Summary
Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.
Abstract
Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit volwassen huid fibroblasten en de daaropvolgende differentiatie in somatische cellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties dat histocompatibiliteit barrières te omzeilen. Echter, doorlopen van een pluripotente toestand en daaropvolgende volledige differentiatie in gewenste lineages blijft een wegversperring van de klinische toepassing van iPSC technologie vanwege de geassocieerde neoplastisch potentieel en genomische instabiliteit. Onlangs hebben wij en anderen aangetoond dat somatische cellen niet alleen worden omgezet in iPSCs maar ook in verschillende soorten multipotente somatische stamcellen met gedefinieerde factoren, waardoor progressie omzeilen door de pluripotente toestand. Met name de directe omzetting van humane fibroblasten in veroorzaakte neurale stamcellen (iNPCs) kondigt de mogelijkheid van een nieuw autologe cel bron voor diverse toepassingen zoals mobiele vervanging, ziektemodelen drug discovery. We beschrijven hier de isolatie van volwassen humane primaire fibroblasten uit biopsie huid en het efficiënte directe omzetting in iNPCs door tijdige beperkte expressie van Oct4, Sox2, Klf4, alsmede c-Myc. Sox2-positieve neuro-kolonies verschijnen na 17 dagen van inductie en INPC lijnen efficiënt kunnen worden vastgesteld door monoklonale isolatie en expansie. Nauwkeurige aanpassing van virale multipliciteit van infectie en aanvulling van leukemie remmende factor tijdens de inductiefase vertegenwoordigen kritische factoren conversie rendementen tot 0,2% te bereiken. Tot nu toe kon patiëntspecifieke INPC lijnen te breiden tot meer dan 12 passages en uniform tonen morfologische en moleculaire kenmerken van neurale stam / progenitorcellen, zoals de expressie van Nestin en Sox2. De INPC lijnen kunnen worden gedifferentieerd tot neuronen en astrocyten, zoals beoordeeld door kleuring tegen TUJ1 en GFAP, respectievelijk. Tot slot melden we een robuust protocol voor de afleiding en direct omzetting van de menselijke fibroblasten in stabiel uitbreidbaar neurale stamcellen die een mobiele bron voor biomedische toepassingen zou kunnen bieden zoals autologe neurale cel vervangen en de ziekte modelleren.
Introduction
In 2006 Yamanaka en collega's voor het eerst konden aantonen de mogelijkheid van herprogrammering van somatische cellen in een pluripotente toestand 1. Deze dedifferentiatie werd bereikt door overexpressie van vier transcriptiefactoren Oct4, Sox2, Klf4, en c-Myc in murine fibroblasten. Het gegenereerde zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vertonen functionele equivalentie embryonale stamcellen (SER) en kan dus worden onderscheiden in alle celtypes van het volwassen organisme. Een jaar later herprogrammering iPSCs kan ook worden bereikt voor humane fibroblasten 2. Experimenten in diermodellen aangetoond dat iPSC-afgeleide cellen kunnen in het algemeen worden gebruikt voor celvervangingstherapie, bijvoorbeeld in Parkinson's Disease (PD) 3-5. Echter verscheidene beperkingen van het gebruik van iPSCs vormen obstakels voor de volledige hun therapeutisch potentieel. Allereerst herprogrammering van cellen in een pluripotente toestand en daaropvolgendekwaliteitscontrole is over het algemeen een tijdrovend en inefficiënt proces waardoor in uitgebreide en dus dure procedures celcultuur. Ten tweede moeten iPSCs opnieuw worden gedifferentieerd in de gewenste celtype van belang voor biomedische toepassing en de kans op resterende pluripotente cellen in gedifferentieerde latie aanzienlijke tumorigene potentieel en vertoont dus een hoog risico na celtransplantatie 6. Ten derde, wordt het herprogrammeringsproces gewoonlijk bereikt door het induceren van de herprogrammering factoren door lenti- of retrovirale infectie. De integratie van deze virussen in het gastheergenoom kan leiden tot mutagenese en / of ongecontroleerde heractivering van de transgenen 7,8. Non-integratieve systemen zijn ontwikkeld om de herprogrammering factoren leveren aan doelcellen, waardoor het risico van insertie mutagenese en transgene reactivering minimaliseren. Voorbeelden van deze transgen vrije benaderingen herprogrammering van cellen met niet-integrerendeAdeno of Sendai virus 9,10, DNA-gebaseerde vectoren 11 en de toepassing van DNA-vrije werkwijzen zoals transfectie van synthetisch mRNA 12 of transductie van recombinante eiwitten 13,14. Een andere veelbelovende methode voor het afleiden van transgene vrije iPSC het gebruik van loxP gemodificeerde lentivirale herprogrammering constructen en daaropvolgende verwijdering van transgenen met het Cre-loxP DNA recombinatiesysteem 15,16.
