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Immunology and Infection

साइटोकाइन कब्जा प्रणाली का उपयोग करते हुए नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए Cytomegalovirus-विशेष की स्वचालित सेल संवर्धन टी कोशिकाओं

Published: October 5, 2015 doi: 10.3791/52808
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Division of Pediatrics, U.T. MD Anderson Cancer Center, 2Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy, U.T. MD Anderson Cancer Center
* These authors contributed equally

Abstract

रोगज़नक़ विशेष टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण को रोकने और अल्लोजीनिक hematopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद होने वाली इस तरह के संक्रमण (सीएमवी) cytomegalovirus के रूप में अवसरवादी संक्रमण के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। तीसरी पार्टी दाताओं सहित अल्लोजीनिक दाताओं से वायरल विशेष टी कोशिकाओं, चुनिंदा वांछित टी कोशिकाओं का प्रचार करने के प्रतिजन संचालित उत्तेजना के बार-बार चक्कर लगाने को रोजगार, वर्तमान अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (cGMP) के अनुपालन में पूर्व vivo प्रचारित किया जा सकता है। प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की पहचान और अलगाव भी गामा इंटरफेरॉन (IFN-γ) का स्राव सक्रिय कर दिया गया है कि टी कोशिकाओं की साइटोकाइन कब्जा प्रणाली के आधार पर किया जा सकता है। उत्पादन प्रक्रिया में समय लेने वाली है और एक कुशल ऑपरेटर की आवश्यकता है लेकिन, जैसा कि प्रतिरक्षा को बहाल करने में मदद करने के लिए साइटोकाइन कब्जा प्रणाली (सीसीएस) की बड़े पैमाने पर मानव आवेदन सीमित किया गया है। अब इस तरह के CliniMACS प्रतिभा के रूप में एक दूसरी पीढ़ी के सेल संवर्धन डिवाइस के विकासएक स्वचालित, कम श्रम प्रधान प्रणाली का उपयोग वायरल विशेष टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए जांचकर्ताओं को सक्षम बनाता है। इस डिवाइस चुंबकीय नैदानिक ​​ग्रेड के उत्पादों उत्पन्न करने के लिए चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई प्रौद्योगिकी का उपयोग लेबल हटाया कोशिकाओं से कोशिकाओं लेबल अलग करती है, एक बंद व्यवस्था के रूप में इंजीनियर है और benchtop पर पहुँचा और संचालित किया जा सकता है। हम इस नए स्वचालित सेल संवर्धन उपकरण के संचालन एक सीएमवी सेरोपॉज़िटिव दाता से प्राप्त एक स्थिर राज्य apheresis उत्पाद से प्राप्त सीएमवी pp65 विशेष टी कोशिकाओं का निर्माण करने के लिए प्रदर्शित करता है। इन अलग टी कोशिकाओं तो सीधे संस्थागत और संघीय नियामक देखरेख में एक रोगी में संचार किया जा सकता है। लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने सहित सभी जैव संसाधन कदम, टी कोशिकाओं, विशिष्ट प्रतिजन टी कोशिकाओं, शुद्धि, और कपड़े धोने की जुदाई की उत्तेजना को पूरी तरह से स्वचालित रहे हैं। इस जैसे उपकरणों मानव आवेदन के लिए टी कोशिकाओं जीएमपी (समर्पित अच्छा विनिर्माण अभ्यास के बाहर निर्मित किया जा सकता है कि संभावना को बढ़ा) के बजाय सुविधाओं और स्टाफ के कई उत्पादों का उत्पादन करने के लिए स्वचालित प्रोटोकॉल की निगरानी कर सकते हैं जहां रक्त बैंकिंग सुविधाओं में उत्पादन किया जा।

Introduction

Hematopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण (HSCT) 1 भ्रष्टाचार बनाम ट्यूमर प्रभाव में सुधार करने के लिए और अवसरवादी संक्रमण 2 के लिए प्रतिरक्षा प्रदान करने के दत्तक टी सेल थेरेपी के साथ जोड़ा जा सकता है। निषेचन के लिए विशिष्ट प्रतिजन दाता व्युत्पन्न टी कोशिकाओं की पीढ़ी ऐतिहासिक दृष्टि से कुशल कर्मियों और जीएमपी शिकायत कर रहे हैं कि विशेष सुविधाओं के उपयोग की आवश्यकता है। ऐसी टी कोशिकाओं की डिलीवरी अवसरवादी संक्रमण 3 के संकल्प के साथ ही अंतर्निहित द्रोह 4 के इलाज में हुई है। हाल ही में, जांचकर्ताओं का प्रदर्शन किया है कि हजार केवल कुछ वायरस विशेष टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण (~ 1 एक्स 10 4-2.5 x 10 5 कोशिकाओं / किलो प्राप्तकर्ता शरीर के वजन) सफलतापूर्वक अल्लोजीनिक HSCT 5-9 के बाद अवसरवादी सीएमवी संक्रमण का इलाज कर सकते हैं। संबद्ध कुशल विनिर्माण आवश्यकताओं के साथ जीएमपी और सुविधा के लिए सीमित संख्या में और कोशिकाओं के उत्पादन के साथ जुड़े उच्च लागत, हालांकि, Restr हैटी-सेल उपचार 10 का वादा करने के लिए icted रोगी का उपयोग। विशिष्ट प्रतिजन टी कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए एक दृष्टिकोण CD45 और IFN-γ पहचान करने के लिए एक द्वि-विशिष्ट अभिकर्मक का उपयोग सीसीएस पर आधारित है। दिखाया गया है, इस पद्धति एक स्वचालित सेल संवर्धन सीसीएस डिवाइस (चित्रा 1 बी) को रोजगार के नैदानिक ​​ग्रेड सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं सीएमवी सेरोपॉज़िटिव दाताओं से leukapheresis कुल परमाणु कोशिकाओं (टीएनसी) के साथ सीएमवी pp65 प्रतिजन से ओवरलैपिंग पेप्टाइड्स incubating द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) के संदर्भ में प्रदर्शित इन पेप्टाइड्स, IFN-γ स्रावित करने की टीएनसी के भीतर सीएमवी pp65 विशेष टी कोशिकाओं को सक्रिय करें। ये टी कोशिकाओं को फिर "कब्जा" किया है और चुंबकीय अलग कर सकते हैं। पहली पीढ़ी के सेल संवर्धन उपकरण के संचालन (चित्रा 1 ए) कई रों शुरू करने के लिए जीएमपी शर्तों के तहत सेल संस्कृति में कुशल कर्मियों की आवश्यकता है, और कर्मचारियों की समन्वयएक "कब्जा" उत्पाद उत्पन्न करने के लिए आवश्यक TEPS।

