Abstract
мРНК часто локализуется в позвоночных аксонов и их местный перевод требуется для поиска пути аксонов или разветвления в процессе разработки и технического обслуживания, ремонта или нейродегенеративных в postdevelopmental периодов. Высокие анализы пропускная недавно показали, что аксоны имеют более динамичное и сложное транскриптом, чем ожидалось ранее. Это анализ, однако, были в основном делается в культивируемых нейронах, где аксоны могут быть изолированы от сомато-дендритной отсеков. Это практически невозможно добиться такой изоляции в целых тканей в естественных условиях. Таким образом, для того, чтобы проверить набор мРНК и их функциональной значимости в целом животном, транскриптом анализ в идеале должны быть объединены с методами, которые позволяют визуализировать мРНК на месте. Недавно новые технологии ISH, которые обнаруживают РНК на уровне в одной молекулы были разработаны. Это особенно важно при анализе внутриклеточную локализацию мРНК, Так как локализованные РНК обычно находятся на низком уровне. Здесь мы описываем два протокола для обнаружения axonally-локализованных мРНК с использованием нового сверхчувствительного технологии РНК ISH. Мы объединили RNAscope ISH с аксонов контрастирующая с помощью флуоресцентной иммуногистохимии или гистологических красителей для проверки набор Atf4 мРНК для аксонов в естественных условиях в зрелом мозге мыши и человека.
Introduction
Аксонов набор мРНК и локальная перевод позволяют аксоны в ответ на внеклеточные стимулы в времени и пространстве острой манере 1. Intra-аксонов синтез белка лучше понимать в контексте развития нервной системы, где она играет решающую роль в росте поведения конуса 2-8, 9-11 аксона первопрохождения и ретроградной сигнализации 12,13. Но гораздо меньше известно о функциональном значении аксонов синтеза белка в нейронах после развития, когда аксонов мРНК и рибосом уровни значительно снижается 14,15. Зрелые позвоночных аксоны уже давно считается неактивным поступательно 16. Тем не менее, последние исследования показывают, что местное перевод активируется в зрелых аксонов при патологических условиях. Например, подмножество мРНК рекрутируется регенерации аксонов после травмы нерва и внутри аксонов синтез белка требуется для правильной регенерации аксонов этих 17. Кроме того, наша группа гас показали, что специфические мРНК набираются аксонов после локальное воздействие на заболевания пептида Альцгеймера Ар 1-42, и местного перевод фактора транскрипции ATF4 требуется для распространения нейродегенеративных последствий Ар 1-42 из аксонов нейронов сомы 18. Наконец, высокие анализы пропускная показали, что зрелые аксоны имеют более сложную и динамичную транскриптом, чем ожидалось 18-21, особенно при патологических состояниях. В свете этих исследований, высокую чувствительность и специфичность метода для выявления axonally локализованные мРНК в нервной системе взрослых не требуется.
Большая часть работы по набору мРНК и местного перевод в зрелых аксонов была выполнена на культивируемых нейронов. Это особенно верно для транскриптомный анализирует с специализированные методы культивирования, которые позволили изоляции аксонов от сомато-дендритной отсека 18-20. Хотя такие исследования дали ценные модулиIGHT в роли местного перевод в зрелых аксонов, вопрос о том, культивируемые нейроны добросовестно представлять ситуацию в естественных условиях, или если мРНК вербовка адаптивная реакция аксонов культивирования условиях остается открытым. Несколько исследований предоставили доказательства вербовки мРНК, чтобы созреть аксоны в естественных условиях. Например, транскрипт кодирующей обонятельной маркерного белка был обнаружен в аксонов в сенсорных нейронах взрослых 22. Трансген, содержащий 3 'UTR из β-актина мРНК транспортируется аксонов периферических и центральных нейронов нервной системы у мышей и локально переводится после развития периодов 23. Ламин b2 мРНК локализуется сетчатки аксонов в Xenopues Laevis головастиков и его истощение влияет обслуживание аксонов после аксонов развития 21. Вмешательство в аксонов транспорта мРНК, кодирующей для цитохром с оксидазы IV изменяет поведение мыши 24. Наконец, Atf4 мРНК находится во взрослой аXons мышей и человеческих мозгов в контексте Ар 1-42 индуцированной нейродегенерации 18.
