Summary
Generering av induserte pluripotente stamceller gir spennende muligheter for avledning av autologe transplantasjoner. Men progresjon gjennom en pluripotent tilstand og møysommelig gjen differensiering fortsatt hindrer klinisk oversettelse. Her beskriver vi avledning av voksne humane fibroblaster og deres direkte omdannelse til induserte nevrale stamceller og den etterfølgende differensiering i nevrale linjene.
Abstract
Generering av indusert pluripotent stamcelle (iPSCs) fra voksne hudfibroblaster og påfølgende differensiering i somatiske celler gir spennende muligheter for avledning av autologe transplantasjoner som omgår histokompatibili-tets barrierer. Men progresjon gjennom en pluripotent tilstand og etterfølgende komplett differensiering i ønskede linjene er fortsatt en hindring for den kliniske betydningen av IPSC teknologi på grunn av den tilhørende neoplastisk potensial og genomisk ustabilitet. Nylig har vi og andre har vist at somatiske celler ikke bare kan omdannes til iPSCs men også i forskjellige typer av multipotente somatiske stamceller ved å bruke definerte faktorer, for derved å omgå progresjon gjennom pluripotent tilstand. Spesielt er den direkte omdannelse av humane fibroblaster inn indusert nevrale stamceller (iNPCs) varsler muligheten for en ny autolog celle kilde for ulike applikasjoner som for eksempel celle erstatning, sykdom modelleringog narkotika screening. Her beskriver vi isolering av voksne humane primære fibroblaster av hud biopsi og deres effektiv direkte omdannelse til iNPCs ved rettidig begrenset ekspresjon av Oct4, Sox2, Klf4, samt c-myc. Sox2-positive neuroepithelial kolonier vises etter 17 dager med induksjon og iNPC linjer kan etableres effektivt ved monoklonalt isolasjon og ekspansjon. Nøyaktig justering av viral multiplisitet av infeksjon og utfylling av leukemi-inhiberende faktor i induksjonsfasen representerer kritiske faktorer for å oppnå konvertering virkningsgrader på opp til 0,2%. Hittil kunne pasientspesifikke iNPC linjer utvides for flere enn 12 passeringer og jevnt viser morfologiske og molekylære trekk ved neuralstamceller / stamceller, som uttrykk for nestin og Sox2. De iNPC linjene kan differensieres i nevroner og astrocytter som bedømt ved farging mot TUJ1 og GFAP hhv. I konklusjonen, rapporterer vi en robust protokoll for avledning og direct konvertering av humane fibroblaster i stabilt utvid nevrale stamceller som kan gi et mobil kilde for biomedisinske applikasjoner som autolog nevrale celle utskifting og sykdom modellering.
Introduction
I 2006 Yamanaka og kolleger kunne viser for første gang muligheten for omprogrammering av somatiske celler i et pluripotente tilstand 1. Dette dedifferentiation ble oppnådd ved overekspresjon av fire transkripsjonsfaktorer Oct4, Sox2, Klf4, og c-myc i murine fibroblaster. De genererte såkalte induserte pluripotente stamceller (iPSCs) viser funksjonell ekvivalens til embryonale stamceller (ESCS) og kan dermed bli differensiert i alle celletyper i den voksne organismen. Ett år senere omprogrammering til iPSCs kan også oppnås for humane fibroblaster to. Eksperimenter i dyremodeller viser at IPSC-avledet celler kan vanligvis brukes for celle replacement therapy, for eksempel ved Parkinsons sykdom (PD) 3-5. Men flere begrensninger knyttet til bruk av iPSCs representerer veisperringer for full realisering av deres terapeutiske potensial. Først av alt, omprogrammering av celler inn i en pluripotent tilstand og etterfølgendekvalitetskontroll er vanligvis en tidkrevende og ineffektiv prosess ettergivende i en omfattende og dermed kostbare cellekultur prosedyrer. For det andre, iPSCs må re-differensiert i den ønskede celletype av interesse før biomedisinsk anvendelse og sannsynligheten for gjenværende pluripotente celler i populasjonen differensiert havner en betydelig tumorfremkallende potensiale og dermed viser en høy risiko etter celletransplantasjon 6. For det tredje er omprogrammering prosessen vanligvis oppnås ved å fremkalle reprogrammerings faktorene ved lenti- eller retroviral infeksjon. Integreringen av disse virus i vertsgenomet, kan det føre til insertional mutagenese og / eller ukontrollert aktivering av transgener 7,8. Ikke-integrerende systemer har blitt utviklet for å levere de reprogrammerings-faktorene til målceller, noe som minimerer risikoen for insertional mutagenese og transgenet reaktivering. Eksempler på disse transgene frie tilnærminger er omprogrammering av celler ved hjelp av ikke-integreringAdeno eller Sendai-virus 9,10, DNA-baserte vektorer 11 eller anvendelse av DNA-fri metoder, som transfeksjon av syntetisk mRNA 12 eller transduksjon av rekombinante proteiner 13,14. En annen lovende metode for avledning av transgene frie IPSC er bruken av loxP-modifisert lentiviral reprogrammerings-konstruksjoner og etterfølgende delesjon av transgener ved hjelp av Cre-loxP DNA rekombinasjon system 15,16.
