Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Påvisning av Axonally Lokalisert mRNAs i hjernedelene med høy oppløsning Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52799
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

Abstract

mRNA er ofte lokalisert til virveldyr axoner og deres lokale oversettelse er nødvendig for axon pathfinding eller forgrening under utvikling og for vedlikehold, reparasjon eller neurodegenerering i postdevelopmental perioder. Høye throughput analyser har nylig avdekket at axons har en mer dynamisk og kompleks transkriptom enn tidligere antatt. Disse analyse, men har stort sett gjort i dyrkede nerveceller der axoner kan isoleres fra somato-dendrittiske avdelinger. Det er praktisk talt umulig å oppnå en slik isolasjon i hele vev in vivo. Således, for å verifisere at rekruttering av mRNA og deres funksjonelle relevans i et helt dyr, transkriptom analyser bør ideelt sett være kombinert med teknikker som tillater visualisering av mRNA in situ. Nylig har nye ISH teknologi som gjenkjenner RNA på en enkelt-molekyl nivå blitt utviklet. Dette er spesielt viktig når analysere den subcellulære lokalisering av mRNASiden lokaliserte RNA finnes vanligvis på lave nivåer. Her beskriver vi to protokoller for påvisning av axonally-lokaliserte mRNA ved hjelp av en ny ultra RNA ISH teknologi. Vi har kombinert RNAscope ISH med axonal counterstain med fluoresens immunhistokjemi eller histologiske fargestoffer for å verifisere rekruttering av Atf4 mRNA til axoner in vivo i moden mus og menneskehjerner.

Introduction

Axonal mRNA rekruttering og lokal oversettelse aktivere axoner å svare på ekstracellulære stimuli i en tid og rom akutt måte en. Intra-axonal proteinsyntesen er best forstås i sammenheng med neurodevelopment der den spiller avgjørende roller i vekst kjegle oppførsel 2-8, axon pathfinding 9-11 og retrograd signale 12,13. Men langt mindre er kjent om den funksjonelle betydningen av aksonal proteinsyntese i post-utviklings nevroner når aksonale mRNA og ribosom nivåer er sterkt redusert 14,15. Modne virveldyr aksoner har lenge vært antatt å være translasjonelt inaktiv 16. Men nyere studier tyder på at lokale oversettelses reaktiveres i modne aksoner etter patologiske tilstander. For eksempel, er en undergruppe av mRNA rekruttert til regenererende axoner etter nerveskade og intra-aksonal proteinsyntese er nødvendig for riktig regenerering av disse 17 aksoner. I tillegg vår gruppe has demonstrert at spesifikke mRNA blir rekruttert til axoner etter lokal eksponering for Alzheimers sykdom peptid Ap 1-42, og lokale oversettelse av transkripsjonsfaktoren ATF4 er nødvendig for å forplante nevrodegenerative effekter av Ap 1-42 fra axoner til nevronale soma 18. Endelig har høy gjennomstrømning analyser viste at modne aksoner har en mer kompleks og dynamisk transcriptome enn forventet 18-21, spesielt under patologiske tilstander. I lys av disse studiene, for en meget følsom og spesifikk metode detektere axonally lokaliserte mRNA i voksent nervesystemet er nødvendig.

Mye av arbeidet på mRNA rekruttering og lokal oversettelse i modne aksoner har blitt utført på dyrkede nerveceller. Dette gjelder særlig for transcriptome analyser siden spesialiserte dyrkningsmetoder finnes som tillater isolering av axoner fra somato-dendrittiske rommet 18-20. Selv om slike studier har gitt verdifulle insight inn i rollen som lokal oversettelse i modne aksoner, spørsmålet om dyrkede nerveceller representerer trofast situasjonen in vivo eller hvis mRNA rekruttering er en adaptiv respons av aksoner til dyrking forholdene er fortsatt åpen. Få studier har gitt holdepunkter for mRNA rekruttering til modne axoner in vivo. For eksempel har den transkripsjon koding for lukte markør protein er påvist i axoner i voksen sensoriske nevroner 22. En transgen inneholder 3 'UTR av β-aktin mRNA transporteres til axoner i perifere og sentrale nervesystemet nerveceller i mus og er lokalt oversatt etter utviklings perioder 23. Lamin b2 mRNA er lokalisert til retinal axoner i Xenopues laevis rumpetroll og dens uttømming påvirker axon vedlikehold etter aksonal utvikling 21. Interferens med aksonal transport av mRNA som koder for cytokrom C oksidase IV endrer muse atferd 24. Til slutt blir Atf4 mRNA finnes i en voksenXON av mus og menneskehjerner i sammenheng med Ap 1-42 -indusert neurodegenerering 18.