Высокая пропускная способность анализа транскриптом оказались полезными для идентификации мРНК профили в изолированных аксонов в пробирке, но есть ограничения для естественных условиях исследования в так целыми тканей аксоны никогда не встречаются в изоляции, а перемешаны с нейронных клеточных тел, глиальные клетки и другие типы клеток. Таким образом, такой анализ должен быть объединен с методик визуализации, которые подтверждают внутриклеточную локализацию мРНК. РНК в гибридизация (ISH) РНК позволяет детектировать и визуализацию конкретных последовательностей РНК в клетках и тканях. Тем не менее, оригинальные анализы РНК ISH были пригодны только для идентификации весьма обильными РНК 25, который редко относится к axonally локализованных мРНК. За последние десятилетия все более активные усилия были введены в развивающихся новых технологий, которые позволяют обнаруживать мРНК при уровне одиночных молекул
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены IACUC Колумбийского университета и руководящих принципов для ухода и использования лабораторных животных наблюдались. Примечание: Подготовка всех буферов, используемых для процедур ISH в РНКазы или DEPC обработке воды. Эта рекомендация не является строго необходимым, после ISH была завершена, но предполагается, что буферы еще получают автоклавного бидистиллированной воды и / или стерилизуют фильтрацией.
1. Обнаружение Atf4 мРНК локализуется в холинергических Аксоны у взрослых мышей мозга с использованием флуоресценции в гибридизация (FISH), а затем с помощью иммуногистохимии
- Подготовка образца для параформальдегидом фиксированной замороженных срезах мозга
- В следующем примере, готовят ломтики со стационарных замороженных мозгов мыши.
- Вкратце, пожертвовать 9 месячного мышей анестезией кетамином (100 мг кг -1 веса тела) и ксилазин (10 мг кг -1 тела WeigHT) с последующим вливанием transcardial 4% параформальдегида в PBS (рН 7,4).
- Удалить мозги и пост-фикс в 4% параформальдегида в течение 24 часов при 4 ° С.
- После фиксации стирать образцы трижды в PBS и cryoprotect в 30% сахарозы в PBS (рН 7,4) в течение 24 ч при 4 о С.
- Код для вставки мозги в октябре замораживания соединения, поочередно раздел на 20 мкм на криостате и смонтировать на поли-D-лизина, получавших микроскопа. Держите ломтики мозга при -20 ° С до использования.
- Удалить ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ фиксированной ломтики мозга с морозильной камерой и воздушно-сухой в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Промыть три раза 1x PBS.
- В вытяжном шкафу, вновь исправить мозг ломтики 20 мин с 4% параформальдегида при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: ОСТОРОЖНО: 4% параформальдегида является токсичным и должны быть обработаны и отбрасываются должным образом следующие протоколы безопасности. - Промыть три раза 1x PBS.
- Дегидрировать ломтики мозга.
- Готовят 50%, 75% и 100%этанол решения.
- Погрузитесь слайдов в 50% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Погружают слайдов в 75% этаноле в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Погружают слайдов в 100% этаноле в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Погружают в свежий слайды 100% этаноле в течение 5 мин при комнатной температуре. Примечание: В качестве альтернативы, горки могут быть сохранены в 100% -ном этаноле при -20 ° С до 1 месяца.
- В следующем примере, готовят ломтики со стационарных замороженных мозгов мыши.
- РЫБЫ анализ с последующим использованием иммуногистохимии тепла индуцированных антиген / РНК разоблачение
- Перед началом подготовки все необходимые материалы:
- Нагрейте гибридизации духовку до 40 ° C и поместите лоток, содержащий дистиллированную воду в духовке, чтобы создать во влажной среде.
- Возьмите слайд коробку и поместите бумажные полотенца, смоченные в дистиллированной воде внутри, чтобы увлажнить окно слайд. Поместите коробку слайд в гибридизации духовке.
- Удалить зондов (как негативные, так и целевые зонды) из холодильника и нагревают их в гибридизации печи в течение 10 мин. Пусть зонды остыть Dowп при комнатной температуре.
- Равновесие реагенты для амплификации AMP 1-4 (входит в комплект Люминесцентная Мультиплекс реагента) при комнатной температуре.
- Подготовка раствора антигена извлечения: 10 мМ цитрат натрия (рН 6), 0,05% твин 20. Примечание: раствор можно хранить при комнатной температуре неопределенно долго и использовать для дальнейшего окрашивания.
