Summary
诱导多能干细胞的产生提供了用于自体移植的推导引人入胜的前景。然而，通过多能状态和艰苦的再分化仍然进展阻碍临床翻译。在这里，我们描述了成年人成纤维细胞的衍生和其直接转化为诱导神经祖细胞和随后的分化成神经谱系。
Abstract
代从成人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞（iPS细胞）和随后的分化成体细胞为规避组织相容性障碍的自体移植的推导引人入胜的前景。然而，通过多能状态和随后的全面分化成所需的谱系进展仍然是一个障碍为IPSC的技术，因为相关的肿瘤潜力和基因组不稳定性的临床翻译。近来，我们和其他人发现，体细胞不仅可以通过使用确定的因子，从而通过多能状态绕过级数变换为iPS细胞，但也为不同类型的多能成体干细胞。特别是，直接由人类成纤维细胞进入诱导神经祖细胞（iNPCs）的转化预示着一个新的自体细胞来源的各种应用，如细胞替代，疾病建模的可能性和药物筛选。这里，我们描述成人原发性成纤维细胞通过皮肤活检及其有效的直接转换的隔离成iNPCs通过的Oct4，Sox2的，Klf4的及时限制性表达，以及c-Myc的。 17天后诱导SOX2阳性神经上皮菌落出现，INPC线可以有效地单克隆分离和扩增成立。感染和补充的白血病抑制因子的病毒多样性的在诱导期精确调整代表实现高达0.2％的转换效率的关键因素。迄今为止，针对具体患者INPC线可以扩大超过12的通道和均匀地显示神经干/祖细胞的形态学和分子的特性，如Nestin和Sox2的表达。该INPC线可以分化成神经元和星形胶质细胞作为判断染色针对TUJ1和GFAP分别。总之，我们提出一个强大的协议推导和可怕人成纤维细胞的克拉转换成可以提供用于生物医学应用的蜂窝源诸如自体神经细胞替代和疾病建模稳定地膨胀神经祖细胞。
Introduction
在2006年山和同事可以显示首次体细胞的重编程的可能性成多能状态1。此去分化是由四个转录表达在小鼠成纤维细胞获得因子的Oct4，Sox2的，Klf4和c-Myc的。所产生的所谓的诱导多能干细胞（iPS细胞）显示功能等同于胚胎干细胞（ESCs），并因此可以分化成成年生物体的所有细胞类型。一年后重新编程为iPS细胞也可以实现对人成纤维细胞2。在动物模型中的实验表明，源自iPSC的细胞中通常可以用于细胞替代疗法，例如 ，在帕金森氏病（PD）3-5。然而，与使用iPS细胞相关的一些限制表示路障，为全面实现其治疗的潜力。首先，细胞重编程为多能状态和随后的质量控制通常是一个耗时和低效的过程，得到了广泛的，因而昂贵的细胞培养过程。第二，iPSCs的需要被重新分化成感兴趣的生物医学应用之前所需的细胞类型和残留多能干细胞在分化的人口的概率藏着显著瘤潜力，从而显示细胞移植6后的高风险。第三，重编程过程通常是由通过lenti-或逆转录病毒感染诱导的重编程因子来实现的。这些病毒进入宿主基因组的整合可能导致插入突变和/或所述转基因7,8-不受控制活化。非整合系统已被开发以提供重编程因子的靶细胞，其最小化插入诱变和转基因激活的风险。这些转基因无方法的实例是细胞使用非整合的重新编程腺或仙台病毒9,10，基于DNA的载体11或不含DNA的方法的应用，如合成的mRNA的重组蛋白13,14的12或转导的转染。另一种很有前途的方法对转基因自由的iPSC的推导是利用loxP的修饰慢病毒重新编程结构和随后删除使用的Cre-loxP的DNA重组系统15,16转基因的。
一个更简单的方法来生成神经细胞的细胞替代疗法代表直接转换成纤维细胞进入有丝分裂后神经元17-20。 Vierbuchen 等人报告说，转录的表达因子ASCL1，Brn2和Myt1l结果在20％的神经元的产生来自鼠成纤维细胞17。在2011年它被示出，即在相同的三个转录因子与NEUROD1的过表达的组合使人成纤维细胞成神经的转罗恩的19。人类诱导的神经元也可以通过ASCL1和Ngn2下双SMAD-和GSK3β-抑制过度20产生。值得注意的是，直接转换成纤维细胞的成神经细胞的产生非增殖，有丝分裂后的细胞群，不允许进一步扩张和生物库。