Høy gjennomstrømning transkriptom analyser har vist seg å være nyttig for å identifisere mRNA profiler i isolerte aksoner in vitro, men har begrensninger for in vivo-studier siden i hele vev aksoner finnes aldri i isolasjon, men blandet med neuronal cellelegemer, gliale celler og andre celletyper. Således kan slike analyser har til å bli kombinert med bildeteknikker som bekrefter den subcellulære lokalisering av mRNA. RNA in situ hybridisering (RNA ISH) tillater påvisning og visualisering av spesifikke RNA-sekvenser i celler og vev. Men opprinnelige RNA ISH analyser var kun egnet for identifisering av svært rike RNA 25, noe som er sjelden tilfelle for axonally lokaliserte mRNA. For de siste tiårene økende innsats har blitt satt i å utvikle nye teknologier som tillater påvisning av mRNA på enkelt-molekyl nivå 27). Den største forskjellen mellom de ovennevnte teknikker og den ene her er beskrevet, er at den senere bruker 20 double Z-struktur (ikke lineær) sonder som vanligvis er rettet mot ~ 1 kb region av RNA av interesse å sikre spesifisitet og lav bakgrunnsnivåer. Prober blir deretter hybridisert med forforsterker og forsterkersekvenser som er endelig fluorescensmerkede eller konjugert med enzymer som gjør kromogene reaksjoner. Disse forsterkertrinn forbedre signal-til-støy-forhold i forhold til andre teknologier 28 ISH. Her beskriver vi to protokoller som bruker RNAscope kombineres enten med fluorescens immunocytochemistry eller med histologiske fargestoffer slik aksonal kontra. Begge protokollene er egnet til å visualisere aksonal lokalisering av Atf4 mRNA i voksen mobruke og menneskehjerner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyre prosedyrene ble godkjent av IACUC of Columbia University og gjeldende retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr ble fulgt. Merk: Forbered alle buffere som brukes til de ISH prosedyrer i RNase-fritt eller DEPC-behandlet vann. Denne anbefaling er ikke strengt tatt nødvendig etter ISH er avsluttet, men det er antydet at bufferne er fremdeles fremstilt i Autoclaved dobbeltdestillert vann og / eller steriliseres ved filtrering.

1. Påvisning av Atf4 mRNA lokalisert til kolinerge Axoner i Adult Mouse Brain med fluorescens in situ hybridisering (FISH) Etterfulgt av Immunohistochemistry