- Приготовьте 1х промывочный буфер разбавления 50x маточного раствора (входит в комплект Люминесцентная Мультиплекс реагента) в РНКазы или DEPC обработке воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1x промывочный буфер может храниться при комнатной температуре в течение 1 месяца и использовать для будущего окрашивания. 50x промывочного буфера может выпадать в осадок. Если это так, тепло 50x промывочный буфер при 40 ° С в течение 10 мин до получения раствора 1x.
- Удалить слайды из 100% этанола и сухого воздуха в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Подготовка Коплин банку, содержащую 50 мл раствора антигена поиска. Погрузитесь слайдов в раствора антигена поиска и варить их в течение 10 мин в микроволновой печи.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы место скользит горизонтально 100 ммДиаметр круглого стеклянное блюдо, содержащий 100 мл поиска решения.- Заполните 1 л стакан с дистиллированной водой и поместите его в микроволновой печи.
ПРИМЕЧАНИЕ: вода "буфер" тепло при выполнении разоблачения. - Поместите слайды в антиген-поисковой раствора внутри микроволновой печи. Отварить скользит при высокой мощности в течение 5 мин. Сразу после того как образцы перестали кипеть, тепло снова скользит при высокой мощности для дополнительных 5 мин.
- Охладить слайды при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важным шагом: кипящей продолжительность и порядок должны быть определены пользователем, в зависимости от характеристик СВЧ. Чем быстрее кипения начинается выше шансы испарения раствора. В этом случае рекомендуется, чтобы образцы кипятят в течение более коротких периодов времени более чем в два раза, чтобы завершить полную разоблачающий время 10 мин. Наоборот, если нагрев осуществляется при средней или низкой мощности, разоблачение может быть выполнена один раз в течение 10 мин. Тем не менее, если образцы не кипятить continuouslу в общей сложности примерно 10 мин, это может привести к частичному разоблачению как целевой РНК и белка для обнаружения.
- Заполните 1 л стакан с дистиллированной водой и поместите его в микроволновой печи.
- Промыть слайды три раза 1x PBS.
- Добавить 2 - 3 капли (~ 100 мкл) пробы dapB, установленным в этих срезах мозга, используемых для оценки фонового окрашивания. Примечание: набор зонд dapB нацелен на бактериальный ген и не должна признавать любой РНК млекопитающих.
- Добавить 2 - 3 капли направленную зонда, установленного в этих срезах мозга, используемых для обнаружения РНК интересов. Примечание: набор зонд ориентации остатки 20 - 1381 мыши Atf4 мРНК, используемой в этом примере.
- Обложка слайды с парафином, чтобы избежать испарения зонда, поместите их в увлажненной слайд поле внутри печи гибридизации и инкубировать их при 40 ° С в течение 2 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДОПОЛНИТЕЛЬНО: дополнительные кусочки мозга могут быть гибридизации с набором зондов таргетирования мыши Polr2A и используется в качестве положительного контроля. - Вымойте SLIдез дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавить 2 - 3 капли реагента усиления AMP 1-ФЗ каждому срезу мозга, охватывают слайды с парафином, положите их в ящик слайдов и инкубировать при 40 ° С в течение 30 мин в духовке гибридизации.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавить 2 - 3 капли реагента усиления AMP 2-ФЗ каждому срезу мозга, охватывают слайды с парафином, положите их в ящик слайдов и инкубировать при 40 ° С в течение 15 мин в духовке гибридизации.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавить 2 - 3 капли реагента усиления AMP 3-ФЗ каждому срезу мозга, охватывают слайды с парафином, положите их в ящик слайдов и инкубировать при 40 ° С в течение 30 мин в духовке гибридизации.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавить 2 - 3 капли реагента усиления AMP 4-ФЗ каждому срезу мозга, охватывают слайды с парафином, положите их вкоробка слайдов и инкубировать при 40 ° С в течение 15 мин в духовке гибридизации.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре и дважды 1x PBS.
- Добавьте 100 - 200 мкл (или достаточный объем, чтобы полностью покрыть ломтики) раствора блокирующего содержащие 3 мг / мл BSA, 100 мМ глицина и 0,25% Triton X-100 в PBS (рН 7,4), чтобы слайдов, покрывают их парафином и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 100 - 200 мкл анти-ХАТ антитела, разведенного в блокирующем растворе (1/100) на слайдах, покрывают их парафином и инкубируют в течение 2 дней при температуре 4 ° С. Убедитесь, что ломтики мозга не высыхают. При необходимости, повторно применить против ChAT раствор антител к срезах мозга 24 часов после инкубации.