En enklere måte å generere neuralceller for celle erstatning terapi representerer direkte konvertering av fibroblaster i post-mitotiske nevroner 17-20. Vierbuchen et al. Rapporterte at overekspresjon av transkripsjonsfaktorer Ascl1, Brn2 og Myt1l resulterer i genereringen av 20% neuroner fra murine fibroblaster 17. I 2011 ble det vist at de samme tre transkripsjonsfaktorer i kombinasjon med overuttrykte NeuroD1 aktivere transdifferensiering av humane fibroblaster inn neuRons 19. Menneskeskapte nevroner kan også genereres ved overuttrykte Ascl1 og Ngn2 henhold dual SMAD- og GSK3β- hemming 20. Spesielt, direkte konvertering av fibroblaster i nerveceller genererer en non-proliferativ, post-mitotisk cellepopulasjon som ikke tillater videre ekspansjon og biobanker.
Nylig ble direkte konvertering av fibroblaster i en voksende neural stilk / stamcelle befolkningen rapporterte 21-26. For ordens skyld, vil alle disse celletypene bli navngitt som induserte nevrale stamceller (iNPCs) i denne rapporten. Han et al. Overexpressed Brn4, Sox2, c-myc og Klf4 å generere iNPCs. Som sine nevrale stamcelle kolleger avledet fra enten primære vev eller pluripotente celler disse iNPCs er tripotential og kan bli differensiert i nevroner, astrocytter og oligodendrocytter 21. Vår gruppe rapporterte en litt annen konvertering protokollen involverer overuttrykte Sox2, Klf4Og c-myc og indusert Oct4 utfoldelse for 5 dager bare. Med denne tilnærmingen kan vi generere stabilt prolifererende iNPCs fra murine embryonale og voksne fibroblaster som viser komplett stanse av omprogrammering faktorer 22. I motsetning til iPSCs, trenger iNPCs ikke utvise en tumorigent potensiale etter transplantasjon 27. Vi brukte celler omdannet med hell i en dyremodell av demyelinisering, myelin mangel rotter, og dette demonstrerer at iNPCs er klinisk nyttig 22. Inntil da, kan NPCer bli bare genereres fra pluripotente stamceller eller primær nervevev 28-32. iNPCs er stabilt utvidbare celler som kan fryses ned og er i stand til å differensiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Mye arbeid er gjort for å tilpasse direkte konvertering protokollen fra mus til menneskeceller 23,26,33,34. I 2012 ble det publisert at overekspresjon av den enkeltfaktoren Sox2 i fibroblaster er tilstrekkelig til å generere murine og humane iNPCs
Flere studier viser mobil funksjonaliteten NSCs eller deres differensierte kolleger i ulike dyresykdomsmodeller. Nevrale stamceller fra menneskelige pluripotente stamceller har blitt transplantert i musemodeller av neuroinflammatoriske multippel sklerose 35,36. Anvendeligheten hESC-avledet nevrale stamceller i EAE (eksperimentell autoimmun encefalomyelitt) -mice ble først vist i 2008 35. Multipotente neurale forløperceller ble injisert inn i ventriklene i musehjerne, og transplantasjon resultated i reduksjon av kliniske tegn på EAE. Kim et al. Generert oligodendroglial forløpere fra hESCs og transplantert de intracerebroventrikulært inn EAE-mus. Selv om transplantasjoner ikke overlevde i mer enn 10 dager, mus viste signifikant forbedring av nevrologisk funksjon og reduksjon av proinflammatoriske immunceller i hvit substans 36. Stamcelleterapi har også blitt brukt for preklinisk målretting av Parkinsons sykdom som NPCer kan med hell brukes i de respektive dyremodeller. For dette ble stamceller enten avledet fra fosterets hjerne vev 37 differensiert fra pluripotente stamceller 38-40 eller stamceller 41 ble brukt. I 2012 viste vi at mus iNPCs er i stand til å produsere proteolipidprotein, hoved myelin proteinkomponenten, etter transplantasjon inn i hjernen til myelin-manglende (MD) 22 rotter. Ved at proof-of-prinsippet eksperiment terapeutisk applicabilligheten av iNPCs ble først påvist og snart bekreftet av en annen studie 32. Imidlertid gjenstår det fulle potensialet i terapeutisk bruk av menneskelige iNPCs å bli utforsket.
