formación del hipocampo humano. Siguiendo ISH, los axones se counterstained con luxol azul rápido (LFB) y somata neuronal se counterstained con violeta de cresilo. Tinción LFB subóptimo podría resultar si tanto la temperatura (A y la inserción representan muestras teñidas con LFB a 40 ° C durante 4 hrs.) Y tiempo de incubación (no se muestra) están disminuido, o cuando contratinción no se comprueba después de períodos de incubación cortos (B y la inserción ). Ejemplos de tinción LFB óptima combinada con ISH utilizando una sonda no focalización (dapB) o la sonda ATF4 -targeting se muestran (CF y recuadros). La adquisición de imágenes se ajusta automáticamente para los mejores de señal a ruido. ATF4 gránulos -positivas con localización axonal claro se indican con signos de interrogación mientras gránulos localizados están marcados como "ok". Barra de escala 50 micras, inserciones 10 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este informe se describe el uso de una tecnología de ISH de alta resolución en la detección de mRNA ATF4 axón localizada. Estos y los anteriores estudios publicados muestran que esta tecnología es compatible con base de anticuerpos de detección de proteínas en los tejidos o incluso embriones enteros 33. Es importante destacar que se ha utilizado recientemente para la detección de Arco mRNA dentro de las dendritas de las neuronas del hipocampo 34. También se puede combinar con tintes histológicos para la tinción de tejidos. Finalmente, es adecuado para la detección simultánea de múltiples blancos ARN 28,30,33. Estos resultados ilustran la versatilidad de alta resolución de las tecnologías de ARN ISH, y pequeñas modificaciones en los protocolos originales no disminuyen la sensibilidad de este método.
Protocolos originales que describen el uso de Z-estructura sondas para detectar ARNm de interés en los tejidos a una resolución de una sola molécula sugieren dos pasos para desenmascarar la participación de mRNAla digestión de la proteasa y de la muestra hirviendo 30,35. Aquí te mostramos cómo desenmascarar negativa inducida proteasa afecta la detección basada en anticuerpos exitosa de chat en los axones colinérgicos que surgen de la vía septo-hipocampal (Figura 2 A y B). Por lo tanto, hemos decidido excluir a este paso y realizar sólo desenmascaramiento inducida por el calor si counterstaining axonal implicó el uso de anticuerpos. Como se muestra (Figura 2 C y D), los axones colinérgicos pueden ser visualizados con un anticuerpo anti-chat y gránulos ATF4 mRNA fueron detectables evita la digestión de la proteasa. Tenga en cuenta que la detección positiva de ATF4 ARNm se basa en la fluorescencia de fondo obtenida de la sonda negativa. Un control adicional puede ser incluido en este punto mediante el tratamiento de muestras de cerebro con RNasas y sondaje con las sondas ratón ATF4 el fin de probar su especificidad. Este paso sin embargo no está incluido en los procedimientos discutidos aquí desdeanterior ir a pruebas, utilizando esta misma tecnología, un agotamiento completo de ATF4 ARNm en los axones después de la inyección de siRNA en el hipocampo del ratón 18. Tales resultados demuestran la especificidad de las sondas ISH utilizados aquí. El uso de controles, con excepción de las sondas negativos debe ser evaluada en base a determinadas cuestiones científicas. Finalmente, la recuperación inducida por calor podría ser sustituido por o combinado con desenmascaramiento inducida proteasa-dependiendo de los requisitos del anticuerpo utilizado para la contratinción axón. La elección de la utilización de uno u otro procedimiento o la combinación de ambos debe determinarse empíricamente por el usuario.