  1. Prøveopparbeidelse for paraformaldehydfiksert frosne hjernen skiver
    1. For følgende eksempel forberede skiver fra faste frosne mus hjerner.
      1. Kort, ofre ni måneder gamle mus ved anestesi med ketamin (100 mg kg -1 kroppsvekt) og xylazin (10 mg kg -1 kropps weight), fulgt av transcardial infusjon av 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,4).
      2. Fjern hjerner og post-fix i 4% paraformaldehyde i 24 timer ved 4 o C.
      3. Etter fiksering vaskes prøvene tre ganger i PBS og cryoprotect i 30% sukrose i PBS (pH 7,4) i 24 timer ved 4 o C.
      4. Embed hjerner i oktober frysing sammensatte, serielt delen på 20 mikrometer på en cryostat og montere på poly-D-lysin behandlet objektglass. Hold hjernen skiver ved -20 o C til bruk.
    2. Fjern paraformaldehyd-fikserte hjernesnitt fra fryseren og lufttørke i 30 minutter ved RT.
    3. Vask tre ganger med 1 x PBS.
    4. I en avtrekkshette, skiver re-fix hjernen 20 min med 4% paraformaldehyde ved RT.
      MERK: FORSIKTIG: 4% paraformaldehyde er giftig og må behandles og kastes på riktig måte etter sikkerhetsprotokoller.
    5. Vask tre ganger med 1 x PBS.
    6. Dehydrerer hjerneskiver.
      1. Forbered 50%, 75% og 100%etanol løsninger.
      2. Dyppe objektglass i 50% etanol i 5 min ved RT.
      3. Dyppe objektglass i 75% etanol i 5 min ved RT.
      4. Dyppe objektglass i 100% etanol i 5 min ved RT.
      5. Dyppe objektglass i fersk 100% etanol i 5 min ved RT. Merk: Alternativt kan slides lagres i 100% etanol ved -20 ° C opp til en måned.
  2. FISH analysen fulgt av immunhistokjemi hjelp av varme-indusert antigen / RNA avsløring
    1. Før du begynner å forberede alle nødvendige materialet:
      1. Varm hybridisering ovnen til 40 o C og legg et brett med destillert vann i ovnen for å lage en fuktet miljø.
      2. Ta et lysbilde boks og legg tørkepapir dynket i destillert vann inne å fukte lysbildet boksen. Plasser raset boksen i hybridisering ovnen.
      3. Fjern prober (både negative og target prober) fra kjøleskapet og varme dem i hybridisering ovnen i 10 min. La sondene kjøle down ved RT.
      4. Stabil amplifiseringsreagenser AMP 1-4 (inkludert i Fluorescent Multiplex Reagens Kit) ved RT.
      5. Forbered antigen henting løsning: 10 mM natriumsitrat (pH 6), 0,05% Tween 20. Merk: Løsning kan oppbevares i romtemperatur på ubestemt tid, og brukes for fremtidig misfarging.
      6. Forbered 1x vaskebuffer fortynne 50x stamløsning (inkludert i Fluorescent Multiplex Reagens Kit) i RNase-fritt eller DEPC-behandlet vann.
        MERK: 1x vaskebuffer kan oppbevares i romtemperatur i 1 måned og brukes for fremtidig misfarging. 50x vaskebuffer kan felle. I så fall varme 50x vaskebuffer ved 40 ° C i 10 minutter før fremstilling av den 1x løsningen.
    2. Fjern lysbilder fra 100% etanol og lufttørke i 5 min ved RT.
    3. Forbered en Coplin krukke inneholder 50 ml antigen henting løsning. Fordype lysbilder i antigen henting løsning og kok dem i 10 minutter i en mikrobølgeovn.
      MERK: Alternativt sted glir horisontalt i en 100 mmdiameter rund glassskål inneholdende 100 ml av henting løsning.
      1. Fyll opp en 1 L beger med destillert vann og legg den i mikrobølgeovnen.
        MERK: Vannet vil "buffer" varmen når du utfører avsløring.
      2. Plasser lysbildene i antigen henting løsning i mikrobølgeovn. Koke glir på høy effekt i 5 min. Umiddelbart etter at prøvene har sluttet å koke, glir varmen igjen på høy effekt for ekstra 5 min.
      3. Kjøl ned lysbilder på RT.
        MERK: KRITISK STEP: kokende varighet og fremgangsmåten bør bestemmes av brukeren, avhengig av mikrobølgeegenskaper. Jo raskere koke starter jo større er sjansen for løsning fordampning. I dette tilfelle anbefales det at prøver kokes i kortere tidsperioder mer enn to ganger for å fullføre en total avmaskering tid på 10 min. Tvert imot, hvis oppvarming blir utført ved middels eller lav effekt, avmaskering kan utføres en gang i 10 min. Men hvis prøvene ikke koke continuously for en total på ca 10 min, kan dette resultere i delvis avmaskering av både target RNA og protein som skal påvises.
    4. Vask glir tre ganger med 1x PBS.
    5. Legg 2-3 dråper (~ 100 ul) av den dapB sonden settes til disse hjerneskiver som brukes til å vurdere bakgrunnsfarging. Merk: dapB probe sett rettet mot en bakteriell gen og bør ikke anerkjenne noen pattedyr RNA.
    6. Legg 2-3 dråper av målretting sonden settes til disse hjerneskiver som brukes for å påvise RNA av interesse. Merk: en sonde sett rettet rester 20 - 1381 av musen Atf4 mRNA er brukt i dette eksempel.
    7. Cover lysbilder med Parafilm unngå probe fordampning, plassere dem i fuktet lysbildet boksen inne i hybridisering ovnen og ruge dem ved 40 o C i 2 timer.
      MERK: EKSTRA: flere hjerneskiver kan hybridisert med en probe sett rettet mot mus Polr2A og brukt som positive kontroller.
    8. Vask SLIdes to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    9. Legg 2-3 dråper forsterkning reagent AMP 1-FL til hver hjernen skive, dekk lysbilder med Parafilm, plassere dem i raset boksen og inkuberes ved 40 o C i 30 min i hybridisering ovnen.
    10. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    11. Legg 2-3 dråper forsterkning reagent AMP 2-FL til hver hjernen skive, dekk lysbilder med Parafilm, plassere dem i raset boksen og inkuberes ved 40 o C i 15 min i hybridisering ovnen.
    12. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    13. Legg 2-3 dråper forsterkning reagent AMP 3-FL til hver hjernen skive, dekk lysbilder med Parafilm, plassere dem i raset boksen og inkuberes ved 40 o C i 30 min i hybridisering ovnen.
    14. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    15. Legg 2-3 dråper forsterkning reagent AMP 4-FL til hver hjernen skive, dekke lysbilder med Parafilm, plassere dem iskyv boksen og inkuber ved 40 ° C i 15 minutter i ovnen hybridisering.
    16. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 minutter ved romtemperatur og to ganger med 1 x PBS.
    17. Legg 100-200 ul (eller nok volum til å dekke skiver) i en blokkerende oppløsning inneholdende 3 mg / ml BSA, 100 mM glycin og 0,25% Triton X-100 i PBS (pH 7,4) til lysbildene, dekke dem med parafilm og Inkuber i 30 minutter ved RT.
    18. Legg 100-200 mL av anti-ChAT antistoff fortynnet i blokkering løsning (1/100) til lysbildene, dekk dem med parafilm og inkuberes i 2 dager ved 4 o C. Sørg for at hjerneskiver ikke tørker ut. Hvis det er nødvendig, søke på nytt anti-ChAT antistoff løsning på hjerneskiver 24 timer etter inkubasjon.
    19. Vask glir tre ganger i 1 x PBS i 5 min ved RT.
    20. Legg 100-200 mL av den aktuelle Alexa-konjugert sekundært antistoff (. F.eks Alexa-594 esel anti-geit for dette eksempelet) til lysbildene, dekk med parafilm og incubspiste i 1 time ved RT.
    21. Vask glir tre ganger i 1 x PBS i 5 min ved RT.
    22. Vask glir en gang med destillert vann.
    23. Mount lysbilder med DAPI holdig monteringsmedium.
    24. Visualhjerneskiver under et fluorescensmikroskop.