Her vises en robust og integrert prosess (i) avledning av humane primære celler fra voksne pasienter via hud biopsi, (ii) direkte omdannelse av humane fibroblaster i en neural progenitor tilstand og (iii) evnen til iNPCs å bli differensiert i neuronal og gliale linjene. Bruk av denne protokollen vil bidra til å øke hastigheten på generasjon av autologe humane celler for terapeutiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De menneskelige fibroblaster brukt i denne studien ble hentet fra en hud punsj biopsi etter å bli informert samtykke og etisk avklaring fra etikkutvalg ved Universitetet i Würzburg, Tyskland (etisk rapport no: 96/11 datert 10.06.2011).
1. Punch Biopsi
- Desinfiser huden på pasienten. Bedøve huden som delvis biopsi vil bli tatt fra (fortrinnsvis en mindre sol-eksponert område) bruker 0,5 til 1 ml mepivakain hydrochloride intrakutant og forberede huden biopsi med en steril 3mm biopsi punch, skyll biopsi med DPBS + 1 ul / 1ml Gentamicin og fjerne fett. Skyll biopsi to ganger med DPBS + Gentamicin, aspirer DPBS helt og deksel biopsi med Dispase II (2,4 U / ml) og inkuberes 16 - 18 timer ved 4 ° C.
- Aspirer Dispase helt, vask to ganger med DPBS og fjerne epidermis med pinsett. Vask biopsi to ganger med DPBS, tilsett 2 ml Kollagenase Type 2 (500 U / ml CDU), overføring i 15 ml tube og legge CollagenaSE opp til 5 ml total volum. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Sentrifuger 5 min ved 180 xg og kast supernatanten etterpå. Resuspender pelleten i 10 ml DMEM-FCS-Gentamicin-medium (10% FCS, 1 pl / ml Gentamicin) og sentrifuger på nytt i 5 min ved 180 x g. Kast supernatant og resuspender pellet i 1,5 ml DMEM-FCS-Gentamicin-media. Overføring til T25 tilhenger vevskulturkolbe og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Endre media hver 3 dager.
- Etter omtrent 2 uker, når cellene er konfluente rundt hud deler, delt celler ved anvendelse av Trypsin / EDTA (0,05%): Vask cellene en gang med DPBS, inkuber i 5 minutter ved 37 ° C, 5% CO 2 etter tilsetning av 2 ml trypsin / EDTA (0,05%), tilsett 2 ml DMEM-FCS-Gentamicin-media, overføring til 15 ml tube og sentrifuger ved 180 xg i 5 min; kast supernatanten og resuspender pellet i passende mengde DMEM-FCS-Gentamicin-media.
- Ytterligere å utvide cellene ved å endre medium hver 3 rd dag og splitting som beskrevet ovenfor, når cellene er sammenflytende; Tilsetningen av Gentamicin kan stoppes etter passering 2.
- Før du bruker cellene for direkte konvertering eksperimenter, sørg for å utelukke mycoplasma forurensning av standardtester.
- Når cellene har blitt utvidet, kan du starte direkte konvertering eller fryse celler ned med 10% DMSO og 90% FCS. Celler bør lagres i -80 ° C i 2 dager og deretter overført til flytende nitrogen for langtidslagring.
- For utarbeidelse av konvertering, vaske cellene gang med DPBS, aspirer DPBS og tilsett 2,5 ml Trypsin / EDTA (0,05%). Hold i 5 minutter ved 37 ° C, 5% CO2. Tap kolbe forsiktig for å løsne cellene resuspendert i 2,5 ml fibroblast medium (DMEM inkl. L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% natriumpyruvat) og overføres til 15 ml tube. Sentrifuger ved 180 xg i 5 minutter og aspirer supernatanten. Resuspender celler i en ml fibroblast medie og pipette opp og ned for å generere enkelt celle suspensjon. </ Li>
- Tell antall celler ved hjelp av en Fuchs-Rosenthal- eller Neubauer celle-tellekammer, og platen 3 x 10 4 celler pr brønn i en 24-brønners plate. Inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO2.
2. Infeksjon av humane fibroblaster med Sendai Virus og transdifferensiering
MERK: For å ivareta sikkerheten, kan fremgangsmåten håndtering virus må utføres i et biologisk sikkerhetskabinett og en laminær hette, og med egnet personlig verneutstyr, spesielt en kirurgisk maske, for å hindre slimhinnene eksponering.
- Bytt celler til 100 pl fibroblast media (trinn 1.9). Tine porsjoner av Oct4-, Klf4-, Sox2- og c-myc-Sendai virus og resuspender hvert virus i en ml fibroblast medier. Legg hvert virus med en MOI på 3 til cellene (virustiter varierer fra parti til parti, men en porsjon av hvert virus kan generelt anvendes for infeksjon av 10 brønner på en 24 brønn-plate) og bland forsiktig. Inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO 2
- Etter 24 timer aspirer mediet og tilsett 500 mL av neuroinduction media (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% Glutamax, 10 ng / ml HLIF, tre mikrometer CHIR99021, 2 mikrometer SB431542) og kultur ved 39 ° C, 5% CO2 fra nå av. Endre media annenhver dag.
- På dag 6 etter smitte forberede laminin-belagt seks-brønns-plater: fortynne laminin til 1 mikrogram / ml i DPBS, tilsett 1 ml oppløsning på seks brønnplater og holde ved 4 ° C i 24 timer.
- På dag 7 etter infeksjon splitte cellene ved hjelp av DPBS / EDTA: aspirere mediet og Vask cellene en gang med DPBS og deretter tilsett 500 ul DPBS / EDTA og inkuberes i 10 min ved 37 ° C, 5% CO2.
- Legg 500 ul DMEM / F12 og fjerne suspensjon fra platen i et 15 ml rør og sentrifuger ved 180 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 1,5 ml neuroinduction medier, plate på laminin-belagte 6 brønnplater og legge stein Y27632 inhibitor i et slutt concentration av 10 uM til cellene, kulturen ved 39 ° C, 5% CO2.
- Endre media annenhver dag.
- Fra dag 14 etter infeksjon kultur av cellene ved 37 ° C, 5% CO2. Neuroepithelial kolonier bli tydelig rundt dag 17 etter smitte av fasekontrastmikroskopi. De bør være store nok til å bli plukket rundt dag 20 etter infeksjon.
3. Isolering av Antatte iNPC Colonies
- En dag før plukking, frakk en 48 godt plate med laminin: fortynne laminin til 1 mikrogram / ml i DPBS, tilsett 300 mL av løsningen på plater og holde ved 4 ° C i 24 timer. En dag senere aspirer laminin fra tallerkener og tilsett 200 ul neuroinduction media til brønnene.
- Vask 6 godt plater som inneholder koloniene å bli plukket gang med DPBS og tilsett 2 ml DPBS per brønn av 6 godt plate. Plukk koloniene mekanisk: skrape rundt kolonier ved hjelp av en tynn nål til å kvitte seg med rundt celler; setter 2001; l pipetman på 50 ul og plukke kolonier hjelp de respektive pipetter.
- Overfør en koloni hver inn i en brønn av en laminin-belagte 48 godt plate og generere en enkelt cellesuspensjon mekanisk ved å pipettere opp og ned 10 ganger. Legg ROCK inhibitor Y27632 i en sluttkonsentrasjon på 10 um til cellene.
- Dyrke cellene på 48 vel-plate ved 37 ° C, 5% CO2 i 2 dager. Endre media annenhver dag frem til cellene nå 80 - 90% konfluens (ca 3 -. 4 dager).
4. Utvidelse og Cryo-bevaring av iNPCs
- Aging og Utvidelse av iNPCs
- Aspirer medium og vaske cellene med DPBS. Aspirer DPBS og tilsett 200 ul DPBS / EDTA og inkuberes i 10 min ved 37 ° C, 5% CO2, tilsett 200 ul DMEM / F12 og fjerne suspensjon fra platen i et 15 ml rør, sentrifuger ved 180 xg i 5 min .
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 0,5 ml neuroinduction media (trinn 2.2), plate på laminin-belagte 12-brønnplater og legge stein inhibitor Y27632 i en sluttkonsentrasjon på 10 uM til cellene, kultur ved 37 ° C, 5% CO2. Etter celler nå 80 - 90% confluency de kan enten ytterligere utvidet eller fryses ned som følger.
- Frysing av iNPCs
- Aspirer medium og vaske cellene med DPBS. Aspirer DPBS og tilsett 300 ul DPBS / EDTA og inkuberes i 10 min ved 37 ° C, 5% CO2, tilsett 300 ul DMEM / F12 og fjerne suspensjon fra platen i et 15 ml rør, sentrifuger ved 180 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 0,5 ml kommersiell NSC frysemedium. Overføring suspensjon for fryse ampuller og satt i celle-frysing container. Oppbevares ved -80 ° C i 2 dager, og deretter overføre til flytende nitrogen for langtidslagring.
5. Differensiering av iNPCs
- Differensiering mot neuronal avstamning
- Kultur celler på laminin-belagte plater, som beskrevet ovenfor. Endres mediet til neuro-diff-medium (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 pM vitamin C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) når cellene er omtrent 70% konfluent. Endre media annenhver dag i tre uker. Ikke splitt celler under differensiering.
- Etter tre uker celler skal uttrykke neuronal markør TUJ1. For å få mer modne nevroner og nevrale subtyper fortsette differensiering inntil 3 måneder.
- Differensiering mot glial avstamning
- Endres mediet til glial induksjon medium (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 pM β-merkaptoetanol, 100 uM ikke-essensielle aminosyrer, 1,5 mM L-glutamin, 5 ug / ml insulin, 40 ng / ml T3) med 20 ng / ml EGF for å indusere differensiering i glial forløperceller. Fjern halvparten av media og erstatte med ferske media annenhver dag i ca 2 uker. I denne perioden bør dele celler1: 3 i nærvær av 10 uM inhibitor ROCK Y27632 når 100% konfluens er nådd.
- Etter to uker skille cellene videre inn astrocytter: når cellene er nesten sammenløpende endrings media til kommersielt tilgjengelige astrocyte media, endre media annenhver dag. Etter ca 7 dager cellene begynner å uttrykke astrocyttkulturer markører (f.eks GFAP). Dersom cellene får 100% konfluent under differensiering protokollen, dele dem i et 1: 2-forhold i nærvær av 10 uM inhibitor ROCK Y27632.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenterer vi beskrivelse av en integrert prosess som tillater generering av induserte nevrale stamceller (iNPCs) fra humane fibroblaster som er et resultat av en punch biopsi fra hud i løpet av mindre enn 8 uker (Figur 1). Pasient specifc iNPCs kan bli ytterligere differensiert i nevronale og gliaceller linjene og havnen stort potensial for celle erstatning terapi og sykdom modellering.
Infeksjon i fibroblaster med Oct4-, Klf4-, Sox2- og c-myc- Sendai virus 23 og kultur i neuroinductive medie forholdene 22,31 resulterte i en endring av morfologi av fibroblaster og påfølgende fremveksten av kolonier 17 dager etter smitte (Figur 2). Generert monoklonale cellelinjer kan utvides og beis positivt for nevrale stamcellemarkører som Sox2, Sox1, nestin, vimentin, Otx2 og Pax6, samt for spredning Ki67, mens de ikke uttrykker pluripotency-assosiert markør Oct4 (figur 3).
Videre, ved tilsetning av neuronal vekstfaktorer til cellekulturmediet neural stamceller kan bli differensiert i nerveceller. Ved å bruke en differensiering protokoll basert på Izrael et al. 42 og påfølgende finalen differensiering med astrocyte induksjon mediecellelinjer kan også bli differensiert i gliale linjene som bedømt ved analyse av typiske morfologiske endringer og farging mot glial fibrillary surt protein (GFAP) (figur 4 ).
Figur 1. Skjematisk fremstilling av tre-trinns protokoll anvendt i denne studien. Fibroblaster kan isoleres fra pasienter med en punch biopsi og utvidet. Disse cellelinjene kan så direkte omdannes til induserte multipotente neurale stamceller (iNPCs) og monoclonally utvidet. iNPC linjer kan brukes til langtidslagring (biobanker for gjentatt eller standardisert bruk), eller de kan bli differensiert i nevronale og gliaceller linjene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Morfologisk analyse av direkte omdannelse av humane fibroblaster i induserte nevrale stamceller ved hjelp av fasekontrastmikroskopi (a) humane fibroblaster tre dager etter infeksjon med OKSM -. Sendai-virus, og to dager etter tilsetning av neuroinduction medium. Celler viser typiske fibroblast-lignende morfologi. (B) Syv dager etter infeksjon celler med endret morfologi showet opp. Celler blir splittet for å redusere sammenflytning på samme dag. (C) ti dagerss etter infeksjon bare celler med endret morfologi er til stede. (D) Første små neuroepithelial lignende kolonier kan bli funnet 17 dager etter smitte. Disse koloniene øke i størrelse (E), og vokse ut av cellene kan bli funnet (F) i tre dager senere. Celler blir plukket på dag 21 etter infeksjon og utvidcellelinjer kan genereres fra dem (GI). Forskjellige kloner er vist i en passasje (G), passasjen 3 (H) og passasjen 10 (I) etter plukking, respektivt. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Analyse av nevrale stamcelle markør genuttrykk av generert nevrale stamfar cell linjer. Antistoff-farving av cellelinjer etter 10 passeringer viste at cellene uttrykker den neurale stamcellemarkører Sox1, Sox2 (A), så vel som nestin og Pax6 (B). Cellene er negative for pluripotency Oct4 markør som indikerer fravær av pluripotency (C). Flertallet av cellene positive for flekken Ki67, som viser en høy proliferativ tilstand (C). Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Analyse av NPCer etter rettet differensiering i nevronale og gliaceller linjene. (A) For å oppnå nevrale spesifikasjons iNPCs ble differensiert i syv dager i nærvær av BDNF, GDNF, vitamin C og cAMP. (B) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi isolasjon og direkte konvertering av humane fibroblaster inn utvidtransgene fritt nevrale stamceller og deres differensiert avkom som en antatt grunnlag for celle-erstatning terapi eller program i narkotika screening-analyser. Direkte avstamning omdannelse av somatiske celler i NPC har blitt oppnådd ved tvungen ekspresjon av lineage-spesifikke transkripsjonsfaktorer 26,33,34. Men i mange tilfeller føtale fibroblaster ble anvendt for transdifferensiering eksperimenter 33,34. For biomedisinske applikasjoner bruken av disse cellene er uhensiktsmessig som denne cellen kilde utelukker klinisk bruk for autolog celle erstatning terapi. Nylig ble det studier publisert som beskriver den generasjonen av nevrale forløperceller fra lettere tilgjengelig vev, for eksempel hematopoetiske celler 43,44. Den vellykkede dannelse av tripotent neurale stamcellelinjer kan bli vist for muse blod-avledede B-celler av den induserbare overexpresion av åtte transgener 43. Videre Castano et al. Publiserte en tilnærming for induksjon av nevrale stamceller fra menneskelige blodkreft celler ved hjelp Sox2- og c-myc-Sendai virus 44. Protokollen er beskrevet muliggjør rask og effektiv produksjon av nevrale celler fra CD133 + ledningen blod celler. Imidlertid, når den anvendes for omdannelse av voksne perifere mononukleære blodceller protokollen gitt lav effektivitet og kapasitetsutvidelser av de genererte cellelinjene var svært begrenset 44. Således er den eneste studie publisert med perifere blodceller i det menneskelige system hittil 44 viser tydelig begrensninger av denne celletype i direkte konvertering eksperimenter. Siden tilgjengeligheten av pasient-spesifikke celler som er avgjørende for autolog celle utskifting, er den foretrukne celletypen fremdeles representere voksne fibroblaster, som lett kan utledes ved hjelp av en hud biopsier som beskrevet i vårt studium.
Den overexpression av transgener som trengs for transdifferensiering har stort sett blitt oppnådd ved integrerende virale vektorer 26,33,34. Dette hindrer anvendelsen av de avledede cellelinjer for biomedisinske anvendelser siden integrasjonen av virus i vertsgenomet, kan det føre til insertional mutagenese eller uønsket aktivering av transgener 7,8. Transdifferensiering inn NPCer uten transgenet overekspresjon men basert på kjemisk behandling har blitt beskrevet for humane fibroblaster 45. Men i denne undersøkelsen ble disse forløper celler var bare til stede i en transient tilstand som målet med denne studien var dannelsen av modne Schwann celler 45. Nylig har andre transgene fritt tilnærminger basert på anvendelse av Sendai virus blitt beskrevet for direkte konvertering av humane fibroblaster inn NPCer 23,44 og ser ut til å foretrekke å date. Å utlede utvid NPCer som senere kan differensieres i nevronale og gliaceller linjene,vi anvender overekspresjon av alle Yamanaka-faktorer ved Sendai-virus sammen med varmeinaktivering av virus 23 samt nevrale induksjon ved tilsetning av små molekyler til kulturmediet 22,31 med viktige modifikasjoner som beskrevet i det følgende.
Selv i våre hender, er protokollen effektivt arbeide med mange fibroblast linjene som ble testet, er det en tydelig tendens til at den direkte omdannelse av fibroblast-celler fra gamle donorer som oppviser en dårlig proliferativ potensiell resultere i en lav virkningsgrad av iNPC generasjon. Vi har observert kolonidannende effektivitet på opp til 0,2% etter en viral transduksjon virkningsgrad på mer enn 90% som bedømt ved infeksjon av celler med Oct4 bare og påfølgende farging. Denne effektiviteten er ca 3 ganger høyere enn tidligere publisert 23.
Den nøyaktig justerte anvendelse av en optimalisert viral MOI er kritisk. Batch til batch-variabilitet i Sendai-virus titerhar til å bli tatt i betraktning. Siden viruset er vanligvis ervervet kommersielt, kan respektiv informasjon finnes på produsentens hjemmeside. Vi foreslår å bruke en relativt lav MOI av tre for transdifferensiering eksperimenter.
Tilsetting av human LIF i våre hender er avgjørende for den selvfornyelse av de etablerte iNPC linjene som har blitt beskrevet for differensiering av pluripotente celler til humane NPC 31. Uten tilsetning av LIF, cellene begynner å skille så tidlig som to dager etter uttak på en ikke-reversibel måte.
Cellekultur etter infisering blir utført ved 39 ° C og ikke ved bruk av standard 37 ° C cellekulturbetingelser. Denne økningen i temperaturen begynner allerede en dag etter infeksjonen og fører til en varmeinaktivering av Sendai-virus. Kulturen ved 39 ° C inntil dag 14 etter infeksjon er viktig for generering av neuroepithelial kolonier.
Faktisk, noen ganger iNPC kolonier komme opp senere enn beskrevet i protokollen delen. I vår erfaring, så lenge cellene forblir proliferativ de kan polyclonally passaged og isolert ved manuell plukking. De etablerte cellelinjer fra disse koloniene viser lignende egenskaper som beskrevet for de første forekommende kolonier.
Ved splitting av etablerte cellelinjer er det viktig ikke å pode et for lite antall celler som de krever celle-til-celle-kontakter eller paracrine signaler til å spre seg godt. Dersom cellene blir sådd ut i for lav densitet spredning vil opphøre. I dette tilfelle, kan celler bli reddet av replating på en cellekulturskål med en mindre overflate for å re-initiere proliferasjon.
For glial differensiering av iNPCs er det svært viktig å frø cellene i en høy densitet, og for å dele dem når platen er nesten sammenflytende. Dersom cellene er delt for tidlig, vil hovedsakelig neuronal differensiering holdes.
innhold "> Fremgangsmåten beskrevet i dette manuskriptet havner potensial til å bli brukt i en halv- eller helautomatisk måte, noe som ville være nødvendig for å oppnå den ønskede biomedisinsk potensial, herunder sykdom modellering og celle-erstatningsterapi. Automation vil også gjøre det mulig kost- effektiv oppskalering og parallellisering av det genereringen av nevrale stamceller.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke alle medlemmer av Stem Cell og regenerativ medisin Gruppe ved Universitetet i Würzburg for nyttige forslag og Martina Gebhardt samt Heike Arthen for god teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), det tyske departementet for utdanning og forskning BMBF (01 GN 0813), den bayerske forskningsnettverk Induced Pluripotent stamceller "forIPS" og "Stiftung Sibylle Assmus ". Figur 1 ble produsert med Servier Medical Art, tilgjengelig fra www.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
- Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657 (2012).
- Bosnali, M., Edenhofer, F.
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87 (2013).
- Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47 (2014).
- Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
- Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
- Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283 (2005).
- Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252 (2013).
- Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
- Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
- Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145 (2008).
- Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
- Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
- Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
- Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
- Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
- Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
- Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).