- Промыть слайды три раза в 1X PBS в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 100 - 200 мкл соответствующей Alexa-конъюгированного второго антитела (. Например, Alexa-594 осел анти-козел для этого конкретного примера) к слайдам, покрывают парафином и с incubели в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Промыть слайды три раза в 1X PBS в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Промыть скользит один раз дистиллированной водой.
- Гора слайды с DAPI, содержащие монтажа среды.
- Визуализация срезах мозга под флуоресцентным микроскопом.
- Перед началом подготовки все необходимые материалы:
2. Обнаружение Atf4 мРНК локализуется в Аксоны в образцах мозга человека с использованием хромогенного В гибридизация (CISH) с последующим Luxol Fast синий и Cresyl Violet Counterstaining
- Подготовка образца для парафин образцов человеческого мозга фиксированных формалином
- Выпекать ломтики в сухой печи при 60 ° С в течение 1 ч.
- Deparaffinize кусочки мозга в вытяжном шкафу.
ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ: реагенты являются токсичными и должны быть обработаны и отбрасываются следующие соответствующие руководящие принципы безопасности- Погружают слайды в ксилоле альтернативного Осветлитель дважды в течение 10 мин.
- Погружают слайдов в 100% этанола в два раза в течение 1 мин.
- ИК-сухой ломтики 5 мин при комнатной температуре. Примечание: В качестве альтернативы можно было бы образцы сушат при комнатной температуре O / N, но должны быть использованы в течение 24 часов.
- Диаминобензидин (DAB) основе хромогенного ISH анализа с последующим быстрым Luxol синего и фиолетового крезиловым пятно с помощью тепла, вызванному и протеазы, вызванной РНК разоблачение
- Перед началом подготовки необходимых материалов:
- Нагрейте гибридизации духовку до 40 ° C и поместите лоток, содержащий дистиллированную воду, чтобы создать во влажной среде.
- Возьмите слайд коробку и поместите бумажные полотенца, смоченные в дистиллированной воде внутри, чтобы увлажнить окно слайд. Поместите коробку слайд в гибридизации духовке.
- Приготовьте 1х предварительно обработать 2 путем разбавления исходного раствора 10x (входит в комплект CISH реагента) в РНКазы или DEPC обработке воды. Если предварительная обработка выполняется на горячей плите, добавить 100 мл предварительно обработать раствором в 100 мм Диаметр стеклянную посуду, чтобы увеличить поверхность контакта между тарелкой и плитке (если предварительнаявыполняется в микроволновой печи, Коплин банка может быть использован вместо, как указано в 1.2.3). Тепло решение 100 ° С и не держать его кипения не более 30 мин перед погружением образцов.
- Тепловые отрицательные и положительные зонды 10 мин при 40 ° С и охлаждают при комнатной температуре.
- Равновесие реагенты для амплификации AMP 1-6 (входит в комплект) CISH реагента при комнатной температуре.
- Приготовьте 1х промывочный буфер разбавления 50x маточного раствора (входит в CISH Набор реагентов) в дистиллированной воде. Примечание: 1x промывочного буфера можно хранить при комнатной температуре в течение 1 месяца и использовать для будущего окрашивания.
- Добавить ~ 4 капли (~ 120 мкл) предварительно обработать 1, чтобы каждый срез головного мозга, покрытия с парафином и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Промыть 3 до 5 раз в свежей дистиллированной воды.
- Выполните тепла индуцированных разоблачение:
- Передача слайды в горячей предварительной обработки 2 (входит в CISH Набор реагентов) решение и варить в течение 15 мин. Примечание: кипения может быть выполнена на горячей плите, обеспечиваянепрерывного кипения или в микроволновой печи следующим важных шагов, указанных в 1.2.3).
- Сразу передачи слайды дистиллированной водой и промойте 3 до 5 раз.
- Промыть слайды 3 до 5 раз в свежей 100% этанола.
- Высушите ломтики 5 мин при комнатной температуре. Примечание: В качестве альтернативы ломтики можно сушить O / N.
- Выполните протеазы-индуцированной разоблачение:
- Добавьте 4 капли предварительно обработать 3 (входит в CISH Набор реагентов), накрыть парафильмом и инкубировать 30 мин при 40 о С в гибридизации духовке.