2. Påvisning av Atf4 mRNA lokalisert til Axoner i Human Brain Samples bruker Chromogenic In Situ Hybridisering (CISH) Etterfulgt av Luxol Fast Blå og cresylfiolett kontra

  1. Prøveopparbeidelse for formalinfiksert parafin-embedded menneskelige hjerne prøver
    1. Bake skiver i en tørr ovn ved 60 ° C i 1 time.
    2. Deparaffinize hjerneskiver i en avtrekkshette.
      MERK: FORSIKTIG: reagenser er giftig og må håndteres og kastes etter de aktuelle retningslinjer for sikkerhet
      1. Fordype lysbilder i xylen alternativ oppgjørsmiddel to ganger i 10 min.
      2. Fordype lysbilder i 100% etanol to ganger i 1 min.
      3. AIR-tørr skiver 5 min ved RT. Merk: Alternativt prøvene kan bli tørket ved RT O / N, men må brukes i løpet av 24 timer.
  2. Diaminobenzidin (DAB) -baserte kromogen ISH analyse etterfulgt av Luxol rask blå og cresylfiolett flekken ved hjelp av varme-indusert og protease-indusert RNA avsløring
    1. Før du begynner å forberede nødvendige materialer:
      1. Varm hybridisering ovnen til 40 o C og legg et brett med destillert vann for å lage en fuktet miljø.
      2. Ta et lysbilde boks og legg tørkepapir dynket i destillert vann inne å fukte lysbildet boksen. Plasser raset boksen i hybridisering ovnen.
      3. Forbered 1x forbehandle 2 ved fortynning av 10 x stamløsning (inkludert i CISH Reagent Kit) i RNase-fri eller DEPC-behandlet vann. Ved forbehandling utføres på en varm plate, tilsett 100 ml forbehandling løsning på en 100 mm diameter glassform for å øke kontaktflaten mellom fatet og den varme platen (hvis forbehandlingutføres i en mikrobølgeovn, kan en Coplin krukke brukes i stedet som angitt i 1.2.3). Varme oppløsning til 100 ° C og holde den kokende ikke lenger enn 30 min før neddykking prøver.
      4. Varme negative og positive sonder 10 min ved 40 o C og kjøle seg ned på RT.
      5. Stabil amplifiseringsreagenser AMP 1-6 (inkludert i CISH Reagens Kit) ved RT.
      6. Forbered 1x vaskebuffer fortynne 50x stamløsning (inkludert i CISH Reagent Kit) i destillert vann. Merk: 1x vaskebuffer kan oppbevares i romtemperatur i 1 måned og brukes for fremtidig misfarging.
    2. Legg ~ 4 dråper (~ 120 ul) av forbehandle en til hver hjerne skive, dekk med parafilm og inkuberes ved romtemperatur i 10 min.
    3. Vask 3 til 5 ganger i friskt destillert vann.
    4. Utfør varmeindusert avsløring:
      1. Overfør lysbilder til varmt forbehandle 2 (inkludert i CISH Reagens Kit) løsning og kok i 15 min. Merk: Koke kan utføres på en varm plate som sikrerkontinuerlig koking eller i en mikrobølgeovn følgende kritiske trinnene spesifisert i 1.2.3).
    5. Umiddelbart overføre lysbilder til destillert vann og vasker 3 til 5 ganger.
    6. Vask glir 3 til 5 ganger i fersk 100% etanol.
    7. Lufttørke skiver 5 min ved RT. Merk: Alternativt skiver kan tørkes O / N.
    8. Utfør protease-indusert avsløring:
      1. Tilsett 4 dråper pretreat 3 (inkludert i CISH Reagens Kit), dekk med parafilm og inkuber 30 min ved 40 o C i hybridisering ovnen.
    9. Vask glir 3 til 5 ganger i friskt destillert vann.
    10. Tilsett 4 dråper av dapB sonden settes til disse hjerneskiver som brukes til å vurdere bakgrunnsfarging.
    11. Tilsett 4 dråper av den målsøkende sonde settes til disse hjerneskiver som brukes for å påvise RNA av interesse.
      MERK: En probe sett rettet rester 15 - 1256 av det menneskelige ATF4 mRNA er brukt i dette eksempel. EKSTRA: flere hjerneskiver kan være hybridized med en sonde sett rettet mot menneskelig PPIB og anvendt som positive kontroller.
    12. Plasser lysbilder i raset boksen og inkuberes i 2 timer. ved 40 o C i hybridisering ovnen.