प्रक्रिया आम तौर पर लगातार आपरेशन के 12 घंटे के लिए 10 आवश्यक है, और इसलिए कर्मियों की संभावना जीएमपी सुविधा में दो पारियों से अधिक काम करने की जरूरत है। इन बाधाओं को अब (चित्रा 1 बी में दिखाया गया है) एक दूसरी पीढ़ी के उपकरण के कार्यान्वयन के द्वारा नहीं रही हैं। इस डिवाइस को पहली पीढ़ी के उपकरण के समान चुंबकीय संवर्धन, चलाती है, लेकिन एक unbreached दृष्टिकोण में सीसीएस के अन्य पहलुओं को स्वचालित। यह महत्वपूर्ण कदम के सबसे कर्मचारियों द्वारा पहुंच से बाहर पूरा किया जा सकता है के रूप जीएमपी टीम पर बोझ कम कर देता है। इस उपकरण में एक बंद व्यवस्था के रूप में संचालित के बाद से इसके अलावा, विशिष्ट प्रतिजन टी कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया और साधन शुरू करने से पहले leukapheresis अलगाव और माल की तैयारी में शामिल कदम को छोड़कर benchtop पर कार्रवाई की जा सकती। पूरा इंस्ट्रूमेंटेशन और यह दूसरी पीढ़ी के सेल संवर्धन उपकरण की कार्यक्षमता का विवरण पब कर दिया गया है11 lished।

यहाँ, हम स्वचालित सेल संवर्धन सीसीएस प्रणाली का उपयोग कर एक स्थिर राज्य apheresis उत्पाद से सीएमवी pp65 विशेष टी कोशिकाओं को बेहतर बनाने के लिए कई कदम का वर्णन है। एक बार अलग, इन सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं तुरंत एक रोगी में संचार किया जा सकता है।

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Protocol

बाँझ शर्तों के तहत सामग्री के 1. तैयारी (सामग्री और उपकरण तालिका देखें)

  1. 0.5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए मानव सीरम albumin (एचएसए) के साथ पूरक पीबीएस / EDTA के बफर के 3 एल तैयार (w / v)।
  2. नैदानिक ​​ग्रेड 0.9% सोडियम क्लोराइड (NaCl) समाधान के 1 एल बैग और जीएमपी ग्रेड सेल संस्कृति के माध्यम से 2 एल तैयार करें।
  3. बाँझ पानी की 8 मिलीलीटर के साथ सीएमवी pp65 की एक शीशी पुनर्गठन द्वारा सीएमवी विशिष्ट पेप्टाइड प्रतिजन कॉकटेल के 60 nmol तैयार करें।
  4. एक Luer / स्पाइक interconnector का उपयोग कर एक 50 मिलीलीटर मात्रा ठंड बैग में सीएमवी pp65 पेप्टाइड कॉकटेल स्थानांतरण और ट्यूबिंग सेट में कॉकटेल के बाद के वितरण से बचने के लिए संदंश ताला लगा के साथ दबाना। बाँझ शर्तों के तहत ओपन सेल संवर्धन ट्यूबिंग सेट (टीएस 500)।
  5. बाँझ ट्यूबिंग वेल्डर का उपयोग करना, इस समय पेप्टाइड कॉकटेल बैग दबाना मत खोलना ट्यूबिंग सेट के वाल्व 2 टीएस 500 के लिए ट्यूब के संबंध में पेप्टाइड कॉकटेल ठंड बैग कनेक्ट।
  6. हटाये 1 एक्स 10 9 टीशुरू करने सेलुलर उत्पाद से नेकां और 50 मिलीलीटर की कुल मात्रा को 2.5% एचएसए युक्त पीबीएस / EDTA के बफर में निलंबित। एक 150 मिलीलीटर हस्तांतरण बैग में सेलुलर उत्पाद इंजेक्षन।

2. तैयारी और उपयोग ऑटोमेटेड की सेल संवर्धन प्रणाली (सामग्री और उपकरण तालिका देखें)

  1. सेल संवर्धन प्रणाली (चित्रा 1 बी) पर स्विच और कार्यक्रम 'CCS_IFN-γ संवर्धन "का चयन करें। प्रक्रिया के माध्यम से ऑपरेटर मार्गदर्शक निर्देश और चित्रों के साथ स्क्रीन पर दिखने एक यूजर इंटरफेस का निरीक्षण करें।
  2. पैरामीटर "ऑपरेटर" और "ट्यूबिंग सेट पी / एन नहीं" दर्ज करें। इसके बाद, इंटरैक्टिव मॉनीटर स्क्रीन पर प्रदर्शित निर्देशों के अनुसार ट्यूबिंग सेट 500 स्वचालित सेल संवर्धन के लिए इस उपकरण स्थापित करें।
  3. इस उपकरण के लिए मध्यम और buffers कनेक्ट करने के लिए स्क्रीन पर प्रदर्शित कदम से कदम निर्देश का पालन करें। रिकार्ड सूची संख्या और connectin पहले अभिकर्मकों की बहुत संख्यासाधन के लिए जी।
  4. ट्यूबिंग सेट की अंतिम जांच के बाद, पेप्टाइड कॉकटेल बैग की दबाना खुला। मध्यम बैग खोलें और ट्यूबिंग सेट का स्वत: भड़काना आरंभ करें।
  5. भड़काना चरण पूरा होने के बाद, बाँझ ट्यूबिंग वेल्डर की मदद से जलाशय बैग (200 मिलीलीटर) में सोडियम क्लोराइड बफर में एचएसए (2.5%) के पूरक हैं। बाँझ ट्यूबिंग वेल्डर का उपयोग "आवेदन बैग" में शुरू सेलुलर उत्पाद स्थानांतरण।
  6. एडेप्टर के माध्यम से संबंधित ट्यूबिंग में सीसीएस (IFNγ) अभिकर्मकों कनेक्ट करें। संवर्धन प्रक्रिया से पहले सेलुलर सामग्री का एक अंश एकत्र करने के लिए पसंदीदा समय दर्ज करें। समीक्षा और सभी डेटा की सटीकता की पुष्टि / मानकों में प्रवेश किया। प्रक्रिया शुरू करें।
  7. स्वचालित सेल संवर्धन प्रक्रिया की शुरुआत से पहले, गुणवत्ता नियंत्रण थैला (QCB, मूल अंश (मूल) पीबीएस / EDTA बफर के साथ पतला 100 मिलीलीटर चैम्बर सामग्री के बाहर लगभग 1.3 मिलीलीटर) को हटा दें। , QCB सील तौलना, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  8. Enrichme शुरूNT प्रक्रिया। प्रक्रिया के अंत में, लक्ष्य कोशिकाओं जलाशय बैग से क्षालन बफर की एक अनुमानित मात्रा के साथ eluted किया जाएगा।
  9. गैर लक्ष्य सेल थैला (NTCB, नकारात्मक अंश = neg) और लक्ष्य सेल थैला (TCB, सकारात्मक अंश = पीओएस) को सील करने और प्रत्येक बैग का वजन। वजन बाद में सेल नंबर की गणना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  10. इसके तत्काल बाद संवर्धन प्रक्रिया के बाद प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए अंश प्रति दो aliquots जमा है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने के बाकी की दुकान। सेल गिनती दृढ़ संकल्प और संवर्धन के प्रदर्शन के विश्लेषण (1 टेबल) के लिए अन्य नमूना विभाज्य के लिए एक नमूना विभाज्य का प्रयोग करें।
  11. सेल संवर्धन साधन से सेट ट्यूबिंग निकालें। भविष्य में उपयोग के लिए एक यूएसबी ड्राइव करने के लिए लॉग फ़ाइल स्थानांतरण।
    नोट: सभी अभिकर्मकों बाँझ शर्तों के तहत तैयार किया जाना चाहिए। एक जैव सुरक्षा प्रकार द्वितीय हुड का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है। एक स्वस्थ से अलग स्थिर राज्य apheresis सेलुलर उत्पाद (गैर जुटाए) का प्रयोग करेंसीएमवी सेरोपॉज़िटिव दाता सीएमवी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए। केवल एफडीए एचएसए इस्तेमाल किया जाना चाहिए लाइसेंस। सेल तैयार करने के लिए बफर कम पवित्रता और लक्ष्य कोशिकाओं का एक कम उपज में परिणाम होगा कम या अधिक तापमान परिवेश के रूप में 25 डिग्री सेल्सियस के लिए 19 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।

3. कोशिकाओं की संख्या निर्धारण

  1. तालिका 1 में दिखाया गया है। कोशिकाओं की गिनती के लिए QCB, NTCB और TCB की aliquots लो 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में प्रत्येक विभाज्य (अनुमापांक 1:11) के लिए CD45-VoBlue जोड़ें और सेते हैं।
  2. मूल अंश और नकारात्मक अंश, सकारात्मक अंश के लिए 450 μl हौसले से तैयार लाल रक्त सेल समाधान के लिए 1.5 मिलीलीटर हौसले से तैयार लाल रक्त सेल समाधान (1x) जोड़ें, और आरटी पर 15 मिनट के लिए सभी अंशों सेते हैं।
  3. (: 100 माइक्रोग्राम / एमएल के 100 कमजोर पड़ने 1) बस विश्लेषण करने से पहले, एक माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए propidium आयोडाइड जोड़ें। कोशिका गिनती और छठी निर्धारित करने के लिए स्वत: सेल काउंटर का उपयोगक्षमता। प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए सेल काउंटर डिवाइस की सिफारिश की सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। , मूल नकारात्मक और सकारात्मक भागों के लिए ल्यूकोसाइट्स का पूर्ण मायने रखता है का निर्धारण करते हैं।
    नोट: सेल गिनती के विश्लेषण के लिए गए नमूनों की मिलीलीटर प्रति व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स की कोशिकाओं की संख्या सेल विश्लेषक सिफारिश की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है।
  4. चित्रा 2 (क्षेत्र 5, व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स) के रूप में दिखाया क्षेत्र सेट करें। कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित gating रणनीति का प्रयोग करें। मूल अंश में एक व्यवहार्य ल्युकोसैट चित्रा 2 में दिखाया गया है।
  5. इस प्रकार के रूप में संकेत क्षेत्रों (चित्रा 2, 1-6) पदानुक्रम हैं:
    1: समय गेट → 2: एकल कक्षों → 3: CD45 + कोशिकाओं → 4: leukocytes (मलबे को बाहर रखा गया है) 5 →: व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स → 6: व्यवहार्य लिम्फोसाइट
  6. नकारात्मक और सकारात्मक भागों के लिए कोशिकाओं की गिनती निर्धारित करने के लिए एक ही कदम दोहराएँ। पूरे अंश की कोशिकाओं की संख्या की गणनानमूना और अंश (तालिका 2) की कुल मात्रा का मंदक कारक पर विचार करके।

पृथक्करण प्रदर्शन 4. परीक्षा

  1. पूर्व ठंडा पीबीएस / EDTA बफर / 0.5% एबी सीरम के साथ QCB, NTCB और TCB अंश कोशिकाओं की aliquots धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
  2. जिसमें 100 μl एंटीबॉडी fluorochrome धुंधला मिश्रण में Resuspend कोशिकाओं: CD3-FITC, सीडी 4-एपीसी, सीडी 8-एपीसी-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue और विरोधी IFNγ-पीई (अनुमापांक 1:11) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं।
  3. 1 मिलीलीटर हौसले से तैयार लाल रक्त सेल समाधान (1x) जोड़ें और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। पीबीएस / EDTA बफर / 0.5% अटल बिहारी सीरम की पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं Resuspend।
  4. 100 diluti: 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर सिर्फ विश्लेषण करने से पहले (1 के अंतिम एकाग्रता के लिए propidium आयोडाइड जोड़ें) 100 माइक्रोग्राम / एमएल के पर। नमूना की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन करना।
  5. सीसीएस संवर्धन प्रक्रिया के बाद सकारात्मक अंश में दिखाया गया है CD3 + टी कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए व्यवहार्य ल्युकोसैट gating रणनीति में CD3 + टी कोशिकाओं की गणना करने के लिए निम्नलिखित gating रणनीति का प्रयोग करें। इस प्रकार के रूप में संकेत क्षेत्रों (चित्रा 3 ए और 3 बी, 1-6) पदानुक्रम जुड़े हुए हैं:
    1: समय गेट → 2: एकल कक्षों → 3: CD45 + कोशिकाओं → 4: कोशिकाओं (मलबे को बाहर रखा गया है) 5 →: व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स → 6: व्यवहार्य CD3 + कोशिकाओं जनसंख्या
  6. सीडी 4+, सीडी 8 +, सीडी 4 + IFN-γ + और ​​सीडी 8 + IFN-γ + सीसीएस संवर्धन प्रक्रिया के बाद टी कोशिकाओं (तालिका 2) की आवृत्तियों का निर्धारण करते हैं।
  7. एफ नीचे दिखाया गया सीडी 4+, सीडी 8 +, सीडी 4 + IFN-γ + और ​​सीडी 8 + IFN-γ + टी कोशिकाओं की आवृत्तियों का निर्धारण करने के लिए gating रणनीति का प्रयोग करेंया सीसीएस की प्रक्रिया के बाद एक मूल और समृद्ध (कब्जा) सकारात्मक अंश। इस प्रकार के संकेत के रूप में क्षेत्रों के पदानुक्रम जुड़ा हुआ है और नाम हैं:
    1: समय गेट → 2: एकल कक्षों → 3: CD45 + कोशिकाओं → 4: कोशिकाओं (मलबे को बाहर रखा गया है) 5 →: व्यवहार्य Leukocytes → 6: व्यवहार्य CD3 + कोशिकाओं → 7: सीडी 4 + कोशिकाओं → 7a: सीडी 4 + IFN-γ + कोशिकाओं (बॉक्स) → 8: सीडी 8 + कोशिकाओं → 8A: सीडी 8 + IFN-γ + कोशिकाओं (बॉक्स)

नोट: पदानुक्रम लिंक के पहले 6 बताए क्षेत्रों, (1-6) चित्रा 3 के रूप में वही कर रहे हैं और 2 क्षेत्रों पिछले चित्रा 4 (6-8a) में दिखाया गया है।

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Representative Results

इस अध्ययन में, एक स्वचालित सेल संवर्धन सीसीएस प्रणाली सीएमवी pp65 विशेष टी कोशिकाओं की स्वचालित उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया था। सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं तीन apheresis सेल के उत्पादों से समृद्ध थे। स्थिर राज्य apheresis उत्पाद 10 कुल 10 परमाणु कोशिकाओं (टीएनसी) एक सीएमवी सेरोपॉज़िटिव दाता से 2 घंटा से अधिक काटा और उत्पन्न किया गया था। 10 9 टीएनसी तो सीएमवी pp65 व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (60 nmol) 4 घंटा और टी कोशिकाओं स्वचालित सेल संवर्धन उपकरण पर सीसीएस का उपयोग कर अलग थे स्रावित IFN-γ के लिए के साथ सक्रिय थे। एक ऑपरेटर सभी अभिकर्मकों और ट्यूबिंग सेट लोड करने के लिए प्रयोग की शुरुआत में की जरूरत थी। डिवाइस शुरू करने के लिए unpacking प्रारंभिक से प्रणाली की स्थापना 120 मिनट के लिए लगभग 60 ले लिया। मशीन तो अभिकर्मकों और ट्यूबिंग सेट (जैसे कि रात भर के रूप में) पहुंच के बाहर संचालित करने के लिए मशीन को सक्रिय करने के जिससे लोड कर रहे हैं के बाद शुरू करने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है, ध्यान दें। ऑपरेटर के लक्षण वर्णन प्रदर्शन करने के लिए 15 घंटे के बाद फिर से जरूरत थीसेल शुद्धता और व्यवहार्यता के लिए अंतिम उत्पाद। संवर्धन के बाद सेल सतह पर तैरनेवाला माइकोप्लाज्मा और अन्तर्जीवविष उपस्थिति के लिए जांच की गई थी। सत्यापन के बाद, संसाधित कोशिकाओं रोगियों में सीधे संचार किया जा सकता है या बाद में अनुप्रयोगों के लिए cryopreserved।

सेल मायने रखता 2 टेबल में दिए गए फार्मूले का उपयोग कर मानक प्रथाओं की गिनती के बाद सेल निर्धारित किया गया है। कोशिका गिनती के प्रत्येक प्रकार तीन बार दोहराया गया था और परिणाम मानक विचलन (एसडी) के साथ के रूप में मतलब कुल कोशिकाओं की गिनती व्यक्त किया गया। रिपोर्ट तो सेल विश्लेषक सिफारिश की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स और लिम्फोसाइट निर्धारित करने के लिए gating चित्रा 2 में दिखाया गया है। कोशिकाओं की गिनती के लिए डेटा तालिका 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं। चित्रा 3 और 4 चित्र में दिखाया गया है IFN-γ + टी कोशिकाओं का निर्धारण किया जाता gating रणनीति। संवर्धन करने से पहले, कक्षों की व्यवहार्यता> 95% नियमित तौर पर किया गया था। Enrichmen के बादटी कोशिकाओं की व्यवहार्यता 50% <था। IFN-γ + टी कोशिकाओं की पूर्ण गिनती से पहले और संवर्धन प्रक्रिया के बाद मूल्यांकन किया गया था। संवर्धन से पहले IFN-γ + टी कोशिकाओं की कुल संख्या टीएनसी शुरू होने वाले 10 9 से व्युत्पन्न के रूप में 1.14 x 10 6 ± 0.35 x 10 6 था, और संवर्धन के बाद 3.09 x 10 5 ± 1.70 x 10 5 IFN-γ + टी कोशिकाओं था। वहाँ 0.16 ± 0.18% IFN-γ + से पहले प्रसंस्करण के लिए वर्तमान सीडी 4+ टी कोशिकाओं थे और इस संवर्धन के बाद 47.5 ± 34.7% की वृद्धि हुई। सीडी 8 + IFN-γ + कब्जा करने से पहले टी कोशिकाओं की पवित्रता प्रतिशत 0.47 ± 0.1% थी, और संवर्धन के बाद 90.3 ± 1.7% की वृद्धि हुई (तालिका 3 और 4)। पर कब्जा कर लिया (सकारात्मक) अंश में नमूना वसूली स्टेशन में IFN-γ + टी कोशिकाओं की माप के आधार पर सीडी 4+ टी कोशिकाओं के लिए 32.9 ± 15.7% और CD8 + टी कोशिकाओं के लिए 31.8 ± 13.2% थी rting आबादी (तालिका 4)। इन आंकड़ों सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + सीएमवी दोनों pp65 विशेष टी कोशिकाओं को उनके मानव आवेदन के लिए उपयुक्त में एक तरह से स्वचालित रूप से काटा जा सकता है कि संकेत मिलता है।

चित्र 1
सीसीएस प्रणाली का उपयोग कर सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं की चित्रा 1. संवर्धन। (ए) कुशल पेशेवरों द्वारा नियंत्रित किया जाता है पहली पीढ़ी सेल संवर्धन डिवाइस में शामिल एकाधिक प्रसंस्करण कदम। (बी) के प्रसंस्करण कदम से अधिकांश, प्रारंभिक ट्यूबिंग सेटअप को छोड़कर, स्वचालित रहे हैं पहली पीढ़ी के उपकरण के साथ तुलना में ऑपरेटर हैंडलिंग समय के 12 घंटे - 10 बचाता है, जो दूसरी पीढ़ी सेल संवर्धन उपकरण में। समृद्ध सीएमवी वायरस विशेष टी कोशिकाओं सेल विश्लेषक प्रवाह cytometry की विशेषता है। > यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. gating रणनीति 1 से 6 नंबर। व्यवहार्य टी कोशिकाओं का निर्धारण किया जाता आंकड़ा में इसी gating के पदानुक्रम डोमेन संकेत मिलता है। (1) (2) एफएससी-क्षेत्र के खिलाफ एफएससी-ऊंचाई साजिश रचने के द्वारा नक़ल कोशिकाओं को हटाने, समय गेट की स्थापना (3) (4) (5) व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स का चयन और (6) propidium आयोडाइड धुंधला द्वारा मूल आबादी से व्यवहार्य लिम्फोसाइटों। सेल मलबे को हटाने, CD45 + कोशिकाओं की पहचान यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा CD3 + टी कोशिकाओं का निर्धारण किया जाता 3. gating रणनीति। के विश्लेषण के दाग प्रवाह cytometry (3) पहले और (3 बी) सेल संवर्धन यहाँ दिखाया गया है के बाद CD3 + टी कोशिकाओं। यह पहले और संवर्धन प्रक्रिया के बाद नमूनों में मौजूद हैं कितने सीएमवी विशिष्ट पेप्टाइड सक्रिय टी कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस आंकड़े में, संख्या 6 के माध्यम से 1 इसी सेल की आबादी या तो आकार से या एक विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा दाग संकेत मिलता है। (1), (3) CD45 + कोशिकाओं का चयन, (2) नक़ल कोशिकाओं को हटाने, समय-गेट की स्थापना (4) (5) व्यवहार्य ल्यूकोसाइट्स का चयन और (6) व्यवहार्य CD3 + लिम्फोसाइट सेल मलबे को हटाने। Propidium आयोडाइड धुंधला मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए प्रदर्शन किया था।/52808fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. gating रणनीति IFN-γ + टी कोशिकाओं की शुद्धता निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सक्रिय सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं को नियंत्रित करने, सीएमवी संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हैं IFN-γ + इसलिए टी कोशिकाओं पर अभिव्यक्ति gating के लिए इस्तेमाल किया गया। संवर्धन के बाद संवर्धन और (बी) के पहले सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + सबसेट (ए) के बीच IFN-γ + टी कोशिकाओं। (7/8) सीडी 4+ टी कोशिकाओं और CD8 + टी कोशिकाओं का प्रतिशत ए और बी में दिखाया गया है। (7a ) सीडी 4 + IFN-γ + टी कोशिकाओं का प्रतिशत सी के लिए इसी तरह gating के क्षेत्र के भीतर वर्ग बॉक्स (एक) में दिखाया गया है और D8 + IFN-γ + में टी कोशिकाओं (8A)। "टी" gated आबादी में कोशिकाओं की% का प्रतिनिधित्व कुल जनसंख्या और "#" में कोशिकाओं की% का प्रतिनिधित्व करता है। Propidium आयोडाइड धुंधला गेट के बाहर मृत कोशिकाओं को प्रदर्शन किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
सेल धुंधला रणनीति के लिए इस्तेमाल किया अंशों की तालिका 1 संस्करणों।

सारणी 2
सीडी 8 + IFN-γ + टी कोशिकाओं के संवर्धन की प्रक्रिया। गणना के बाद सीडी 4 + IFN-γ + टी कोशिकाओं की गणना के लिए इस्तेमाल तालिका 2 सूत्र इसी तरह किया जाता है।

ove_content "के लिए: रख-together.within-पेज =" हमेशा "> टेबल तीन
इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पहले और बाद में संवर्धन। 1 परिणाम यहां दिखाए गए हैं नमूना # टी सेल सबसेट में तालिका 3. कुल सेल मायने रखता है।

तालिका 4
तालिका 4. पवित्रता और पहले और नमूना # 1 के संवर्धन की प्रक्रिया के बाद IFN-γ + टी सेल की वसूली।

तालिका 5
नैदानिक ​​ग्रेड सीएमवी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के अलगाव में इस्तेमाल किया रणनीति छँटाई टेबल 5. सेल। 5

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Discussion

दत्तक टी सेल थेरेपी बी सेल दुर्दमताओं 4 के इलाज के लिए एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में उभरा है। इसके चिकित्सीय क्षमता replicative वार्धक्य 2 की कमी है कि लक्ष्य प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की वांछित संख्या infusing पर निर्भर है। यह वर्तमान अच्छा विनिर्माण प्रथाओं के अनुपालन में विस्तार टी कोशिकाओं से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी बाहर छँटाई द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। दो छँटाई प्रक्रियाओं को व्यापक रूप से अर्थात्, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS), इस्तेमाल कर रहे हैं और हम हाल ही में 5 की समीक्षा की है के रूप में चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) सीएमवी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए। दूसरे के ऊपर एक रणनीति का उपयोग करने का लाभ यह है कि 5 तालिका में उल्लिखित है। एमएसीएस प्रौद्योगिकी FACS प्रौद्योगिकी की तुलना में एक सस्ता और तेजी से रास्ते में उच्चतम सेल संवर्धन पवित्रता प्रदान करता है। सेल संवर्धन के लिए डिस्पोजेबल कॉलम और अभिकर्मकों के अलावा उपयोग में पूरी तरह से इसे बनाने नमूना संदूषण के लिए नमूना रोकताआसान नैदानिक ​​सेटिंग में लागू करने के लिए। अर्द्ध स्वचालित सेल संवर्धन डिवाइस श्रम गहन और समय नैदानिक ​​मांग को पूरा करने के लिए जरूरी हो गया था स्वचालित सेल संवर्धन डिवाइस का इतना विकास लेने वाली है।

स्वचालित सेल संवर्धन सीसीएस डिवाइस ऐसे दत्तक हस्तांतरण के लिए hematopoietic स्टेम कोशिकाओं, दैहिक स्टेम सेल, साथ ही टी कोशिकाओं के रूप में नैदानिक ​​ग्रेड कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक बहुमुखी साधन है। यह स्वचालित डिवाइस एक एकल उपयोग जीएमपी के अनुरूप डिस्पोजेबल इकाई में शुरू सामग्री, सेल धोने, सेल जुदाई, सेल संस्कृति, और अंतिम उत्पाद के गठन के विभाजन सहित सेल प्रसंस्करण को एकीकृत। बंद व्यवस्था को साफ-रूम की आवश्यकताओं को कम कर देता है और जीएमपी सुविधाओं को बनाए रखने के लिए ऑपरेटर की भागीदारी कम करता है। स्वचालन जिससे इन प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के साथ जुड़े लागत को कम उपस्थित होने के लिए एक ऑपरेटर के लिए आवश्यक समय को कम करता है।

तुलना में, स्वचालित सेल संवर्धन डिवाइस मान्य करने के लिएअर्द्ध स्वचालित सेल संवर्धन उपकरण के साथ, हम एक apheresis उत्पाद के साथ सीएमवी pp65 व्युत्पन्न पेप्टाइड्स incubating के बाद सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं को अलग किया। जीएमपी ग्रेड सीएमवी pp65 व्युत्पन्न पेप्टाइड कॉकटेल (जैसे PepTivator) मानव cytomegalovirus की pp65 प्रोटीन की पूरी अनुक्रम को कवर, मुख्य रूप से ओवरलैप 11 एमिनो एसिड के साथ 15 मेर-पेप्टाइड्स के होते हैं कि एक पेप्टाइड पूल है। नमूना वसूली उपज 10 9 टीएनसी से ~ 0.3 x 10 6 CD3 + IFN-γ + टी कोशिकाओं था। नैदानिक ​​अध्ययन HSCT के दौर से गुजर (~ 360 से 4,000 कोशिकाओं / किग्रा शरीर के वजन) के रोगियों के लिए रोगनिरोधी उपचार के रूप में कुछ हजार सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं infusing सीएमवी के खिलाफ सुरक्षा में हुई है कि प्रदर्शन किया है। 3.0 x 10 5 और 1 एक्स 10 4 - - 1.2 x 10 5 कोशिकाओं, क्रमश: viral- के उदाहरण के लिए, इस तकनीक, एक 70 किलो वयस्क और एक 30 किलो बच्चे का उपयोग कर क्लिनिकल परीक्षण में सीएमवी के उपचार के लिए जाहिरा तौर पर केवल 0.26 की आवश्यकता होती है विशेष टी कोशिकाओं 12-15 एट अल। 13 के रूप में दिखाया सामान्य में, मृत / जीवित कोशिकाओं की संख्या, अर्द्ध स्वचालित सेल संवर्धन उपकरण के लिए तुलनीय है। यह अलग सुई लेनी के लिए पर्याप्त सामग्री के साथ संबद्ध किया जाएगा के रूप में व्यवहार्य कोशिकाओं के एक उच्च संख्या भी स्वीकार्य होगा। हालांकि, सामान्य रूप में और अधिक व्यावहारिक कोशिकाओं को भी टी कोशिकाओं (बी, एन.के., आदि) के अलावा अन्य अधिक कोशिकाओं का मतलब है। हमारे डेटा स्वचालित सेल संवर्धन प्रणाली पर उत्पन्न सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं तो अल्लोजीनिक HSCT के बाद संचार किया जा सकता है कि सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं की चिकित्सकीय अपील संख्या में हुई है कि प्रदर्शित करता है।

HSCT वृद्धि की रुग्णता और मृत्यु दर दोनों में जिसके परिणामस्वरूप के बाद सीएमवी संक्रमण एक बड़ी समस्या हो सकती है। इसके अलावा, सीएमवी संक्रमण विरोधी वायरल दवाओं 16 के साथ शीघ्र निदान और जल्दी इलाज में हाल ही में प्रगति के बावजूद, बढ़ी हुई लागत के साथ जुड़ा हुआ है। ganciclovir और foscarnet का उपयोग वर्तमान उपचार HSCT की चिकित्सकीय नाजुक प्राप्तकर्ताओं में विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।दाता व्युत्पन्न सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं की जोड़-पीठ को रोकने और अल्लोजीनिक HSCT 9 के प्राप्तकर्ताओं में अवसरवादी संक्रमण के इलाज के लिए प्रदर्शन किया गया है। दत्तक इम्यूनोथेरेपी के लिए यह दृष्टिकोण भी (संबंधित प्रतिजन निकाली गई नैदानिक ​​ग्रेड पेप्टाइड कॉकटेल अभिकर्मकों के साथ मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) incubating द्वारा इस तरह के एपस्टीन बर्र वायरस (EBV), एडीनोवायरस 8, और Aspergillus 3 के रूप में अन्य रोगाणुओं को उन्मुक्ति बहाल करने में मदद करने के लिए लागू किया गया है सामग्री और उपकरणों की तालिका)। हाल ही में, जांचकर्ताओं को सुरक्षित रूप से immunodominant पेप्टाइड 17 पेश प्राप्तकर्ता में कम से कम एक एचएलए एलील के साथ मिलान कर रहे हैं कि तीसरे पक्ष के रोगज़नक़ विशेष टी कोशिकाओं संचार किया है। स्वचालित सेल संवर्धन सीसीएस प्रणाली को भी दाता ऐसे अल्लोजीनिक गर्भनाल रक्त transplantati के लिए दानदाताओं के साथ मामले के रूप में सीएमवी सेरोनिगेटिव या अनुपलब्ध है, जब उपयोगी हो जाएगा कि मुस्तैद अनुप्रयोगों के लिए तीसरे पक्ष के टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपर।

सारांश में, हम सीसीएस के स्वचालन के आधार पर सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक स्वचालित सेल संवर्धन डिवाइस की उपयोगिता का प्रदर्शन। हम इस डिवाइस नैदानिक ​​टीमों immunocompromised रोगियों में ट्यूमर विशिष्ट, टी कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, रोगज़नक़ विशिष्ट तर करने के लिए सीमा कम करने की क्षमता है विश्वास करते हैं।

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Disclosures

एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर और डॉ कूपर दोनों ZIOPHARM कैंसर विज्ञान, इंक, और Intrexon निगम में एक वित्तीय हित है। 7 मई 2015 को डॉ कूपर ZIOPHARM कैंसर विज्ञान में मुख्य कार्यकारी अधिकारी के रूप में नियुक्त किया गया था। डॉ कूपर अब एमडी एंडरसन में विजिटिंग साइंटिस्ट है। डॉ कूपर की स्थापना की और उन्होंने कहा कि कृत्रिम न्युक्लिअसिज़ साथ Sangamo बायोसाइंसेज के साथ पेटेंट है InCellerate इंक का मालिक है। उन्होंने कहा कि Targazyme, इंक (पूर्व अमेरिकी स्टेम कोशिकाओं, Inc), जीई हेल्थकेयर, फेरिंग फार्मास्यूटिकल्स, किस्मत चिकित्सा, जानसन फार्मास्यूटिकल्स, और ब्रिस्टल मायर्स Squibb- के साथ सलाह। उन्होंने कहा कि Cellectis के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड पर है। उन्होंने कहा कि Miltenyi बायोटेक से मानदेय प्राप्त करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag Miltenyi Biotec GmbH 700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 Miltenyi Biotec GmbH 130-097-182
5 L waste bag Miltenyi Biotec GmbH 110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) Miltenyi Biotec GmbH 279-01
Albumin (Human) 25%  Grifols 58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector Miltenyi Biotec GmbH 130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L) Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65 Miltenyi Biotec GmbH 170-076-109
Water for injections Hospira, inc, Lake Forest, IL NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm  Millipore SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag Miltenyi Biotec GmbH 170-076-306
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) Miltenyi Biotec GmbH 130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec GmbH 200-074-400
60 ml Syringes, sterile BD, Laagstraat, Temse, Belgium 309653
CMV sero positive apheresis product Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials Manufacturer Catalog number
AB Serum, GemCell Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA 100-512
CD3-FITC Miltenyi Biotec GmbH 130-080-401
CD4-APC Miltenyi Biotec GmbH 130-098-033
CD8-APC-Vio770 Miltenyi Biotec GmbH 130-098-065
CD14-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-072
CD20-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-077
CD45-VioBlue Miltenyi Biotec GmbH 130-098-136
aIFN-γ-PE, human Miltenyi Biotec GmbH 130-097-940
CD3-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) Miltenyi Biotec GmbH 130-093-233
Equipment Manufacturer Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device  Miltenyi Biotec GmbH 200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec GmbH 130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R  Eppendorf AG 22331
Cellometer K2 Nexelom Bioscience, Lawrence, MA LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB Terumo Medical Corp., Elkton, MA 7811

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References

  1. Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
  2. Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
  3. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  4. Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
  5. Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
  6. Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
  7. Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
  8. Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
  9. Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
  10. Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
  11. Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
  12. Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  13. Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
  14. Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
  15. Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
  16. Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
  17. Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).

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इम्यूनोलॉजी अंक 104 साइटोकाइन कब्जा प्रणाली (सीसीएस) सीएमवी विशेष टी कोशिकाओं pp65 टी कोशिकाओं विरोधी वायरल प्रतिरक्षा चिकित्सा bioprocessing स्वचालित सेल संवर्धन उपकरण स्रावित IFN गामा चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई प्रौद्योगिकी
साइटोकाइन कब्जा प्रणाली का उपयोग करते हुए नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए Cytomegalovirus-विशेष की स्वचालित सेल संवर्धन टी कोशिकाओं
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Kumaresan, P., Figliola, M., Moyes,… More

Kumaresan, P., Figliola, M., Moyes, J. S., Huls, M. H., Tewari, P., Shpall, E. J., Champlin, R., Cooper, L. J. N. Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System. J. Vis. Exp. (104), e52808, doi:10.3791/52808 (2015).

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