最近，直接转换成纤维细胞的成增殖神经干/祖细胞群报道21-26。为了清楚起见，所有这些类型的细胞将被命名为这份报告中诱导神经祖细胞（iNPCs）。 Han 等过度Brn4，Sox2的，c-Myc的和Klf4来生成iNPCs。像他们无论从小学组织或多能干细胞源性神经干细胞，这些同行都是iNPCs和三电位可以分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞21。我们的团队报道涉及SOX2，Klf4的过表达略有不同的转换协议，和c-Myc诱导的Oct4表达为仅5天。通过这种方法，我们可以生成表现出完全沉默的重编程因子的小鼠22胚胎和成年成纤维细胞增殖稳定iNPCs。在对比的iPSC，iNPCs不移植27后表现出致瘤的潜力。我们使用在脱髓鞘的动物模型，髓鞘缺陷大鼠成功转化的细胞，这表明iNPCs在临床上是有用的22。在此之前，筹备可能只能从多能干细胞或原代神经组织28-32生成的。 iNPCs是稳定地膨胀的室，可以冷冻保存，并且能够分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。很大的努力已取得能适应从小鼠的直接转换协议到人类细胞23,26,33,34。在2012年它被出版，在成纤维细胞的单因子Sox2的过度表达足以产生小鼠和人iNPCs
一些研究表明神经干细胞或在不同的动物疾病模型的区别同行的细胞功能。从人多能干细胞的神经祖细胞已移植在神经炎性病症多发性硬化35,36的小鼠模型。人类胚胎干细胞衍生的神经祖细胞中的EAE的适用性（实验性自身免疫性脑脊髓炎）-mice最早于2008年35所示。多能神经前体细胞注射到小鼠脑的脑室和移植结果编在EAE的临床症状的减少。 Kim 等生成由hESCs少突胶质细胞前体和脑室内移植那些成EAE-小鼠。虽然移植了10多天没有生存，小鼠表现出显著改善神经功能和白质减少36促炎免疫细胞的。干细胞疗法也已应用于临床前靶向帕金森氏病的作为的NPC可以被成功地用于在相应的动物模型。对于这一点，祖细胞无论是来源于胎儿脑组织37从多能干细胞38-40或间质干细胞41被用于鉴别。在2012年，我们表明，小鼠iNPCs能够产生蛋白脂质蛋白，主要的髓鞘蛋白成分，移植后成髓鞘缺陷（MD）大鼠22的大脑。通过验证-的原则，实验治疗applicabiliNPCs的性被首次证明和另一项研究32很快证实。然而，治疗用途的人类iNPCs的全部潜力还有待探索。
这里，我们显示了从通过皮肤活检的成年患者的人原代细胞（ⅰ）推导一个坚固的一体化方法，（ⅱ）直接转换人成纤维细胞的成神经祖状态和iNPCs的（ⅲ）的能力也可以分化成神经元和神经胶质细胞系。这个协议的使用，将有助于加快新一代自体的人类细胞用于治疗应用。
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Protocol
在这项研究中所用的人成纤维细胞是从皮肤穿刺活检获得由维尔茨堡，德国的大学伦理委员会得到知情同意和伦理过关后（道德报告编号：日期为2011年6月10日一十一分之九十六）。
1.冲床活检
- 消毒患者的皮肤。麻醉用0.5至1ml盐酸甲哌卡因皮肤皮内其中一部分活检将取自（优先不太阳光曝晒区），并用无菌3毫米活检打孔准备皮肤活检，活检冲洗用DPBS + 1微升/1毫升庆大霉素和删除脂肪。活检冲洗两次DPBS +庆大霉素，吸DPBS完全和覆盖活检分散酶II（2.4 U / ml）和孵育16 - 18小时在4℃。
- 吸分散酶完全，用DPBS冲洗两次，去除表皮用镊子。用DPBS洗涤两次活检，添加2毫升胶原酶类型2（500 U / ml的CDU），转印在15ml管中，加入Collagena本身最多到5ml总体积。孵育45分钟，在37℃，5％的CO 2。
- 离心5分钟180 XG事后弃上清。重悬沉淀在10ml的DMEM-FCS-庆大霉素培养基（10％FCS，1微升/毫升庆大霉素）和离心再进行5分钟，在180×g下。弃上清，重悬沉淀在1.5ml DMEM-FCS-庆大霉素媒体。转移到T25粘附组织培养瓶和孵育在37℃，5％的CO 2。
- 更换介质每3天。
- 后约2周，当细胞周围的皮肤部位，使用胰蛋白酶/ EDTA（0.05％）分裂细胞汇合：洗涤细胞一次用DPBS，孵育5分钟，在37℃，5％CO 2的加入2ml胰蛋白酶/ EDTA的后（0.05％），加入2ml的DMEM-FCS-庆大霉素介质，转移至15ml管中并离心，在180×g离心5分钟;丢弃DMEM-FCS-庆大霉素媒体适量上清，重新悬浮颗粒。
- 通过改变培养基每3 R进一步扩大细胞d日和分裂时细胞汇合如上所述;此外庆大霉素可以通道2之后被停止。
- 采用细胞直接转化实验之前，请务必通过标准检测，以排除支原体污染。
- 当细胞已被扩大，您可以直接开始转换或用10％DMSO和90％FCS冷冻细胞下来。细胞应贮存在-80℃下进行2天，然后转移至液氮长期贮存。
- 为了制备转化，用DPBS，吸DPBS洗涤一次细胞，并加入2.5 ml胰蛋白酶/ EDTA（0.05％）。保持5分钟，在37℃，5％的CO 2。轻轻拍打瓶分离细胞，悬浮于2.5毫升的成纤维细胞培养基（DMEM含L-谷氨酸+ 10％FCS + 1％NEAA + 1％丙酮酸钠），并转移到15ml试管。离心在180×g离心5分钟，吸出上清液。悬浮细胞在1ml成纤维细胞培养基和吸管上下以产生单细胞悬浮液。</ LI>
- 算使用福克斯-Rosenthal-或纽鲍尔细胞计数室和板每一个24孔板的孔3×10 4个细胞的细胞数。孵育O / N在37℃，5％的CO 2。
2.感染人成纤维细胞与仙台病毒和转分化
注：为了确保安全，处理病毒以下步骤必须在生物安全柜和一个层流罩，并用适当的个人安全设备，特别是外科口罩，防止粘膜曝光进行。
- 开关单元至100μl成纤维细胞介质（步骤1.9）。解冻Oct4-，Klf4-，Sox2-的等分试样和c-myc-仙台病毒和悬浮每种病毒在1毫升的成纤维细胞的介质。添加每种病毒以3至细胞的MOI（病毒滴度从很多变化到很多，但是每种病毒的一个等份一般可以用于10孔24孔板的感染），轻轻混匀。孵育O / N在37℃，5％CO 2
- 24小时后吸出培养基并加入500μlneuroinduction介质（1：1的DMEM / F-12：的Neurobasal，1×N 2，1×27，1％含有GlutaMAX，10纳克/毫升hLIF，3μMCHIR99021，2微米SB431542）的和文化在39℃，5％CO 2，从现在开始。隔日更换介质。
- 在第6天感染后制备层粘连蛋白包被的6孔板：稀释的层粘连蛋白至1微克/毫升在DPBS，加入1毫升溶液到6孔板，并保持在4℃24小时。
- 在第7天感染后拆分使用DPBS / EDTA将细胞：吸媒体和用DPBS洗涤一次细胞，然后加入500μl的DPBS / EDTA和孵育10分钟，在37℃，5％的CO 2。
- 加入500μl的DMEM / F12的和从盘在15ml管中，离心除去悬浮液在180×g离心5分钟。
- 吸出上清液和悬浮颗粒在1.5 neuroinduction媒体，板上层粘连蛋白涂层6孔板中并添加ROCK抑制剂Y27632的最终conce为10μM至细胞，培养在39℃ntration，5％的CO 2。
- 隔日更换介质。
- 从感染培养后第14天将细胞在37℃，5％的CO 2。神经上皮感染菌落用相差显微镜后，成为各地17天明显。它们应该足够大约20天感染后要被拾取。
3.隔离推定的INPC殖民地
- 一天采摘前，涂布一层48孔板与层粘连蛋白：稀释的层粘连蛋白至1微克/毫升在DPBS，加入300微升溶液到板，并保持在4℃24小时。一天后吸层粘连蛋白从板，并添加200微升neuroinduction介质的孔中。
- 每孔洗涤6孔板的6孔板要被拾取一次用DPBS含有菌落并加入2ml的DPBS。挑菌落机械：围绕刮用细针摆脱周围细胞的克隆;设置2001; 50微升升移液器，并挑选使用相应的枪头殖民地。
- 传送每一个菌落成层粘连蛋白包被的48孔板的一个孔并通过移液器上下吹吸10次产生单细胞悬浮液机械。添加ROCK抑制剂Y27632在10μM至细胞的终浓度。
- 生长在48孔板的细胞中，在37℃，5％CO 2下2天。每隔一天更换培养基，直到细胞达到80 - 90％汇合（约3 - 4天）。
4.扩展和冷冻保存iNPCs的
- 传代和扩展iNPCs的
- 吸出培养基并用DPBS洗涤细胞。吸出DPBS并添加200微升DPBS / EDTA孵育10分钟，在37℃，5％的CO 2，添加200μl的DMEM / F12的和从板在15毫升管除去悬浮液中，离心，在180×g离心5分钟。
- 吸出上清液和悬浮颗粒在0.5 neuroi毫升nduction媒体（步骤2.2），盘上的层粘连蛋白包被的12孔板，并添加ROCK抑制剂Y27632在10μM的终浓度向细胞，培养在37℃，5％的CO 2。经过细胞达到80 - 90％汇合，他们既可以进一步扩大或冻结列如下。
- 冻结iNPCs的
- 吸出培养基并用DPBS洗涤细胞。吸出的DPBS和添加300μLDPBS / EDTA孵育10分钟，在37℃，5％的CO 2中，添加300μl的DMEM / F12的和从板在15毫升管除去悬浮液中，离心，在180×g离心5分钟。
- 吸出上清液和悬浮颗粒在0.5 NSC商用冷冻培养基中。转移悬浮液到冷冻小瓶中并置于细胞冷冻集装箱。储存在-80℃下进行2天，然后转移到液氮长期贮存。
5.分化iNPCs的
- 对神经元分化人的血统
- 关于层粘连蛋白包被的平板培养细胞如上所述。改变媒体的神经差异媒体（DMEM / F-12，1个N2，1X B27，300毫微克/毫升的阵营中，200μM的维生素C，10纳克/毫升BDNF，10纳克/毫升GDNF）当细胞约70％汇合。三个星期更改媒体隔日1次。分化过程中，不要分裂的细胞。
- 三周以后细胞应该表达的神经元标记TUJ1。为了获得更多的成熟神经元和神经元亚型继续分化长达3个月。
- 对胶质细胞谱系分化
- 改变媒体胶质感应介质（1：1的DMEM / F-12：的Neurobasal，1×N 2，1×B27，10μMβ巯基乙醇，100μM的非必需氨基酸，1.5mM的L-谷氨酰胺，5微克/毫升胰岛素， 40毫微克/毫升T3），包括20毫微克/毫升表皮生长因子诱导分化成神经胶质前体细胞。删除媒体的一半，并用新媒体取代隔日约2周。在此期间，细胞应被分割1：3在10μMROCK抑制剂Y27632存在当达到100％汇合。
- 2周后分化细胞进一步为星形胶质细胞：当细胞几乎汇合改变媒体的商业可用的星形胶质细胞的媒体，改变媒体每隔一天。后约7天细胞开始表达的星形胶质细胞标记物（ 例如，GFAP）。在10μMROCK抑制剂Y27632存在2比例：如果细胞获得的分化方案在100％汇合，将它们分割在一个1。
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Representative Results
这里，我们提出一个综合过程，允许一代从人成纤维细胞已经由从皮肤钻取活组织检查内小于8周（ 图1）中获得诱导的神经祖细胞（iNPCs）的描述。病人specifc iNPCs可以进一步分化为神经元和神经胶质细胞系和海港的巨大潜力细胞替代治疗和疾病建模。
与Oct4-，Klf4-，Sox2-和c-myc-仙台的成纤维细胞感染病毒的neuroinductive介质条件下22,31导致成纤维细胞和殖民地后来出现感染17天后的形态的变化和23文化（ 图2）。产生单克隆细胞系可以扩展和染色阳性神经干细胞标记物像Sox2的，SOX1，巢蛋白，波形蛋白，OTX2和Pax6的，以及为增殖标记Ki67的，而它们不表达pluripotency-相关标记Oct4的（ 图3）。
此外，通过加入神经生长因子的细胞培养基的神经祖细胞可以分化成神经元。通过应用基于Izrael分化协议等人 42和星形胶质细胞诱导培养基的细胞系随后的最终分化也可以分化成神经胶质细胞谱系作为判断的典型形态学变化和染色针对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（ 图4的分析）。
在这项研究中应用三步协议的图1示意图。成纤维细胞可以从患者中分离由钻取活组织检查和扩展。这些细胞系可以被直接转换成诱导多神经祖细胞（iNPCs）和莫noclonally扩大。 INPC线可用于长期储存（生物库重复或标准化使用），也可以分化成神经元和神经胶质细胞系。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.形态学分析的人成纤维细胞进入使用相差显微镜诱导神经祖细胞的直接转换（A）的人成纤维细胞感染OKSM三天后-仙台病毒和加成neuroinduction培养基两天后。细胞表现出典型的成纤维细胞样形态。（B）七天后感染细胞的形态改变了表演。细胞分裂，以减少在同一天汇合。（℃）十日的帖子只感染细胞形态变化的存在。（D）第一小上皮样菌落，可以发现在感染后17天。这些菌落的大小（E）增加，增长超过细 胞可以找到（F）三天后。细胞被拾取后第21天的感染和膨胀的细胞系可以从他们（GI）的生成。不同克隆示于通道1（G）中 ，流路3（H）和通道10（Ⅰ）采摘后，分别。比例尺= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
生成的神经祖CEL的神经干细胞标记基因的表达图3.分析1线。细胞系抗体染色后10次传代显示，细胞表达神经干细胞标记物SOX1，Sox2的（A）中以及Nestin和Pax6的（B）中 。细胞是阴性的多能性标记物的Oct4指示不存在多能性（℃）。多数细胞染色阳性标记Ki67的，它显示出高的增殖状态（C）。比例尺= 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
筹备图4.分析后定向分化为神经元和神经胶质细胞系。 （A）为了实现神经元规范iNPCs分化为在BDNF，GDNF，维生素C和cAMP存在下七天。（B）的 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里，我们显示了隔离和直接转换人成纤维细胞的成膨胀转基因的无神经祖细胞和它们的分化后代作为细胞替代疗法或药物筛选分析应用的推定依据。直接谱系体细胞转化成的NPC已经由谱系特异性转录的强制表达因子26,33,34来实现的。然而，在许多情况下，胎儿成纤维细胞用于转实验33,34。用于生物医学应用中，这些细胞的用法是不适宜的，因为这单元源排除了临床使用自体细胞替代疗法。最近，研究结果发表了描述从更容易获得的组织，如造血细胞43,44神经前体细胞的产生。成功代立方幂神经干细胞系可以通过可诱导的overexpr显示为鼠血液来源的B细胞esion八转基因43。此外，卡斯塔诺等人发表了诱导的神经元祖细胞的使用Sox2-人造血细胞和c-myc-仙台病毒44的方法。该协议描述实现了快速，高效的代神经细胞的CD133 +脐带血细胞。然而，当施加转换成人外周血单核细胞的协议产生低效率和产生的细胞系的膨胀能力非常有限44。因此，与外周血细胞在人体系统迄今44发布的唯一的研究清楚地表明在直接转换实验这个特定细胞类型的限制。因为患者特异性细胞的可用性是自体细胞替代关键，优选的细胞类型仍然代表成年成纤维细胞，经由皮肤钻取活组织检查如在我们的研究中所描述，可容易地导出。
该overexpre需要转的转基因裂变大多是由综合病毒载体26,33,34实现。这阻碍了生物医学应用的来源的细胞系的适用性自的病毒进入宿主基因组的整合可能导致插入突变或转基因7,8-无用活化。转成的NPC无转基因的过度表达，但基于化学处理已被描述为人类成纤维细胞45。然而，在这项研究中，这些前体细胞只存在于过渡状态作为研究的目的是成熟雪旺氏细胞45的生成。最近，基于应用仙台病毒的其它转基因的无的方法已被描述为直接转换人成纤维细胞的成的NPC 23,44和似乎是优选的策略是最新的。为了得到一个可随后分化成神经元和神经胶质细胞谱系扩展的NPC，可以应用的所有山因子过度表达仙台病毒连同病毒23的热灭活以及神经诱导通过加入小分子到培养基22,31与重要的修改的如以下所述。
虽然，在我们的手中，该协议是有效的合作与很多测试成纤维细胞系，有一个明显的趋势，即从旧的捐助者直接转换成纤维细胞表现出较差增殖潜能结果INPC产生低效率。我们观察到集落形成达0.2％的90％以上的病毒的转导效率的效率作为判断细胞的感染的Oct4只和随后的染色。这种效率的3倍左右，高于此前公布的23。
一个优化的病毒MOI的精确调整的应用是至关重要的。批次变异仙台病毒滴度已被考虑。由于该病毒通常是商业收购，相应的信息可以在制造商的主页上找到。我们建议使用相对低的MOI 3转用于实验。
加入人LIF在我们手中的是在建立的INPC线的自我更新至关重要的，因为已经描述了人多能细胞分化成的NPC 31。不添加LIF的，细胞开始早撤出以非可逆方式两天后分化。
在感染后细胞培养物在39℃下进行，而不是使用标准37℃的细胞培养条件。 1天感染后此温度升高已经启动，并导致热灭活的仙台病毒。在39℃感染后的文化，直到14日是一代上皮殖民地的本质。
事实上，有时INPC殖民地上来以后在协议部分比描述。根据我们的经验，只要该细胞保持增殖它们可以多克隆传代并分离通过手工采摘。从这些菌落的建立的细胞系表现出类似的性质如对于早期发生菌落。
期间建立的细胞系的分裂它不是种子太小数目的细胞，因为它们需要细胞 - 细胞接触或旁分泌信号，以增殖良好是重要的。如果细胞接种于过低的密度扩散将停止。在这种情况下，细胞可以通过replating在细胞培养皿以较小的表面，以重新开始增殖救出。
对于iNPCs胶质分化是非常重要的种子细胞中的高密度和分割它们当板几乎汇合。如果细胞被分裂太早，主要是神经元分化将观察到。
内容“>在这个手稿中描述的方法，窝藏在半自动或全自动的方式被施加的电势，这将是必要的，以实现所需的生物医疗潜力，包括疾病建模和细胞替代疗法。自动化也将使成本有效的放大神经祖细胞的产生和并行化。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
我们愿干细胞和维尔茨堡大学的再生医学集团有益的建议和Martina Gebhardt的以及海克Arthen的所有成员感谢优秀的技术支持。这项工作是由德意志研究联合会DFG（ED79 / 1-2），教育的德国与研究部BMBF（01 GN 0813），巴伐利亚研究网络诱导多能干细胞“forIPS”和“基金会西比勒Assmus资金支持“ 图1是使用施维雅医疗艺术，从www.servier.com生产。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
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