    13. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    14. Tilsett 4 dråper AMP en reagens til hver hjernen skive, dekke lysbilder med Parafilm, plassere dem i raset boksen og inkuberes ved 40 o C i 30 min i hybridisering ovnen.
    15. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    16. Tilsett 4 dråper AMP 2 reagens til hver hjernen skive, dekke lysbilder med Parafilm, plassere dem i raset boksen og inkuberes ved 40 o C i 15 min i hybridisering ovnen.
    17. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    18. Tilsett 4 dråper AMP 3 reagens til hver hjernen skive, dekke lysbilder med Parafilm, plassere dem i raset boksen og inkuberes ved 40 o C i 30 min i hybridisering ovnen.
    19. Vask glir to ganger med 1x varH buffer i 2 minutter ved RT.
    20. Tilsett 4 dråper AMP 4 reagens til hver hjernen skive, dekke lysbilder med Parafilm, plassere dem i raset boksen og inkuberes ved 40 o C i 15 min i hybridisering ovnen.
    21. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    22. Tilsett 4 dråper av AMP 5 reagens til hvert hjerneskive-dekkglass med parafilm og inkubert 30 min ved RT.
    23. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    24. Tilsett 4 dråper AMP seks reagens til hver hjernen skive, dekke lysbilder med parafilm og inkuber 15 min ved RT.
    25. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT.
    26. Bland like stort volum av BROWN-1 og BROWN-to reagenser (inkludert i CISH Reagens Kit), tilsett ~ 120 mL av løsning til hver hjernen skive, dekk med parafilm og inkuber 10 min ved RT.
    27. Vask glir to ganger med 1 x vaskebuffer i 2 min ved RT og skyll gang i destillert vann.
      MERK: kritiske trinn: de følgende trinnene er avgjørende for åoppnå en optimal aksonal counterstain uten maske nærværet av RNA granuler.
    28. Før du utfører counterstain sjekke tilstedeværelsen av mRNA av interesse under et lysfelt mikroskop. Definere referanseområder i hjerneprøvene som å overvåke tilstedeværelsen av puncta hele counterstain prosedyren.
    29. Forvarm Luxol rask blå løsning ved 60 o C.
    30. Plasser lysbilder i Luxol rask blå og inkuber 30 min ved 60 o C.
    31. Skyll flere ganger i destillert vann.
    32. Dip skyves flere ganger i 0,05% litiumkarbonat oppløsning til å begynne differensiering.
    33. Dip glir to ganger i frisk 75% etanol.
    34. Skyll i destillert vann.
    35. Sjekk hjerneskiver under et lysfelt mikroskop. Merk at grå og hvit substans bør begynne å være skjelnes og RNA granulater fortsatt synlige som mørke blå / svart puncta. Kontroller at aksoner begynner å vises som lys blå fibre.
    36. Gjenta trinn 2.2.28 til 2.2.32. Utføm inkubasjoner med Luxol fast blue-løsning i løpet av 10 - 20 min trinn, nøye med counterstain og nærværet av RNA-granuler. Merk: Vanligvis er optimal counterstain kjøpt i 60-90 min (total inkubasjonstid) men tiden kan kortes hvis det er mistanke om at RNA granulater kan bli maskert av Luxol rask blåved (se figur 2 for eksempler).
    37. Inkuber glir i cresylfiolett løsning i 10 minutter ved RT.
    38. Skyll lysbilder i destillert vann.
    39. Dip glir 5 til 10 ganger i 70% etanol.
    40. Dehydrere hjerneskiver gjennom tre raske endringer i 100% etanol.
    41. I et avtrekksskap, klare hjernesnitt ved inkubering to ganger i xylen alternativ clearingmiddel i 2 min, og en tredje gang i 5 min ved RT.
    42. Mount hjerneskiver i xylen-basert permanent monteringsmedium.
    43. Analysere prøver under et lysfelt mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En kort oppsummering av de prosedyrer som er beskrevet ovenfor, er vist i figur 1.