Al realizar proteasa y desenmascaramiento inducida por calor en muestras de cerebro humano, colorantes histológicos pueden sustituir a base de anticuerpos counterstaining axonal. Aunque el protocolo original aquí seguido sugiere el uso de hematoxilina para la contratinción tejido 30, tal colorante no es adecuado para la tinción axón. Por lo tanto, luxol fast azul se utilizó para manchar axones mielinizados y violeta de cresilo se utiliza para visualizar los cuerpos celulares neuronales. LFB, desarrollado por Kluever y Barrera 31, fue elegido sobre otras manchas, ya que puede ser completado en menos de 2 hr y si se optimiza la diferenciación (Figura 3C-F) la mancha de luz azul no interfiera con los gránulos de ARNm que aparecen como oscuro puntos de color marrón-negro. Como se muestra (Figura 3), óptima counterstaining LFB se puede lograr cuando la incubación de las muestras a 60 ° C durante 60 - 90 min. Sin embargo, se recomienda que la incubación se lleva a cabo por etapas de modo que la diferenciación se puede monitorizar cuidadosamente y gránulos de ARNm son siempre visible. Otras técnicas histológicas como el rendimiento tinción de plata axón-negro gris del Bielchowsky o de Bodian manchando 36 que podrían no ser compatibles con la reacción cromogénico basado en DAB elegido en este informe. , Tales técnicas de tinción probables deben combinarse con los ensayos de ARN CISHque permiten el uso de tintes alternativos tales como rojo o verde HRP 30 rápido. La elección de la combinación apropiada de ARN ISH ensayos y manchas axonales debe determinarse empíricamente por el usuario.
Una limitación del primer procedimiento que se describe en este informe es la detección de proteínas sin éxito por inmunohistoquímica si no se realiza la digestión de la proteasa. Esta limitación puede ser superada por evitar desenmascaramiento inducida proteasa. En el caso particular de ATF4 axón localizada rendimiento desenmascaramiento inducida por el calor era suficiente para detectar gránulos de ARNm encima de los niveles de fondo en los axones colinérgicos. Sin embargo, esto podría no ser el caso de otros ARNm de interés y la digestión de la proteasa podrían ser necesarias. Si es así, counterstaining axonal se debe realizar utilizando anticuerpos que no sean el anticuerpo anti-ChAT aquí descrito. Alternativamente, counterstaining basada en anticuerpos podría ser sustituido por tintes histológicos como se describe en la sección 2 del protocolo.
30.
Como se indica en la sección de protocolo, uno de los pasos críticos de ambos procedimientos es el desenmascaramiento inducida por calor. Si hirviendo se realiza en un horno de microondas, hay posibilidades de solución de evaporación en función de las características del dispositivo. Siga los pasos especificados en 1.2.3 y 2.2.4 para evitar la evaporación solución. Para congelada fijo tejido 10 min de desenmascaramiento debería ser suficiente, mientras que para parafinaSe recomienda tejidos hirviendo durante 15 min. Si las muestras no se reducen de forma continua durante el tiempo recomendado que esto podría resultar en desenmascaramiento parcial. Sin embargo los tiempos pueden variar ligeramente si otros dispositivos tales como una olla de arroz o una placa caliente se eligen en lugar de un microondas. Duración de ebullición debe ser determinado por el usuario, dependiendo del método.
Otro paso importante es la counterstaining LFB. Es importante que la intensidad del colorante azul no interfiere con la visualización de los gránulos de ARNm. Algunas modificaciones en el protocolo original 31 se realizaron con el fin de reducir la intensidad del colorante, tales como la disminución de la temperatura (Figura 3A) o el tiempo de incubación (datos no mostrados), sin embargo no hemos podido distinguir claramente axones mielinizados en muestras de cerebro humano . Por otra parte, la incubación de las muestras en solución LFB a la temperatura sugerido (60 o C) dio como resultado la tinción óptima de axones mielinizados. EsoSin embargo, es recomendable que la contratinción se realiza por etapas, controlando cuidadosamente la presencia de gránulos de ARN en todo momento para asegurar que LFB no enmascara el ARNm de interés como se especifica en los pasos 2.2.28-2.2.36.
Finalmente, las muestras no deben secarse. Los métodos descritos en este informe implican múltiples etapas de incubación a 40 ° C, lo que aumenta las posibilidades de la evaporación del reactivo. Como se indica en los protocolos, las muestras deben ser cubiertos con parafilm en todas las medidas para evitar la evaporación.
En resumen, el desarrollo de alta resolución ARN ISH y otros métodos ISH están permitiendo la visualización de las transcripciones poco abundantes, incluyendo aquellos localizados en los axones adultos en vivo. Esto es especialmente importante, ya que durante muchos años la localización del mRNA que ya traducción en los axones adultos fue pasado por alto en gran medida, ya que se consideraron en traslación inactivo.
En conclusión presentamos una novela y promising tecnología para la detección de ATF4 y potencialmente muchos otros mRNAs en los axones adultos de la cerebro de los mamíferos. RNAscope facilitará futuros estudios sobre la localización del mRNA y ayudará a desentrañar el significado biológico de la traducción local en vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
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