Een eenvoudiger benadering van neurale cellen te genereren voor celvervangingstherapie vertegenwoordigt directe omzetting van fibroblasten in post-mitotische neuronen 17-20. Vierbuchen et al. Gerapporteerd dat de overexpressie van transcriptiefactoren Ascl1, Brn2 en Myt1l resulteert in het genereren van 20% neuronen tegen murine fibroblasten 17. In 2011 werd aangetoond, dat dezelfde drie transcriptiefactoren in combinatie met overexpressie van NeuroD1 mogelijk transdifferentiatie van humane fibroblasten in neuRons 19. Human geïnduceerde neuronen kunnen ook worden gegenereerd door overexpressie van Ascl1 en Ngn2 onder dual SMAD- en GSK3β- remming 20. Met name directe omzetting van fibroblasten in neuronen genereert een non-proliferatie, post-mitotische cel populatie die verdere uitbreiding en biobanking niet toestaat.
Onlangs heeft de directe omzetting van fibroblasten in een prolifererende neurale stamcellen / voorlopercellen cel populatie werd gerapporteerd 21-26. Duidelijkheidshalve zullen al deze celtypen worden genoemd geïnduceerd neurale stamcellen (iNPCs) in dit rapport. Han et al. Overexpressie Brn4, Sox2, c-Myc en Klf4 iNPCs te genereren. Net als hun tegenhangers neurale stamcellen afgeleid van zowel primaire weefsel of pluripotente cellen deze iNPCs zijn tripotential en kon worden onderscheiden in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten 21. Onze groep rapporteerde een iets andere conversie protocol waarbij overexpressie van Sox2, Klf4En c-Myc en geïnduceerde Oct4 expressie slechts 5 dagen. Met deze aanpak kunnen we stabiel uitdijende iNPCs van muizen embryonale en volwassen fibroblasten dat volledige silencing vertonen van de herprogrammering factoren 22 genereren. In tegenstelling tot iPSCs, hoeft iNPCs geen tumorigeen potentieel vertonen na transplantatie 27. We gebruikten geconverteerde cellen in een diermodel van demyelinisatie, myeline deficiënte ratten, aangetoond dat iNPCs klinisch bruikbaar 22. Tot die tijd, kon NPCs alleen worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen of primaire zenuwweefsel 28-32. iNPCs zijn stabiel expandeerbare cellen die kunnen worden gecryoconserveerd en kunnen differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Veel inspanningen werden geleverd om de directe omzetting protocol uit muizen passen aan menselijke cellen 23,26,33,34. In 2012 werd gepubliceerd dat overexpressie van de enkele factor Sox2 in fibroblasten is voldoende om muizen en menselijke iNPCs genereren
Verschillende studies tonen de mobiele functionaliteit van NSC of hun gedifferentieerde tegenhangers in verschillende dierziekten modellen. Neurale voorlopercellen uit menselijke pluripotente stamcellen werden getransplanteerd in muismodellen van de neuro-inflammatoire aandoening multiple sclerose 35,36. De toepasselijkheid van hESC-afgeleide neurale stamcellen in EAE (experimentele auto-immune encephalomyelitis) -mice werd voor het eerst getoond in 2008 35. Multipotente neurale voorloper cellen werden geïnjecteerd in de ventrikels van de hersenen van muizen, en de transplantatie resultaated in de vermindering