Optimal deteksjon av Atf4 mRNA granulat i kolinerge aksoner ved hjelp av varme-indusert avsløring

Ved vurdering axonal lokalisering av mRNA, er det viktig å være i stand til å identifisere aksonene og for å være i stand til å visualisere lave rikelig RNA. RNA ISH-teknologien som beskrives her muliggjør deteksjon av RNA ved en enkelt-molekyl oppløsning. Standardprotokollene ved hjelp av denne teknologien foreslår en kombinasjon av to fremgangsmåter for å avsløre effektivt detektere mål RNA: protease-indusert og varmeindusert avmaskering 28. Men når ISH er kombinert med immunhistokjemi for å identifisere aksoner, protease-indusert avmaskering kan ikke resultere i en optimal antigen gjenkjenning 29.

I den første protokollen beskrevet her, ble proteasenedbrytning unngås, ettersom antistoffet som brukes mislyktes i å gjenkjenne choline acetyltransferase (chat) som vanligvis finnes i aksoner av dentate gyrus som kommer fra septohippocampal pathway (figur 2A og B), selv om positive mRNA korn ble oppdaget. Varmeindusert gjenfinning med 10 mM citratbuffer (pH 6), på den annen side sørget for integriteten av epitopen gjenkjent av anti-ChAT-antistoff og mål-mRNA ble påvist effektivt i ChAT-farget aksoner (figur 2C og D). Resultatene presentert her (Figur 2) viser nærværet av Atf4 i dentate gyrus av voksne mus hvor mRNA rekruttering og lokal oversettelse ble indusert ved infusjon av Ap 1-42 oligomerer i hippocampus. Tidligere bevis tyder på at Atf4 mRNA ikke påvises i aksoner in vitro eller in vivo i henhold til basale betingelser 18, og således for eksempel en eksperimentell paradigme ikke er vist.

Optimal deteksjon av ATF4mRNA granulat i aksoner bruker både varme-indusert og protease-indusert avsløring

Mens resultatene beskrevet ovenfor viser at antistoff basert protein påvisning er kompatibel med RNA ISH teknologi når du utfører varme indusert avsløre det kan ikke være nyttig hvis protease pre-behandling er nødvendig. Avsnitt 2 beskriver påvisning av ATF4 mRNA innen axoner følgende tidligere publiserte prosedyrer 28,30 kombinert med histologiske flekker som vanligvis brukes for hjerneprøver 31,32.

Et viktig skritt i denne prosedyren er den optimale counterstain myelinerte fibrene bruker Luxol fort blå (LFB) uten maske tilstedeværelse av mRNA granulater i aksoner farget av CISH. Reagenser anvendt for dette formål tillater optimal counterstain med LFB etter inkuberingstider på 60 til 90 min. Counterstain kan mislykkes når både temperatur og inkubasjonstidene er redusert (figur 3A og innfelt, og data ikke vist) ennd selv mRNA granulater vil fortsatt være synlig, deres aksonal lokalisering kan ikke bekreftes. På den annen side, inkubering hjerneprøver i 60 min eller lengre ved 60 ° C uten å overvåke tilstedeværelsen av positive granuler periodisk kan føre til irreversibel maskering av mRNA av interesse ved å fargestoffet (figur 3B og innfelt). Det er derfor anbefalt at Prøvene inkuberes i LFB i 30 minutter, og at ytterligere inkubasjon gjennomføres trinnvis kontrollerer prøvene hver 10 til 20 min for å oppnå en optimal farging av både axoner og RNA-granulater (figur 3D-F). Ved å følge disse retningslinjene Atf4 positive granuler kan tydelig påvises både i kontroll (figur 3D) og Alzheimers sykdom (figur 3F) hjerneprøver.