- Вымойте слайды 3 до 5 раз в свежей дистиллированной воды.
- Добавьте 4 капли dapB зонда, установленного в этих срезах мозга, используемых для оценки фонового окрашивания.
- Добавить 4 капли ориентации зонда, установленного в этих срезах мозга, используемых для обнаружения РНК интереса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Набор зонд ориентации остатки с 15 - 1256 человеческого ATF4 мРНК используется в этом примере. Дополнительно: дополнительные кусочки мозга может быть HYBridized с набором зондов таргетирования человека PPIB и использовали в качестве положительного контроля. - Поместите слайды в поле слайдов и инкубировать в течение 2 часов. 40 ° С в гибридизации духовке.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 4 капли 1 AMP реагента в каждую кусочек мозга, охватывают слайды с парафином, положите их в ящик слайдов и инкубировать при 40 ° С в течение 30 мин в духовке гибридизации.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 4 капли реагента AMP 2 к каждой секции мозга, охватывают слайды с парафином, положите их в ящик слайдов и инкубировать при 40 ° С в течение 15 мин в духовке гибридизации.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 4 капли AMP 3 реагента в каждую кусочек мозга, охватывают слайды с парафином, положите их в ящик слайдов и инкубировать при 40 ° С в течение 30 мин в духовке гибридизации.
- Вымойте слайды дважды 1x былоч буфера в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 4 капли AMP 4 реагента в каждую кусочек мозга, охватывают слайды с парафином, положите их в ящик слайдов и инкубировать при 40 ° С в течение 15 мин в духовке гибридизации.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 4 капли AMP 5 реагента в каждую кусочек мозга, охватывают слайды с парафином и инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 4 капли AMP 6 реагента в каждую кусочек мозга, охватывают слайды с парафином и инкубируют 15 мин при комнатной температуре.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Смешайте равные объемы BROWN-1 и коричневый-2 реагентов (входит в CISH Набор реагентов), добавить ~ 120 мкл раствора для каждого среза мозга, накрыть парафильмом и инкубировать 10 мин при комнатной температуре.
- Промыть слайды дважды промывочным буфером 1x в течение 2 мин при комнатной температуре и промыть один раз в дистиллированной воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критические шаги: следующие шаги имеют решающее значение дляполучения оптимального аксонов контрастное без маскировки присутствие РНК гранул. - Перед выполнением контрастирующая проверить наличие мРНК интерес под микроскопом светлое. Определить опорные участки в образцах мозга, в котором для мониторинга присутствия Puncta всей процедуры контрастное.
- Разогреть Luxol быстро синий раствор при 60 о С.
- Место слайды в Luxol быстрого синего и инкубировать 30 мин при 60 о С.
- Промыть несколько раз в дистиллированной воде.
- Dip слайды несколько раз в 0,05% -ном растворе карбоната лития, чтобы начать дифференцировку.
- Окунитесь скользит дважды в свежем 75% этанола.
- Промыть в дистиллированной воде.
- Проверьте ломтики мозга под микроскопом светлое. Обратите внимание, что серый и белый вопрос должен начать быть различимы и РНК гранулы еще видны, как темно-синий / черный Puncta. Убедитесь, что аксоны начинают появляться, как голубых волокон.
- Повторите шаги 2.2.28 для 2.2.32. Perforм инкубации с Luxol быстрого голубого раствора в 10 - 20 шагов в минуту, внимательно следит за контрастное и наличие РНК гранул. Примечание: Как правило, оптимальным контрастирующая приобретается в 60 - 90 мин (общее время инкубации), но время может быть сокращено, если есть подозрение, что РНК гранулы могут быть замаскированы Luxol быстрого синевы (рисунок 2 для примеров).
- Инкубируйте слайды в крезиловым фиолетовым раствором в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Промыть слайдов в дистиллированной воде.
- Окунитесь скользит от 5 до 10 раз в 70% этанола.
- Высушить срезах мозга через 3 быстрых изменений 100% этанола.
- В вытяжном шкафу, четкие срезах мозга путем инкубации дважды в ксилоле альтернативного координационного агента в течение 2 мин и в третий раз в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Ломтики Гора мозга в ксилол на основе постоянного монтажа среды.
- Анализ образцов под микроскопом светлое.
- Перед началом подготовки необходимых материалов:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Краткое описание процедур, описанных выше, показана на рисунке 1.