van de klinische symptomen van EAE. Kim et al. Gegenereerd oligodendrogliale voorlopers van hESCs en getransplanteerd die intracerebroventriculair in EAE-muizen. Hoewel transplantatie overleefden niet langer dan 10 dagen, muizen vertoonden significante verbetering van neurologische functie en vermindering van proinflammatoire immuuncellen in de witte stof 36. Stamcel therapie is ook toegepast voor preklinische richten van de ziekte van Parkinson als NPC succes kan worden toegepast bij de respectieve diermodellen. Hiervoor werden progenitorcellen hetzij verkregen uit foetaal hersenweefsel 37 opzichte van pluripotente stamcellen 38-40 of mesenchymale 41 stamcellen werden gebruikt. In 2012 toonden we aan dat muis iNPCs kunnen proteolipide eiwit, het belangrijkste myeline eiwitcomponent na transplantatie produceren in de hersenen van myeline-deficiënte (md) 22 ratten. Door dat proof-of-principle experiment de therapeutische applicabilheid van iNPCs werd eerst bewezen en al snel bevestigd door een andere studie 32. Echter, het volledige potentieel van therapeutische gebruik van menselijke iNPCs moet nog worden onderzocht.
Hier tonen we een robuuste en geïntegreerde werkwijze (i) winning van menselijke primaire cellen uit volwassen patiënten via huidbiopsie, (ii) rechtstreekse omzetting van humane fibroblasten in een neurale staat en (iii) het vermogen van iNPCs worden gedifferentieerd tot neuronale en gliale lijnen. Het gebruik van dit protocol zal helpen bij het versnellen generatie van autologe menselijke cellen voor therapeutische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De menselijke fibroblasten die in deze studie werden verkregen uit een huid punch biopsie na het krijgen van informed consent en ethische goedkeuring door de ethische commissie van de Universiteit van Würzburg, Duitsland (ethische verslag nr: 96/11 dd 10.06.2011).
1. Punch biopsie
- Ontsmet de huid van de patiënt. Verdoven huid waarvan een deel biopsie zal worden genomen van (bij voorkeur een minder zon blootgestelde gebied) met 0,5 tot 1 ml mepivacaine hydrochloride intracutaan en voor te bereiden de huid biopsie met een steriele 3mm biopsie punch, spoel biopsie met DPBS + 1 pl / 1ml Gentamicine en verwijder vet. Spoel biopsie tweemaal met DPBS + gentamicine aspireren DPBS volledig en deksel biopsie met Dispase II (2,4 U / ml) en incubeer 16-18 uur bij 4 ° C.
- Zuig Dispase volledig, wassen tweemaal met DPBS en epidermis te verwijderen met een pincet. Was biopsie tweemaal met DPBS, voeg 2 ml Collagenase Type 2 (500 U / ml CDU), de overdracht in 15 ml buis en voeg COLLAGENAse tot 5 ml totaal volume. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Centrifuge 5 min bij 180 xg en gooi supernatant daarna. Resuspendeer pellet in 10 ml DMEM-FCS-gentamicine-medium (10% FCS, 1 ul / ml gentamicine) en centrifugeer opnieuw gedurende 5 minuten bij 180 x g. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1,5 ml DMEM-FCS-Gentamicine-media. Transfer naar hechtende weefselkweek kolf T25 en incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Wijzig de media om de 3 dagen.
- Na ongeveer 2 weken, wanneer de cellen confluent rond huiddelen, split cellen via trypsine / EDTA (0,05%) was cellen eenmaal met DPBS, incubeer 5 min bij 37 ° C, 5% CO 2 na toevoeging van 2 ml trypsine / EDTA (0,05%), voeg 2 ml DMEM-FCS-gentamicine-media, overbrengen naar 15 ml buis en centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 minuten; gooi supernatant en resuspendeer pellet in de juiste hoeveelheid DMEM-FCS-Gentamicine-media.
- Verdere uitbreiding van de cellen door het veranderen van het medium elke 3 rd dag en splitsen, zoals hierboven wanneer cellen zijn confluent beschreven; toevoeging van gentamicine kan na passage 2 gestopt.
- Voordat u de cellen voor de directe omzetting experimenten, zorg ervoor om mycoplasma besmetting uit te sluiten door middel van standaard assays.
- Wanneer cellen zijn uitgebreid, kunt u direct conversie te starten of de vriezer cellen omlaag met 10% DMSO en 90% FCS. De cellen moeten bij -80 ° C worden bewaard gedurende 2 dagen en vervolgens overgebracht naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
- Voor de bereiding van de omzetting, was cellen eenmaal met DPBS, aspireren DPBS en voeg 2,5 ml trypsine / EDTA (0,05%). Laat gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2. Tik kolf zachtjes om cellen los, hersuspenderen in 2,5 ml fibroblast medium (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% natrium pyruvaat) en overbrengen naar 15 ml buis. Centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant. Resuspendeer cellen in 1 ml fibroblast media en pipet op en neer om enkele celsuspensie te genereren. </ Li>
- Tel het aantal cellen met een Fuchs-Rosenthal- of Neubauer-telkamer cellen en plaat 3 x 10 4 cellen per putje van een 24 putjes plaat. Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO 2.
2. Infectie van humane fibroblasten met Sendai Virus en Transdifferentiatie
OPMERKING: Om de veiligheid te garanderen, de volgende stappen hanteren virus in een biologische veiligheid kabinet en een laminaire stroming kap, en met de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen, met name een chirurgisch masker, om mucosale blootstelling te voorkomen moet worden uitgevoerd.
- Schakel cellen 100 gl fibroblast media (stap 1.9). Dooi fracties van Oct4-, Klf4-, Sox2- en c-myc-Sendai-virus en resuspendeer elk virus in 1 ml fibroblast media. Voeg elk virus met een MOI van 3 tot cellen (virus titer varieert van veel te veel, maar een portie van elk virus kan in het algemeen worden gebruikt voor de infectie van 10 putjes van een 24 goed plaat) en meng voorzichtig. Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO 2
- Na 24 uur Zuig het medium en voeg 500 pl neuroinduction media (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) en kweek bij 39 ° C, 5% CO 2 voortaan. Wijzig de media om de andere dag.
- Op dag 6 na infectie bereiden laminine bedekte 6-well-platen: verdun laminine tot 1 ug / ml in DPBS, voeg 1 ml van de oplossing op 6 goed platen en houden bij 4 ° C gedurende 24 uur.
- Op dag 7 na infectie splitsen de cellen met behulp DPBS / EDTA: zuigen de media en was cellen eenmaal met DPBS, voeg 500 ul van DPBS / EDTA en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Voeg 500 ui DMEM / F12 en verwijder suspensie van plaat in een 15 ml buis en centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1,5 ml neuroinduction media, plaat op-laminine gecoate 6 goed platen en voeg ROCK inhibitor Y27632 in een laatste concentration van 10 uM tot de cellen, kweek bij 39 ° C, 5% CO 2.
- Wijzig de media om de andere dag.
- Vanaf dag 14 na infectie de cellen te kweken bij 37 ° C, 5% CO 2. Neuro kolonies zichtbaar worden rond dag 17 na infectie door fasecontrast microscopie. Ze moeten groot genoeg zijn om te worden geplukt rond dag 20 na infectie.
3. Isolatie van Vermoedelijke INPC Colonies
- Een dag voor het plukken, laag een 48 goed plaat met laminine: verdun laminine tot 1 ug / ml in DPBS, voeg 300 ul oplossing op platen en bewaar bij 4 ° C gedurende 24 uur. Een dag later aspireren laminine van borden en 200 ul van neuroinduction media toe te voegen aan de putjes.
- Was de 6 goed platen met de koloniën eenmaal te worden opgehaald met DPBS en voeg 2 ml DPBS per putje van de 6 goed plaat. Kies de kolonies mechanisch: schraap rond kolonies met behulp van een dunne naald om zich te ontdoen van de omliggende cellen; Stel de 2001; l Pipetman op 50 ul en kies de kolonies met de desbetreffende pipet tips.
- Breng een kolonie elk in een putje van een met laminine beklede 48 goed plaat en genereert een enkele celsuspensie mechanisch pipetteren en neer 10 keer. Voeg ROCK inhibitor Y27632 in een eindconcentratie van 10 uM tot de cellen.
- Groeien de cellen op de 48 put-plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 dagen. Wijzig de media om de dag tot cellen te bereiken 80 - 90% confluentie (ong. 3 - 4 dagen).
4. Uitbreiding en Cryo-behoud van iNPCs
- Passage en uitbreiding van iNPCs
- Zuig het medium en was de cellen met DPBS. Zuig het DPBS en voeg 200 gl DPBS / EDTA en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2, voeg 200 pl DMEM / F12 en verwijder suspensie van de plaat in een 15 ml buis, centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 min .
- Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 0,5 ml neuroinduction media (stap 2,2), plaat-laminine beklede 12 putjes-platen en voeg ROCK inhibitor Y27632 in een eindconcentratie van 10 uM tot de cellen, kweken bij 37 ° C, 5% CO 2. Na de cellen te bereiken 80 - 90% confluentie ze kunnen ofwel verder worden uitgebreid of als volgt bevroren beneden.
- Bevriezing van iNPCs
- Zuig het medium en was de cellen met DPBS. Zuig het DPBS en voeg 300 pl DPBS / EDTA en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2, voeg 300 ul DMEM / F12 en verwijder suspensie van de plaat in een 15 ml buis, centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 0,5 ml commercieel NSC invriesmedium. Transfer schorsing te bevriezen flacons en zet in-cell bevriezing container. Bewaar bij -80 ° C gedurende 2 dagen, vervolgens over vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
5. Differentiatie van iNPCs
- Differentiatie richting neuronal lineage
- Kweekcellen op laminine beklede platen zoals hierboven is beschreven. Verandering media om neuro-diff-medium (DMEM / F-12, 1 x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 pM vitamine C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) wanneer cellen ongeveer 70% confluent. Verandering media om de dag gedurende drie weken. Niet splitsen cellen tijdens de differentiatie.
- Na drie weken de cellen van de neuronale marker TUJ1 moet uitdrukken. Om meer volwassen neuronen krijgen en neuronale subtypes blijven differentiatie tot 3 maanden.
- Differentiatie richting gliale lineage
- Verandering media gliale inductie media (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 uM β-mercaptoethanol, 100 uM niet-essentiële aminozuren, 1,5 mM L-glutamine, 5 ug / ml insuline, 40 ng / ml T3) met 20 ng / ml EGF om differentiatie te induceren in gliale voorlopercellen. Verwijder de helft van de media en vervangen door vers medium elke andere dag gedurende 2 weken. Gedurende deze periode cellen te splitsen1: 3 in aanwezigheid van 10 pM ROCK inhibitor Y27632 bij 100% confluentie bereikt.
- Na 2 weken differentiëren cellen verder in astrocyten: wanneer cellen zijn bijna confluent verandering media om de handel verkrijgbare astrocyten media, media veranderen elke tweede dag. Na ongeveer 7 dagen de cellen beginnen te astrocyten markers (bijv GFAP) uit te drukken. Als cellen krijgen 100% confluent tijdens de differentiatie protocol, splitsen ze in een 1: 2 verhouding in aanwezigheid van 10 pM ROCK inhibitor Y27632.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier presenteren we beschrijving van een geïntegreerd proces genereren van geïnduceerde neurale progenitorcellen (iNPCs) uit humane fibroblasten die zijn verkregen door een punch biopsie van de huid in minder dan 8 weken (figuur 1) mogelijk maakt. Patient-specifeke iNPCs kan verder worden onderscheiden in neuronale en gliacellen geslachten en de haven enorm potentieel voor celvervangingstherapie en de ziekte modelleren.
Infectie van de fibroblasten met Oct4-, Klf4-, Sox2- en c-myc Sendaivirussen 23 plekken in neuroinductive mediaverbindingen 22,31 resulteerde in een verandering van de morfologie van fibroblasten en opvolgende verergering van kolonies 17 dagen na infectie (Fig 2). Gegenereerd monoklonale cellijnen kunnen worden uitgebreid en vlekken positief voor neurale stamcellen markers zoals Sox2, SOX1, Nestin, Vimentin, Otx2 en Pax6, alsmede voor de proliferatie merker Ki67, terwijl ze niet drukken de pluripotency-merkereiwit Oct4 (figuur 3).
Bovendien kan door toevoeging van neuronale groeifactoren aan het celkweekmedium van de neurale stamcellen kunnen worden gedifferentieerd tot neuronen. Door een onderscheid protocol gebaseerd op Izrael et al. 42 en de daaropvolgende uiteindelijke differentiatie van astrocyten inductiemedia cellijnen kunnen ook worden onderscheiden in gliale lijnen zoals beoordeeld door analyse van typische morfologische veranderingen en kleuring tegen glial fibrillair zuur eiwit (GFAP) (figuur 4 ).
Figuur 1. Schematische weergave van drie stappen protocol in dit onderzoek. Fibroblasten van patiënten worden geïsoleerd door een punch biopsie en uitgebreid. Deze cellijnen kunnen vervolgens direct worden omgezet in geïnduceerd multipotente neurale stamcellen (iNPCs) en monoclonally uitgebreid. INPC lijnen kan worden gebruikt voor langdurige opslag (biobanking voor herhaalde of gestandaardiseerd gebruik), of ze kunnen worden onderscheiden in neuronale en gliacellen geslachten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Morfologische analyse van directe omzetting van humane fibroblasten in veroorzaakte neurale stamcellen middels fasecontrast microscopie (A) menselijke fibroblasten drie dagen na infectie met OKSM -. Sendai-virus en twee dagen na toevoeging van neuroinduction medium. Cellen tonen typische fibroblast-achtige morfologie. (B) Zeven dagen na infectie cellen met gewijzigde morfologie opdagen. Cellen worden verdeeld tot confluentie verminderen op dezelfde dag. (C) Ten dags na infectie alleen cellen met gewijzigde morfologie aanwezig zijn. (D) Eerste kleine neuro-achtige kolonies kan worden gevonden 17 dagen na infectie. Deze kolonies groter worden (E) en uitgroeiende cellen te vinden (F) drie dagen later. Cellen worden verzameld op dag 21 na infectie en uitbreidbaar cellijnen kunnen uit deze (GI). Verschillende klonen worden getoond in passage 1 (G), passage 3 (H) en passage 10 (I) na de oogst, respectievelijk. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Analyse van de neurale stamcel marker genexpressie van gegenereerd neurale voorlopercellen cell lijnen. Antilichaam kleuring van cellijnen na 10 passages gebleken dat cellen brengen de neurale stamcel markers SOX1, Sox2 (A) en Nestin en Pax6 (B). De cellen zijn negatief voor pluripotentie marker Oct4 aangeeft afwezigheid van pluripotentie (C). De meerderheid van de cellen te kleuren positief voor merker Ki67, die een hoge proliferatieve toestand toont (C). Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Analyse van NPCs na gericht differentiatie in neuronale en gliacellen geslachten. (A) tot neuronale specificatie iNPCs bereiken werden gedifferentieerd gedurende zeven dagen in aanwezigheid van BDNF, GDNF, vitamine C en cAMP. (B) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier tonen we de isolatie en rechtstreekse omzetting van humane fibroblasten in expandeerbare-transgen vrije neurale stamcellen en hun gedifferentieerde nakomelingen als mogelijke basis voor cell-vervangingstherapie of toepassing in geneesmiddelscreening analyses. Direct lineage omzetting van somatische cellen in NPC is bereikt door geforceerde expressie van afstammings-specifieke transcriptiefactoren 26,33,34. Niettemin vaak foetale fibroblasten werden voor transdifferentiatie experimenten 33,34. Voor biomedische toepassingen het gebruik van deze cellen is ondoelmatig omdat dit celbron sluit het klinisch gebruik van autologe celvervangingstherapie. Recent werden studies gepubliceerd die het genereren van neurale precursorcellen te beschrijven uit toegankelijker weefsels, zoals hematopoïetische cellen 43,44. De succesvolle generatie tripotent neurale stamcellijnen kon worden aangetoond voor de muizen-bloed afgeleide B-cellen door de induceerbare overexprEsion van acht transgenen 43. Bovendien Castano et al. Publiceerde een benadering voor de inductie van neuronale voorlopercellen van humane hematopoëtische cellen middels Sox2- en c-myc-Sendaivirus 44. Het protocol beschreven maakt snelle en efficiënte opwekking van neurale cellen uit navelstrengbloed CD133 + cellen. Echter, wanneer toegepast voor het omzetten van volwassen perifeer bloed mononucleaire cellen het protocol leverde lage efficiëntie en capaciteitsuitbreiding van de geproduceerde cellijnen was zeer beperkt 44. Derhalve dient enkel onderzoek gepubliceerd perifere bloedcellen in het menselijke systeem date 44 toont duidelijk de beperkingen van dit celtype in directe conversie experimenten. Daar de beschikbaarheid van patiënt-specifieke cellen is cruciaal voor autologe cel vervanging, het voorkeurstype cel vormen nog steeds volwassen fibroblasten, die gemakkelijk kan worden verkregen via de huid punch biopsie zoals beschreven in onze studie.
De overexpression van transgenen nodig voor transdifferentiatie is vooral bereikt door integratieve virale vectoren 26,33,34. Dit hindert de toepasbaarheid van de afgeleide cellijnen voor biomedische toepassingen, omdat de integratie van de virussen in het gastheergenoom kan leiden tot mutagenese of ongewenste reactivering van de transgenen 7,8. Transdifferentiatie in NPC zonder transgene overexpressie maar afhankelijk van de chemische behandeling is beschreven voor humane fibroblasten 45. Echter, in deze studie deze precursor cellen slechts in een overgangstoestand als doel van de studie was de vorming van rijpe Schwann-cellen 45. Onlangs hebben andere transgene vrije benaderingen gebaseerd op toepassing van Sendai virus beschreven voor de directe omzetting van de menselijke fibroblasten in NPCs 23,44 en lijken de favoriete strategie tot nu toe. Om uitbreidbaar NPC's die vervolgens kunnen worden onderscheiden in neuronale en gliacellen lijnen af te leiden,Wij passen overexpressie van Yamanaka-factoren van Sendai-virus met warmte geïnactiveerd virus 23 en neurale inductie door toevoeging van kleine moleculen aan het kweekmedium 22,31 belangrijke modificaties zoals hieronder beschreven.
Hoewel, in onze handen, wordt het protocol efficiënter werken met veel fibroblast lijnen getest, lijkt er een tendens dat de directe omzetting van fibroblast cellen van oude donoren vertonen een slechte proliferatief potentieel leiden tot een lage efficiëntie van INPC generatie. Wij namen kolonievormende rendementen tot 0,2% na een virale transductie efficiëntie van meer dan 90% zoals beoordeeld door infectie van cellen met Oct4 alleen gevolgd kleuring. Deze efficiëntie is ongeveer 3 maal hoger dan eerder gepubliceerde 23.
De nauwkeurig aangepaste toepassing van een geoptimaliseerd virale MOI kritisch. Partij tot partij variabiliteit in Sendai virus titermoet rekening worden gehouden. Omdat het virus wordt meestal commercieel verworven, kan de respectieve informatie te vinden op de fabrikant van de homepage. Wij stellen voor om een relatief lage MOI van 3 gebruiken voor transdifferentiatie experimenten.
Toevoeging van menselijk LIF in handen is cruciaal voor de zelfvernieuwing van de vastgestelde INPC lijnen zoals is beschreven voor de differentiatie van humane pluripotente cellen in 31 NPC. Zonder toevoeging van LIF, cellenbegin zo vroeg twee dagen na terugtrekking op niet-reversibele wijze differentiëren.
Celkweek na infectie wordt uitgevoerd bij 39 ° C en 37 ° C standaard celkweekomstandigheden niet gebruikt. Deze temperatuurstijging begint al één dag na infectie en leidt tot een hitte-inactivering van het Sendai virus. De kweek bij 39 ° C tot dag 14 na infectie essentieel voor het genereren van neuro kolonies.
Eigenlijk, Soms INPC kolonies komen later dan beschreven in het hoofdstuk protocol. In onze ervaring, zolang de proliferatieve cellen blijven zij kunnen polyklonaal gepasseerd en geïsoleerd door manuele picking. De gevestigde cellijnen van die kolonies vertonen dezelfde eigenschappen als beschreven voor de eerste optredende kolonies.
Bij splitsing van permanente cellijnen is het belangrijk een te klein aantal cellen niet aan zaad omdat hiervoor cel-tot-cel contacten of paracriene signalen zeer snel prolifereren. Als cellen worden gezaaid in een te lage proliferatie dichtheid zal ophouden. In dit geval kunnen de cellen worden gered door opnieuw platen op een celkweekschaal met een kleiner oppervlak opnieuw opstarten proliferatie.
Voor differentiatie van gliale iNPCs is het zeer belangrijk om de cellen te zaaien in een hoge dichtheid en ze te splitsen wanneer de plaat bijna confluent. Als cellen te vroeg zijn verdeeld, zal voornamelijk neuronale differentiatie in acht worden genomen.
content "> De in dit manuscript beschreven werkwijze herbergt het potentieel van een semi- of volledig geautomatiseerde wijze kunnen worden toegepast, die nodig zijn om het gewenste biomedische potentieel te bereiken zou zijn, met inbegrip ziektemodel en celvervangingstherapie. Automation ook mogelijk kosten- efficiënte scale-up en parallellisatie van het genereren van neurale stamcellen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag alle leden van de Stem Cell en Regenerative Medicine Group van de Universiteit van Würzburg voor nuttige tips en Martina Gebhardt evenals Heike Arthen bedanken voor een uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek BMBF (01 GN 0813), de Beierse Research Network geïnduceerde pluripotente stamcellen "forIPS" en de "Stiftung Sibylle Assmus ". Figuur 1 werd geproduceerd met behulp van Servier Medical Art, verkrijgbaar bij www.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
- Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657 (2012).
- Bosnali, M., Edenhofer, F.
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87 (2013).
- Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47 (2014).
- Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
- Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
- Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283 (2005).
- Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252 (2013).
- Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
- Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
- Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145 (2008).
- Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
- Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
- Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
- Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
- Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
- Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
- Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).