Figur 1
Figur 1. Oppsummert arbeidsflytav RNA ISH fulgt av aksonal counterstain. Steps avbildet i svart er felles for de to prosedyrene eksemplifisert. Trinn uthevet i blått er spesifikke for paraformaldehydfiksert prøver farget av fluorescerende ISH mens de markert med rødt er spesifikke for formalinfiksert parafin-embedded prøver farget av kromogen ISH. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. FISH for Atf4 mRNA lokalisert til kolinerge axoner i dentate gyrus av voksne mus. FISH ble utført ved hjelp av protease-indusert (l eft panel) eller varme-indusert (høyre panel) avsløring fulgt av antistoffpåvisning av kolin acetyltransferase (chat) . Den Antibody klarte å gjenkjenne ChAT når protease behandlingen ble utført. Eksempler på resultater oppnådd med et ikke-målsøkende sonde (dapB) og Atf4 -targeting proben ved anvendelse av det samme objektbilde innstillinger og justeringer er vist. Atf4 -positive granuler med uklart aksonal lokalisering, er angitt med spørsmålstegn mens lokaliserte granuler som er merket som " ok ". Scale bar 20 pm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. CISH for ATF4 mRNA lokalisert til myelinerte axoner i menneske hippokampalformasjonen. Etter ISH, ble aksoner motfarget med Luxol rask blå (LFB) og nevronale somata ble kontra med cresylfiolett. Suboptimal LFB flekker kan resultere hvis både temperatur (A og innfelte representerer prøver farget med LFB ved 40 o C i 4 timer.) Og inkubasjonstid (ikke vist) blir redusert, eller når counterstain ikke er merket etter korte inkubasjonsperioder (B og innfelt ). Eksempler på optimal LFB farging kombinert med ISH med et ikke-måls probe (dapB) eller ATF4 -targeting probe vises (CF og innfellinger). Image oppkjøpet ble automatisk justert for de beste signal-til-støy-forhold. ATF4 -positive granulater med uklart axonal lokalisering er markert med spørsmålstegn mens lokaliserte granulater er merket som "ok". Scale bar 50 mikrometer, innfellinger 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne rapporten beskriver vi bruk av en høy oppløsning ISH teknologi i deteksjon av axonally lokalisert Atf4 mRNA. Disse og tidligere publiserte studier viser at denne teknologien er kompatibel med antistoff-baserte protein påvisning i vev eller hele embryoer 33. Viktigere, har det nylig blitt brukt for påvisning av Arc mRNA innen dendritter av hippocampus nevroner 34. Den kan også kombineres med histologiske fargestoffer for vev-farging. Til slutt, er det egnet for samtidig påvisning av flere mål RNA 28,30,33. Disse funnene eksemplifiserer allsidighet av høyoppløselige RNA ISH teknologier, og mindre modifikasjoner til de originale protokoller ikke senke følsomheten av denne metoden.

Opprinnelige protokoller som beskriver bruken av Z-struktur prober for å detektere mRNA av interesse i vev ved et enkelt-molekyl oppløsning foreslår to trinn for mRNA avsløre involvererprotease fordøyelsen og prøve kokende 30,35. Her viser vi hvordan protease-indusert avsløre negativt påvirker vellykket antistoffbasert deteksjon av ChAT i kolinerge aksoner som kommer fra Septo-hippocampus pathway (figur 2A og B). Dermed bestemte vi oss for å utelukke dette trinnet og utfører bare varmeindusert avsløring om aksonal kontra involverte bruk av antistoffer. Som vist (figur 2C og D), kan kolinerge aksoner bli visualisert med et anti-ChAT-antistoff og Atf4 mRNA granuler var påvisbare unngå proteasenedbrytning. Legg merke til at den positive påvisning av Atf4 mRNA er basert på bakgrunnsfluorescens oppnådd fra den negative probe. En ekstra kontroll kan inkluderes på dette punktet ved å behandle hjerneprøver med RNases og sondering dem med musen Atf4 sonder for å teste deres spesifisitet. Dette trinn er imidlertid ikke tatt med i de prosedyrer som diskutert her, sidenforrige bevis show, bruker den samme teknologien, en fullstendig nedbryting av Atf4 mRNA i aksoner følgende siRNA injeksjon i mus hippocampus 18. Slike resultater viser spesifisiteten av ISH probene som brukes her. Bruk av kontroller, annet enn de negative sonder bør vurderes basert på bestemte vitenskapelige spørsmål. Til slutt kan varmeindusert gjenfinning være substituert med eller i kombinasjon med protease-indusert avmaskering avhengig av kravene til antistoffet som brukes for axon kontra. Valget av ved hjelp av en eller annen fremgangsmåte eller en kombinasjon av begge deler må bestemmes empirisk av brukeren.

Når du utfører protease- og varme-indusert avsløring i menneskelige hjerne prøver, kan histologiske fargestoffer erstatte antistoffbasert aksonal kontra. Selv om det opprinnelige protokoll som følges her foreslår anvendelse av hematoksylin for vev kontra 30, er et slikt fargestoff ikke egnet for axon farging. Dermed Luxol fast blått ble anvendt for å farge myelinerte axoner og kresyl-fiolett ble brukt for å visualisere nevronale cellelegemer. LFB, utviklet av Kluever og Barrera 31, ble valgt fremfor andre flekker fordi det kan gjennomføres på mindre enn to timer og hvis differensiering er optimalisert (Figur 3C-F) lys blå flekken ikke forstyrrer de mRNA granulater som vises som mørke brun-sorte prikker. Som vist (figur 3), kan optimal LFB kontra oppnås ved å inkubere prøvene ved 60 ° C i 60-90 min. Det anbefales imidlertid at inkubasjon utføres trinnvis slik at differensiering kan følges nøye og mRNA granulater er alltid synlig. Andre histologiske teknikker som Bielchowsky er eller Bodian sølvfarging avkastning grå-svart axon flekker 36 som kanskje ikke er kompatible med DAB-baserte kromogen reaksjon valgt i denne rapporten. Sannsynlig, slike fargeteknikker bør kombineres med RNA CISH analysersom tillater bruk av alternative fargestoffer slik som rask rød eller grønn 30 HRP. Velge den passende kombinasjon av RNA ISH analyser og aksonal flekker skal bestemmes empirisk av brukeren.