Оптимальное обнаружение Atf4 мРНК гранулы в холинергических аксонов с использованием тепла, вызванной разоблачение
При оценке аксонов локализации мРНК, важно, чтобы иметь возможность определить аксоны и быть в состоянии представить себе низкие обильные РНК. Технология РНК ISH описано здесь позволяет обнаруживать РНК при разрешении одной молекулы. Стандартные протоколы, использующие эту технологию предложить сочетание двух разоблачительных процедур, чтобы эффективно обнаруживать целевые РНК: протеазы, индуцированного и термически индуцированного разоблачающий 28. Однако, когда ISH в сочетании с иммуногистохимии, чтобы идентифицировать аксоны, протеазы-индуцированной разоблачение может не привести к оптимальному обнаружения антигена 29.
В первой методике, описанной здесь, протеазы расщепление избегать, так как антитело, используемое не признает Cхолин ацетилтрансферазы (ХАТ), как правило, найти в аксонов зубчатой извилине, вытекающих из septohippocampal пути (рис 2А и В), хотя положительные гранулы мРНК были обнаружены. Тепло-индуцированный извлечения с 10 мМ цитрата буфера (рН 6), с другой стороны, обеспечивается целостность эпитопа, распознаваемого анти-ХАТ антитела и целевых мРНК эффективно обнаружены в чате окрашенных аксонов (рис 2С и D). Результаты, представленные здесь (Рисунок 2) показывают наличие Atf4 в зубчатой извилине взрослых мышей, где мРНК набор и местного перевод были вызваны инфузии Ар 1-42 олигомеры в гиппокампе. Предыдущее данные свидетельствуют о том, что Atf4 мРНК не обнаруживается в аксонов в пробирке или в естественных условиях под базальных 18, и, таким образом, такие экспериментальной парадигмой не показана.
Оптимальное обнаружение ATF4мРНК гранулы в аксонов с использованием как тепловой индуцированных и протеазы-индуцированной разоблачение
В то время как результаты, описанные выше, показывают, что обнаружение белка антитела на основе, совместимой с технологией РНК ISH при выполнении термоиндуцированный разоблачения он не может быть полезным, если требуется протеазы предварительная обработка. Раздел 2 описывает обнаружение ATF4 мРНК внутри аксонов следующий ранее опубликованных процедур в сочетании с 28,30 гистологических пятен, обычно используемых для образцов мозга 31,32.
Важным шагом в этой процедуре является оптимальным контрастирующая миелинизированных волокон с использованием Luxol быстрый синий (LFB) без маскировки присутствия мРНК гранул в аксонов, окрашенных хромогенной гибридизации in situ. Реагенты, используемые для этой цели обеспечивают оптимальную контрастное с LFB После инкубации раз от 60 до 90 мин. Контрастное, возможно, не тогда, когда обе температуры и инкубации раза уменьшаются (фиг.3А и вставку, и данные не показаны)й, хотя мРНК гранулы все еще будет видно, их аксонов локализация не могут быть проверены. С другой стороны, инкубации образцы головного мозга в течение 60 мин или дольше при 60 ° С без контроля присутствия положительных гранул периодически может привести к необратимой маскировки мРНК интерес красителем (фиг.3В и вставка). Таким образом, рекомендуется, чтобы образцы инкубируют в LFB в течение 30 мин и далее инкубацию проводят ступенчато проверки образцов каждые 10 до 20 минут, чтобы получить оптимальное окрашивание обеих аксонов и гранул РНК (рис 3D-F). После этих руководящих принципов Atf4 положительные гранулы могут быть четко выявленных и контроль (рис 3D) и болезнь (рис 3F) образцов мозга Альцгеймера.
Рисунок 1. Обобщенная рабочийРНК ISH затем аксонов контрастирующая. Шаги, описанные в черном являются общими для двух процедур, примеры. Шаги выделенные синим цветом, являются специфическими для параформальдегидом фиксированной образцов, окрашенных флуоресцентным ISH в то время как те, выделенные красным цветом, являются специфическими для фиксированных формалином парафин образцов, окрашенных хромогенным ISH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Рыба для Atf4 мРНК локализуется в холинергических аксонов в зубчатой извилине взрослых мышей. РЫБЫ проводили с использованием протеазы-индуцированной (L EFT панели) или тепла, индуцированного (правая панель) разоблачение затем обнаружения антитела холинацетилтрансферазы (чат) , Антибоды не признает Чат когда была выполнена обработка протеазы. Примеры результатов, полученных с ненацеливании зонда (dapB) и Atf4 -targeting зонда с помощью микроскопа же настройки и корректировки изображения показаны. Atf4 -положительных гранулы с неясной локализации аксонов указаны с вопросительными знаками, а локализованные гранулы помечены как " ОК ". Масштабная линейка 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. CISH для ATF4 мРНК локализуется в миелиновых аксонов в гиппокампа человека. После ISH, аксоны контрастно Luxol быстро синего (LFB) и нейронов somata были контрастно крезиловым фиолетовый, Субоптимальное окрашивание LFB может привести если и температура (и вставка представляют образцы окрашенных LFB при 40 ° С в течение 4 часов.) И время инкубации (не показаны) снизилась, или когда контрастирующая не проверяется после коротких периодов инкубации (B и вставке ). Примеры оптимального LFB окрашивания в сочетании с ISH с помощью ненацеливании зонд (dapB) или ATF4 -targeting зонд показаны (CF и вставки). Приобретение Изображение было автоматически регулируется для лучших сигнал-шум. ATF4 -позитивных гранул с неясной локализации аксонов указаны с вопросительными знаками, а локализованные гранулы помечены как "нормально". Масштабная линейка 50 мкм, 10 мкм вставками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом докладе мы описываем использование технологии ISH высоким разрешением в обнаружении axonally локализованной Atf4 мРНК. Эти и предыдущие опубликованные исследования показывают, что эта технология совместима с на основе антител обнаружения белка в тканях или даже целые эмбрионов 33. Важно отметить, что в последнее время использовался для обнаружения дуги мРНК в дендритах нейронов гиппокампа 34. Она также может быть объединена с гистологических красителей для окрашивания ткани. Наконец, он подходит для одновременного обнаружения нескольких целевых РНК 28,30,33. Эти данные иллюстрируют универсальность с высокой разрешающей технологий РНК ISH, и незначительные изменения в исходных протоколов не уменьшают чувствительность этого метода.
Оригинальные протоколы, описывающие использование Z-структуры зондов для обнаружения мРНК интересов в тканях при разрешении одной молекулы предложить два шага для мРНК разоблачения с участиемпротеазы пищеварения и образец кипения 30,35. Здесь мы покажем, как протеазы, вызванной разоблачением негативно влияет на успешное обнаружение антитела на основе ЧАТ в холинергических аксонов, вытекающих из септо- гиппокампа пути (рис 2А и В). Таким образом, мы решили исключить этот шаг и выполнить только тепла, вызванной разоблачения, если аксонов counterstaining включает использование антител. Как показано (фиг.2С и D), холинергические аксоны могут быть визуализированы с анти-ХАТ антителом и Atf4 мРНК гранулы были обнаружены избежать протеазы пищеварения. Следует отметить, что положительное обнаружение Atf4 мРНК основана на фоновой флуоресценции, полученной от отрицательного зонда. Дополнительный контроль может быть включен в этот момент путем обработки образцов мозга с РНКазы и зондирования их с зондами мыши Atf4 того, чтобы проверить их специфичность. Этот шаг, однако, не входит в процедуры, обсуждаемые здесь, так какпредыдущая доказательства шоу, используя этот же технологию, а полное истощение Atf4 мРНК в аксонов следующий миРНК инъекции в гиппокампе мышей 18. Такие результаты свидетельствуют о специфичности используемых зондов ISH здесь. Использование элементов управления, кроме негативных зондов должны быть оценены на основе конкретных научных вопросов. Наконец, извлечение тепла индуцированных может быть замещен, или в сочетании с протеазой, вызванной демаскировки в зависимости от требований антитела, используемого для аксона counterstaining. Выбор с помощью одного или другой процедуры или их сочетание должны быть определены эмпирически пользователем.
При выполнении protease- и тепла индуцированных разоблачения в образцах мозга человека, гистологические красители могут заменить на основе антител аксонов counterstaining. Хотя оригинальный протокол здесь следуют предполагает использование гематоксилином для ткани counterstaining 30, например краситель не подходит для окрашивания аксонов. Таким образом, ФАС Luxolт синий использовался для окрашивания миелинизированные аксоны и крезил фиолетовый был использован для визуализации нейронов клеточных тел. LFB, разработанный Kluever и Баррера 31, был выбран по сравнению с другими пятнами, потому что она может быть завершена менее чем 2 ч и при дифференциации оптимизирован (3С-F) светло-синий краситель не мешает гранул мРНК, которые появляются в темно- коричнево-черные точки. Как показано на рисунке (Рисунок 3), оптимальный LFB counterstaining может быть достигнуто, когда инкубации образцов при 60 ° С в течение 60 - 90 мин. Однако рекомендуется, что инкубацию проводят ступенчато так, что дифференцировка может быть тщательно проверены и мРНК гранулы всегда видны. Другие гистологические методы, такие как серебро доходности окрашивание серо-черный аксона Bielchowsky или Бодиан в окрашивания 36, что не может быть совместим с DAB на основе хромогенного реакции выбранного в данном отчете. Наверно, такие методы окрашивания должны быть объединены с РНК CISH анализовкоторые позволяют использовать альтернативные красители, такие, как красный или быстро HRP зеленый 30. Выбор соответствующей комбинации РНК ISH анализов и аксонов пятен должны быть определены эмпирически пользователем.
Одно ограничение первой процедуры, описанной в настоящем докладе, неудачно обнаружения белка с помощью иммуногистохимии, если выполняется протеазы пищеварения. Это ограничение может быть преодолено, избегая протеазы индуцированных в раскрытии. В частном случае локализованной axonally-Atf4 выполняющего тепла индуцированных в раскрытии было достаточно для обнаружения мРНК гранулы выше фоновых уровней в холинергических аксонов. Это, однако, не может быть в случае с другими мРНК интересов и протеазы пищеварения могут потребоваться. Если это так, аксонов counterstaining следует проводить с использованием других, чем анти-ХАТ антителом, описанным здесь антитела. Кроме того, counterstaining на основе антител могут быть замещены гистологических красителей, как описано в разделе 2 протокола.
30.
Как указано в разделе протокола, один из важных шагов обеих процедур тепло-индуцированной разоблачение. Если выполняется кипения в микроволновой печи, есть вероятность испарения раствора в зависимости от характеристик устройства. Следуйте инструкциям, указанным в 1.2.3 и 2.2.4, чтобы избежать испарения раствора. Для фиксированной замороженной ткани 10 мин разоблачения должно хватить, тогда как для парафинткани кипения в течение 15 мин рекомендуется. Если образцы не кипятить непрерывно в течение рекомендованного времени, это может привести к частичному разоблачению. Однако времена может слегка отличаться, если другие устройства, такие как рис плита или горячей плите выбраны вместо микроволновой печью. Кипение продолжительность должна быть определена пользователем, в зависимости от способа.
Еще одним важным шагом является counterstaining LFB. Важно, чтобы интенсивность синего красителя не мешает визуализации мРНК гранул. Некоторые модификации исходного протокола 31 были выполнены для того, чтобы уменьшить интенсивность красителя, таких как снижение температуры (фиг.3А) или времени инкубации (данные не показаны), однако мы не смогли четко различать миелинизированные аксоны в образцах мозга человека , С другой стороны, инкубации образцов в растворе LFB при рекомендуемых температурах (60 ° С) в результате оптимального окрашивания миелиновых аксонов. ЭтоОднако рекомендуется, чтобы counterstaining проводится поэтапно внимательно следит за присутствие РНК гранул в любое время для того, чтобы LFB не маскирует мРНК интересов, как указано в пунктах 2.2.28-2.2.36.
Наконец, образцы никогда не должны высыхать. Методы, описанные в данном отчете включать несколько этапов инкубации при 40 ° С, что увеличивает шансы на испарение реагента. Как указано в протоколах, образцы должны быть покрыты парафином на всех этапах, чтобы избежать испарения.
В целом, развитие высокого разрешения РНК ISH и другие методы ISH которые позволяет визуализировать низкой изобилии транскриптов, в том числе локализованы на взрослых аксонов в естественных условиях. Это особенно важно, так как в течение многих лет мРНК локализации и перевода на взрослых в аксонов сильно недооцененных, как они были рассмотрены поступательно неактивным.
В заключение приведем роман и прomising технологии для обнаружения Atf4 и потенциально многих других мРНК у взрослых аксонов в мозге млекопитающих. RNAscope будет способствовать будущих исследований по локализации мРНК и поможет разгадать биологическое значение их местного перевод в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
References
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).