En begrensning av den første prosedyren som er beskrevet i denne rapporten er den mislykket protein deteksjon av immunhistokjemi hvis proteasenedbrytning utføres. Denne begrensning kan overvinnes ved å unngå protease-indusert avmaskering. I spesielle tilfelle av axonally-lokaliserte Atf4 utfører varme-indusert avsløring var tilstrekkelig til å oppdage mRNA granulater over bakgrunnsnivå i kolinerge aksoner. Dette kan imidlertid ikke være tilfelle for andre mRNA av interesse og proteasenedbrytning kan være nødvendig. I så fall bør aksonal kontra utføres ved hjelp av andre enn den anti-ChAT-antistoff her beskrevne antistoffer. Alternativt kan antistoffbasert kontra bli erstattet av histologiske fargestoffer som beskrevet i punkt 2 i protokollen.

30 HRP.

Som det fremgår av protokollen delen, en av de kritiske trinn i begge prosedyrer er den varmeinduserte avmaskering. Hvis kokende utføres i en mikrobølgeovn, er det sjanser for løsningen fordampning avhengig av egenskapene til enheten. Følg trinnene som er angitt i 1.2.3 og 2.2.4 for å unngå løsning fordampning. For fast frosset vev 10 min av avsløring bør være nok, mens for parafin innebygdvev koking i 15 minutter anbefales. Hvis prøvene ikke koke kontinuerlig for den anbefalte tiden dette kan resultere i delvis avsløring. Men tider kunne variere litt om andre enheter, for eksempel en riskoker eller en kokeplate er valgt i stedet for en mikrobølgeovn. Koke varighet bør bestemmes av brukeren, avhengig av metoden.

Et annet kritisk punkt er LFB kontra. Det er viktig at intensiteten av den blå fargen ikke kommer i konflikt med visualisering av mRNA granuler. Noen modifikasjoner av den opprinnelige protokoll 31 ble utført for å redusere intensiteten av fargestoff, slik som reduksjon av temperaturen (figur 3A), eller inkubasjonstiden (data ikke vist), men vi klart å skille klart myelinerte aksoner i humane hjerneprøver . På den annen side, å inkubere prøvene i LFB løsning ved den foreslåtte temperatur (60 ° C) resulterte i optimal farging av myelinerte axoner. Deter imidlertid anbefalt at kontra utføres trinnvis nøye overvåking av tilstedeværelsen av RNA-granuler til enhver tid for å sikre at LFB ikke maskere den mRNA av interesse som er angitt i trinn 2.2.28-2.2.36.

Til slutt bør prøvene aldri tørke ut. Metodene som beskrives i dette dokumentet inneholder flere inkubasjons-trinn ved 40 ° C, noe som øker sjansene for reagens fordampning. Som det fremgår av protokollene, må prøvene dekket med parafilm i alle forholdsregler for å unngå fordampning.

I sammendraget, er utviklingen av høyoppløste RNA ISH og andre ISH metoder muliggjør visualisering av lavt rikelig transkripsjoner, inkludert de lokalisert til voksne axoner in vivo. Dette er spesielt viktig siden i mange år mRNA til lokalisering og oversettelse hos voksne aksoner ble sterkt oversett som de ble vurdert translatorisk inaktive.

Avslutningsvis presenterer vi en ny og promising teknologi for deteksjon av Atf4 og potensielt mange andre mRNA hos voksne aksoner i hjernen hos pattedyr. RNAscope vil legge til rette for fremtidige studier på mRNA lokalisering og vil bidra til å løse den biologiske betydningen av deres lokale oversettelses in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) Advanced Cell Diagnostics - probe
custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) Advanced Cell Diagnostics - probe
negative control probe-DapB Advanced Cell Diagnostics 310043 probe
positive control probe-mouse Polr2A (optional) Advanced Cell Diagnostics 312471 probe
positive control probe-human PPIB (optional) Advanced Cell Diagnostics 313901 probe
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) Advanced Cell Diagnostics 320850 in situ hybridization kit
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) Advanced Cell Diagnostics 310035 in situ hybridization kit
Goat polyclonal anti-ChAT antibody Millipore AB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit American MasterTech KTLFB
Clearify clearing agent (xylene substitute) American MasterTech CACLEGAL
ProLong Gold mounting  medium with DAPI Life Technologies P36935
DPX mounting medium Sigma 6522

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Tags

Neuroscience mRNA lokalisering aksoner, RNAscope, Voksen hjerne
Påvisning av Axonally Lokalisert mRNAs i hjernedelene med høy oppløsning<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C.,… More

Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (100), e52799, doi:10.3791/52799 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter