Summary
Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки обеспечивает увлекательные перспективы вывода аутологичных трансплантаций. Тем не менее, прогресс через состояние плюрипотентных и кропотливой повторного дифференцирования еще мешает клиническую перевод. Здесь мы опишем вывод взрослых фибробластов человека и их прямое преобразование в индуцированных клеток нервной предшественников и последующего дифференциации в нейронных линий.
Abstract
Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из взрослых фибробластов кожи и последующего дифференцировке в соматических клетках обеспечивает увлекательные перспективы вывода аутологичных трансплантаций, что обойти гистосовместимости барьеры. Тем не менее, прогресс через состояние плюрипотентных и последующей полной дифференцировки в желаемые линий остается препятствием для клинического перевод технологии IPSC из-за связанных опухолевого потенциала и геномной нестабильности. В последнее время мы и другие показали, что соматические клетки не могут быть преобразованы только в ИПСК, но и в разных типах соматических мультипотентными стволовых клеток с помощью определенных факторов, таким образом, обходя прогрессирование через плюрипотентных государства. В частности, прямое преобразование человеческих фибробластов в индуцированные нервные клетки-предшественники (iNPCs) предвещает возможность нового источника аутологичных клеток для различных применений, таких как замена клеток, заболевания моделированияи скрининг лекарств. Здесь мы опишем изоляции взрослого человека первичных фибробластов по биопсии кожи и их эффективного прямого преобразования в iNPCs своевременной ограниченной экспрессии Oct4, Sox2, Klf4, а также с-Мус. Sox2-положительных нейроэпителиальные колонии появляются после 17 дней индукции и INPC линии могут быть установлены эффективно моноклональных изоляции и расширения. Точная регулировка вирусной множественности инфекции и добавок ингибирующий лейкоз фактор во время фазы индукции представляют критические факторы для достижения эффективности преобразования до 0,2%. До сих пор, конкретного пациента INPC линии может быть расширен более чем на 12 проходов и равномерно отображения морфологические и молекулярные особенности нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников, таких как выражения нестин и Sox2. Линии INPC могут быть дифференцированы в нейроны и астроциты, о чем судили путем окрашивания против TUJ1 и GFAP, соответственно. В заключение, мы сообщают надежные протокол для вывода и тяжелаяПреобразование КТ фибробластов человека в стабильно расширяющихся нейронных клеток-предшественников, которые могли бы обеспечить сотовой источник биомедицинских приложений, таких как аутологичных клеток нервной замены и моделирования заболевания.
Introduction
В 2006 году Яманака и его коллеги смогли показать, впервые возможность перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентных государства 1. Это дедифференцировка было достигнуто гиперэкспрессией четырех факторов транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и C-Мус в мышиных фибробластов. Сформированные так называемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) показывают функциональную эквивалентность эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и, таким образом, могут быть дифференцированы во все типы клеток взрослого организма. Один год спустя перепрограммирования для ИПСК также может быть достигнуто за фибробластов человека 2. Эксперименты на животных моделях показывают, что Ipsc-клеток, полученных как правило, могут быть использованы для клеточной терапии замены, например, в болезни Паркинсона (PD) 3-5. Тем не менее, некоторые ограничения, связанные с использованием ИПСК представляют препятствия для полной реализации их терапевтического потенциала. Прежде всего, перепрограммирования клеток в плюрипотентные состоянии и последующееКонтроль качества, как правило, отнимает много времени и неэффективный процесс уступая в обширных и, таким образом, дорогостоящие процедуры для культивирования клеток. Во-вторых, иПСК должны быть повторно дифференцировать в нужный тип клеток, представляющих интерес до биомедицинского применени, и вероятность остаточных клеток плюрипотентных в дифференцированной популяции таит значительную онкогенного потенциала и, таким образом, показывает высокий риск после трансплантации клеток 6. В-третьих, процесс перепрограммирования, как правило, достигается путем индукции факторы перепрограммирования lenti- или ретровирусной инфекции. Интеграция этих вирусов в геном хозяина, может привести к инсерционного мутагенеза и / или неконтролируемого реактивации трансгенов 7,8. Номера интегративные системы были разработаны для обеспечения факторы перепрограммирования в клетки-мишени, которые минимизируют риск инсерционного мутагенеза и трансгенной реактивации. Примерами таких трансгенных свободной подходов перепрограммирование клеток с использованием не-интеграцииАдено или вирус Сендай 9,10 векторы на основе ДНК 11 или применение методов ДНК-бесплатно, как трансфекции синтетического мРНК 12 или трансдукции рекомбинантных белков 13,14. Другой перспективный метод для вывода трансгенной свободной IPSC является использование LoxP модифицированный лентивирусный перепрограммирования конструкций и последующего удаления трансгенов, используя систему 15,16 рекомбинации Cre-LoxP ДНК.
Более простой подход к генерации нервных клеток для клеточной терапии замены представляет собой прямое преобразование фибробластов в постмитотических нейронов 17-20. Vierbuchen др. Сообщили, что избыточная экспрессия транскрипционных факторов Ascl1, Brn2 и Myt1l результаты в поколение 20% нейронов из мышиных фибробластов 17. В 2011 году было показано, что этот же три фактора транскрипции в сочетании с гиперэкспрессией NeuroD1 включить трансдифференцировки фибробластов человека в NeuРОНС 19. Нейроны человека индуцированных может также быть получены путем избыточной экспрессии Ascl1 и Ngn2 под двойной SMAD- и GSK3β- торможения 20. Примечательно, прямое преобразование фибробластов в нейроны генерирует непролиферативная, постмитотические клеточной популяции, которые не позволяют дальнейшее расширение и Biobanking.
Недавно прямого преобразования фибробластов в пролиферации клеточной популяции нейронных стволовых / клеток-предшественников сообщается 21-26. Для ясности, все эти типы клеток будет называться индуцированных нервных клеток-предшественников (iNPCs) в этом докладе. Хан и др. Сверхэкспрессируется Brn4, Sox2, с-Мус и Klf4 генерировать iNPCs. Как и их коллеги нервных стволовых клеток, полученных из тканей либо основной или плюрипотентных клеток эти iNPCs являются tripotential и может быть дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты 21. Наша группа сообщила немного другой протокол преобразования участием сверхэкспрессию Sox2, Klf4И с-Myc и Oct4 индуцированных выражение только 5 дней. При таком подходе мы могли бы генерировать стабильно пролиферирующих iNPCs из мышиных эмбриональных и взрослых фибробластов, которые обладают полной молчание перепрограммирование факторы 22. В отличие от ИПСК, iNPCs не проявляют онкогенного потенциала после трансплантации 27. Мы успешно использоваться превращают клетки в животной модели демиелинизации миелиновых, дефицитных крыс, демонстрируя, что iNPCs клинически полезны 22. До тех пор, пока НПС может быть генерируется только из плюрипотентных стволовых клеток или первичной нервной ткани 28-32. iNPCs стабильно расширяемая клетки, которые могут быть криоконсервированных и способны дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Много усилий было сделано, чтобы адаптировать прямой протокол преобразования из мыши с клетками человека 23,26,33,34. В 2012 году она была опубликована, что избыточная экспрессия одного фактора Sox2 в фибробластах достаточно для создания мышиных и человеческих iNPCs
Несколько исследований показывают, сотовый функциональность НСК или их дифференцированных коллегами в различных моделях болезни животных. Нервные клетки-предшественники из человеческих плюрипотентных стволовых клеток были пересажены в мышиных моделях заболевания нейровоспалительных склероза 35,36. Применимость чЭСК полученных нервных клеток-предшественников в EAE (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) -mice был впервые показан в 2008 году 35. Мультипотентные нервные клетки-предшественники вводили в желудочки мозга мыши, и результат трансплантацииред в уменьшении клинических признаков ЭАЭ. Ким и др. Генерируются олигодендроглиальным прекурсоров из ЭСК и пересадить тех интрацеребровентрикулярно в EAE-мышей. Хотя пересадка не проживет больше 10 дней, мышей показали значительное улучшение неврологической функции и снижение провоспалительных иммунных клеток в белом веществе 36. Стволовые клеточной терапии применяется также для доклинического адресности болезни Паркинсона, как НПС может быть успешно применен в соответствующих моделях животных. Для этого клетки-предшественники были либо получены из эмбриональной ткани головного мозга 37 дифференцированной из плюрипотентных стволовых клеток или 38-40 мезенхимальных стволовых клеток 41 были использованы. В 2012 году мы показали, что мыши iNPCs способны производить протеолипидного белок, основной компонент миелина белок, после трансплантации в мозг миелин-дефицитных (MD) крыс 22. К этому доказательством правильности принципа эксперимента терапевтический applicabilность iNPCs был, во-первых доказано, и вскоре подтвердил и в другом исследовании 32. Тем не менее, весь потенциал терапевтического использования человеческих iNPCs остается изучить.
Здесь мы показывают надежную и комплексного процесса (I) выводе человека из первичных клеток взрослых пациентов через биопсии кожи, (II) прямое преобразование фибробластов человека в состоянии нервной предшественников и (III) способность iNPCs быть дифференцированы в нейрональный и глиальные линий. Использование этого протокола позволит ускорить генерацию аутологичных клеток человека для терапевтического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человеческие фибробласты, используемые в этом исследовании, были получены от удара кожа биопсии после получения информированного согласия и разрешение этического комитетом по этике Университета Вюрцбурга, Германия (этический доклад не: 96/11 от 10.06.2011).
1. Удар биопсии
- Лечить кожу пациента. Обезболить часть кожи которых биопсия будет взят из (преимущественно меньшей солнце открытые области), используя 0,5 до 1 мл гидрохлорид мепивакаин внутрикожно и подготовить биопсию кожи с помощью стерильного 3мм биопсии удар, промыть биопсию с DPBS + 1 мкл / 1 мл гентамицин и удалить жир. Промыть биопсию дважды DPBS + гентамицин, аспирация DPBS полностью и крышки биопсии с диспаза II (2,4 ед / мл) и инкубируют 16 - 18 ч при 4 ° С.
- Аспирируйте диспазу полностью, дважды промывали DPBS и удалить эпидермис пинцетом. Вымойте биопсии дважды DPBS, добавить 2 мл коллагеназы типа 2 (500 ед / мл ХДС), перевод в 15 мл пробирку и добавляют CollagenaSE до 5 мл Общий объем. Инкубируют в течение 45 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
- Центрифуга 5 мин при 180 мкг и отбросить супернатант после этого. Ресуспендируют осадок в 10 мл DMEM-FCS-гентамицина информации (10% FCS, 1 мкл / мл гентамицина) и центрифугируют снова в течение 5 минут при 180 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 1,5 мл DMEM-FCS-гентамицина-медиа. Трансфер в T25 приверженцем культуры тканей колбы и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.
- Изменить СМИ каждые 3 дня.
- Примерно через 2 недели, когда клетки сливающийся вокруг частей кожи, разделенных клеток с использованием трипсина / EDTA (0,05%): Промывают клетки один раз DPBS, инкубировать 5 мин при 37 ° С, 5% СО 2 после добавления 2 мл трипсин / ЭДТА (0,05%), добавить 2 мл DMEM-FCS-гентамицин-медиа, трансфер в 15 мл пробирку и центрифуги при 180 мкг в течение 5 мин; Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в соответствующем количестве DMEM-FCS-гентамицина-медиа.
- Дальнейшее расширение клеток путем изменения среды каждые 3 гd день и расщепление, как описано выше, когда клетки сливающийся; Добавление гентамицина может быть остановлен после прохождения 2.
- Перед использованием клетки для прямых экспериментов по конверсии, убедитесь, чтобы исключить загрязнение микоплазма стандартными анализами.
- Когда клетки были расширены, вы можете непосредственно начать преобразование или заморозить клетки вниз, используя 10% ДМСО и 90% FCS. Клетки должны быть сохранены в температуре -80 ° С в течение 2 дней и затем переносили в жидкий азот для длительного хранения.
- Для подготовки преобразования, мыть клетки один раз DPBS, аспирации DPBS и добавить 2,5 мл трипсин / ЭДТА (0,05%). Хранить в течение 5 мин при 37 ° С, 5% СО 2. Нажмите колбу осторожно, чтобы отделить клетки, ресуспендируют в 2,5 мл фибробластов сред DMEM (вкл. L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% пирувата натрия) и передать до 15 мл пробирку. Центрифуга при 180 х г в течение 5 мин и надосадочную жидкость аспирации. Ресуспендируют клеток в 1 мл фибробластов СМИ и пипетки вверх и вниз, чтобы генерировать клеточной суспензии. </ LI>
- Подсчитайте количество клеток с использованием Фукс-Rosenthal- или Нейбауэр клеток Счетной палаты и пластины 3 х 10 4 клеток на лунку 24-луночного пластины. Инкубируйте O / N при 37 ° С, 5% СО 2.
2. Заражение человека фибробластов с Сендай вирусов и трансдифференцировки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения безопасности, следующие шаги обработки вирус должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности и ламинарный, и с соответствующей личной безопасности оборудования, особенно хирургической маской, чтобы предотвратить воздействие слизистой.
- Переключатель клетки 100 мкл фибробластов СМИ (этап 1.9). Оттепель аликвот Oct4-, Klf4-, Sox2- и вирус С-Мус-Сэндай и ресуспендируют каждый вирус в 1 мл фибробластов СМИ. Добавить каждый вирус с MOI от 3 до клетки (титр вируса варьируется от партии к партии, но одну аликвоту каждого вируса в общем случае может быть использован для инфицирования 10 лунки 24 луночного планшета) и осторожно перемешать. Выдержите O / N на 37 ° C, 5% CO 2
- Через 24 ч аспирата среды и добавить 500 мкл neuroinduction сред (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, B27 1x, 1% GlutaMAX, 10 нг / мл hLIF, 3 мкМ CHIR99021, 2 мкМ SB431542) и культура на 39 ° C, 5% CO 2 теперь. Изменение СМИ через день.
- На 6-й день после заражения подготовить ЛАМИНИНА покрытием 6-а-пластин: разбавить ламинин 1 мкг / мл в DPBS, добавить 1 мл раствора на 6 а пластин и держать при температуре 4 ° С в течение 24 ч.
- На 7-й день после заражения разделить клеток с использованием DPBS / EDTA: аспирата СМИ и промыть клетки один раз DPBS, затем добавить 500 мкл DPBS / ЭДТА и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
- Добавить 500 мкл DMEM / F12 и удалить суспензию из пластины в 15 мл пробирку и центрифугируют при 180 х г в течение 5 мин.
- Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 1,5 мл neuroinduction сред, пластины на ламинина покрытием 6 хорошо пластин и добавить ингибитор ROCK Y27632 в конечном Concentration 10 мкм в клетки, культуры при 39 ° С, 5% СО 2.
- Изменение СМИ через день.
- Из 14-й день после заражения культуры клеток при 37 ° С, 5% СО 2. Нейроэпителиальные колонии становятся очевидными вокруг 17 день после заражения фазовый контраст микроскопии. Они должны быть достаточно большими, чтобы быть определена по 20-й день после заражения.
3. Выделение колоний Предполагаемые INPC
- Однажды, прежде чем выбрать, пальто один 48 хорошо пластина с ламинином: разбавить ламинин 1 мкг / мл в DPBS, добавить 300 мкл раствора на пластины и держать при температуре 4 ° С в течение 24 ч. Через день аспирации ламинином из пластин и добавить 200 мкл neuroinduction СМИ в лунки.
- Вымойте 6 хорошо пластины, содержащие колонии для определена один раз DPBS и добавить 2 мл DPBS на лунку 6-а пластины. Выберите колонии механически: очистить вокруг колоний, используя тонкую иглу, чтобы избавиться от окружающих клеток; установить 2001; л Pipetman на 50 мкл и забрать колонии, используя соответствующие наконечники.
- Передача одной колонии каждого в одну лунку ламинин покрытием 48 луночного планшета и генерировать суспензии отдельных клеток механически с помощью пипетки вверх и вниз 10 раз. Добавить ингибитор ROCK Y27632 в конечной концентрации 10 мкМ для клеток.
- Выращивают клетки на 48 луночного планшета при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 2 дней. Изменение СМИ через день до тех пор, пока клетки не достигают 80 - 90% слияния (около 3 - 4 дней.).
4. Расширение и Крио-сохранение iNPCs
- Пассирование и расширение iNPCs
- Аспирируйте среду и промыть клетки с DPBS. Аспирируйте DPBS и добавить 200 мкл DPBS / ЭДТА и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2, добавить 200 мкл DMEM / F12 и удалить суспензию из пластины в 15 мл пробирку, центрифуге при 180 х г в течение 5 мин ,
- Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 0,5 мл neuroinduction информации (Этап 2.2), пластина на ламинина покрытием 12-луночных пластин и добавить ингибитор ROCK Y27632 в конечной концентрации 10 мкМ в клетках, культура при 37 ° С, 5% СО 2. После клетки достигают 80 - 90% слияния они могут быть либо расширены или замораживают следующим образом.
- Замораживание iNPCs
- Аспирируйте среду и промыть клетки с DPBS. Аспирируйте DPBS и добавить 300 мкл DPBS / ЭДТА и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2, добавить 300 мкл DMEM / F12 и удалить суспензию из пластины в 15 мл пробирку, центрифуге при 180 х г в течение 5 мин.
- Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 0,5 мл коммерческой НСК замерзания среды. Передача суспензии флаконах замораживания и поместили в камеру заморозки контейнера. Хранить при -80 ° С в течение 2 дней, затем передать в жидком азоте в течение длительного хранения.
5. Дифференциация iNPCs
- Дифференциация к нейронуаль линия
- Культуры клеток на ламинина покрытием пластин, как описано выше. Изменить массовой информации для нейро-дифференциалов СМИ (DMEM / F-12, 1 N2, 1x B27, 300 нг / мл цАМФ, 200 мкМ витамина С, 10 нг / мл BDNF, 10 нг / мл GDNF), когда клетки примерно 70% вырожденная. Изменить СМИ каждый день в течение трех недель. Не разбивать клетки во время дифференцировки.
- После трех недель клетки должны выразить нейронный маркер TUJ1. Чтобы получить более зрелые нейроны и нейронные подтипы продолжают дифференциации до 3 месяцев.
- Дифференциация к глиальных линии
- Изменить массовой информации для глиальных индукции СМИ (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 мкМ β-меркаптоэтанол, 100 мкм несущественные аминокислоты, 1,5 мм L-Глютамин, 5 мкг / мл инсулина, 40 нг / мл Т3) в том числе 20 нг / мл ЭФР, чтобы индуцировать дифференцировку в глиальных клеток-предшественников. Удалить половина средств массовой информации и заменить свежей средой через день в течение 2 недель. В течение этого периода клетки должны быть разделены1: 3 в присутствии 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632 при достижении 100% слияния.
- Через 2 недели дифференцировать клетки дальше в астроциты: когда клетки почти сливающихся изменение информации в коммерческих доступны астроцитов СМИ, изменить СМИ каждый второй день. После примерно 7 дней клетки начинают выражать астроцитов маркеров (например, GFAP). Если клетки получают 100% сливающиеся во время протокола дифференцировки, разделить их в соотношении 1: 2 в присутствии 10 мкМ ингибитора ROCK Y27632.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы представляем описание интегрированного процесса, что позволяет поколение индуцированных нервных клеток-предшественников (iNPCs) из фибробластов человека, которые были получены с помощью биопсии удар с кожи в течение менее чем 8 недель (рис 1). Пациент-iNPCs, специфические может быть дополнительно дифференцируются в нейронных и глиальных линий и гавань огромный потенциал для заместительной клеточной терапии и моделирования заболевания.
Заражение фибробластов с Oct4-, Klf4-, Sox2- и С-myc- Сендай вирусы 23 и культуру в условиях neuroinductive СМИ 22,31 привело к изменению морфологии фибробластов и последующей появлению колоний 17 дней после заражения (рис 2). Получены моноклональные клеточные линии могут быть расширены и пятно положительным для нейронных маркеров стволовых клеток, как Sox2, Sox1, нестин, Виментин, Otx2 и Pax6, а также для распространения маркера Ki67, в то время как они не выражают pluripotency-связанные маркер Oct4 (Рисунок 3).
Кроме того, путем добавления нейрональных факторов роста к клеточной культуральной среде нервные клетки-предшественники могут быть дифференцированы в нейроны. Применяя протокол, основанный на дифференциации Израэля и др. 42 и последующее окончательное дифференцирование линии астроцитов индукции медиа клеток могут также быть дифференцированы в глиальных линий, о чем судили путем анализа типичных морфологических изменений и окрашивания против глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP) (фиг.4 ).
Рисунок 1. Схематическое изображение трехступенчатой протокола, применяемого в этом исследовании. Фибробласты могут быть выделены от пациентов на пункционную биопсию и расширена. Эти клеточные линии могут быть непосредственно превращены в индуцированных мультипотентных нервных клеток-предшественников (iNPCs) и Моnoclonally расширен. INPC линии могут быть использованы для длительного хранения (Biobanking для повторного использования или стандартизированной), или они могут быть дифференцированы в нейронных и глиальных линий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Морфологические анализы прямого преобразования фибробластов человека в индуцированные нейронных клеток-предшественников с использованием фазово-контрастной микроскопии (A) Фибробласты человека три дня после заражения OKSM -. Вируса Сендай и двух дней после добавления neuroinduction среды. Клетки показать типичную фибробластов морфологию. (В) семь дней после заражения клетки с измененной морфологии появляются. Клетки разделены, чтобы уменьшить слияния в тот же день. (С) на десять днейс пост-инфекции только клетки с измененной морфологией присутствуют. (D) Первые небольшие нейроэпителиальные, как колонии могут быть найдены через 17 дней после заражения. Эти колонии увеличиваются в размерах (E), а перерастает клетки могут быть найдены (F) через три дня. Клетки собирают на 21-й день после заражения и расширяемые клеточные линии могут быть получены из них (GI). Различные клоны, показаны в проходе 1 (G), пассаж 3 (Н) и проход 10 (I) после получения, соответственно. Масштаб бар = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Анализ стволовых клеток нервной маркера экспрессии генов генерируемого нервной чел предшественниковл линии. Антитела окрашивание клеточных линий после 10 пассажей показали, что клетки экспрессируют маркеры нервных стволовых клеток Sox1, Sox2 (А), а также Nestin и PAX6 (б). Клетки отрицательный плюрипотентности Oct4 маркер, указывающий отсутствие плюрипотентности (C). Большинство клеток пятно положительным для маркера Ki67, которая показывает высокую пролиферативную состояние (C). Масштаб бар = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Анализ НПС после направленной дифференцировки в нейрональные и глиальных линий. (А) Для достижения нейронов спецификации iNPCs дифференцировались в течение семи дней в присутствии BDNF, GDNF, витамин С и цАМФ. (В) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы показываем, изоляцию и прямое преобразование фибробластов человека в расширяемых трансгенных клеток, свободных нервной предшественников и их дифференцированное потомство как предполагаемого основе для сотового-заместительной терапии или применения в скрининге лекарственных анализов. Прямое преобразование линия соматических клеток в НПС была достигнута вынуждены выражение клонов конкретных факторов транскрипции 26,33,34. Тем не менее, во многих случаях были использованы эмбриональные фибробласты для трансдифференцировки экспериментов 33,34. Для биомедицинских приложений использование этих клеток нецелесообразно, так как это источник клеток исключает клинического использования для аутологичных заместительной клеточной терапии. Недавно были опубликованы исследования, которые описывают генерацию нервных клеток-предшественников из более легкодоступных тканей, таких как кроветворные клетки 43,44. Успешно поколение tripotent нейронных стволовых клеток может быть показано мышиных системы крови В-клеток индуцируемого overexpresion из восьми трансгенов 43. Кроме того, Кастаньо и др. Опубликовали подход к индукции нервных клеток-предшественников из кроветворных клеток человека с использованием Sox2- и с-Мус-вирус Сендай 44. Протокол, описанный позволяет быстро и эффективно поколение нервных клеток от CD133 + клеток пуповинной крови. Тем не менее, при применении для преобразования взрослых мононуклеарных клеток периферической крови протокол дали низкая эффективность и мощность расширение генерируемых клеточных линий было очень ограничено 44. Таким образом, только исследования, опубликованные с клеток периферической крови в человеческом организме на сегодняшний день 44 ясно показывает ограниченность данного типа клеток в прямых экспериментах по конверсии. Поскольку наличие клеток конкретного пациента имеет решающее значение для замены аутологичных клеток, предпочтительным типом клеток все еще представляют взрослых фибробласты, которые могут быть легко получить с помощью пуансона кожи биопсии, как описано в нашем исследовании.
Overexpression трансгенов, необходимых для трансдифференцировки в основном было достигнуто за счет интегративных вирусных векторов 26,33,34. Это затрудняет применимость полученных клеточных линий для биомедицинских приложений, так как интеграция вирусов в геном хозяина, может привести к инсерционного мутагенеза или нежелательного реактивации трансгенов 7,8. Трансдифференцировки в НПС без трансгенов гиперэкспрессией но на основе химической обработки был описан для фибробластов человека 45. Тем не менее, в этом исследовании эти клетки-предшественники присутствовали только в переходном состоянии, как цель исследования состояла в поколение зрелых клеток Шванн 45. Недавно другие трансгенные свободной подходы, основанные на применении вируса Сендай были описаны для прямого преобразования фибробластов человека в НПС 23,44 и, кажется, предпочтительной стратегией на сегодняшний день. Чтобы получить расширяемые НПС, которые могут быть затем дифференцировались в нейрональных и глиальных линий,Применяя сверхэкспрессии всех YAMANAKA-факторов вирусом Сендай с тепловой инактивации вируса 23, а также индукции нервной добавлением небольших молекул в культуральной среде с 22,31 важных модификаций, как описано ниже.
Хотя, в наших руках, протокол эффективно работает со многими фибробластов линии проверенных, есть тенденция, что очевидно, прямое преобразование фибробластов из старых доноров демонстрируя плохое пролиферативного потенциала результат в низкой эффективности генерации INPC. Мы наблюдали колониеобразующих КПД до 0,2% после вирусной трансдукции эффективности более 90%, о чем судили путем инфицирования клеток Oct4 только и последующим окрашиванием. Эта эффективность примерно в 3 раза выше, чем ранее опубликованные 23.
Точно отрегулировать применение оптимизированной вирусной МВД имеет решающее значение. Пакетная изменчивости партии в Сендай титра вирусадолжно быть принято во внимание. Так вирус обычно приобретается в продаже, соответствующую информацию можно найти на домашней странице производителя. Мы предлагаем использовать относительно низкую МВД 3 для трансдифференцировки экспериментов.
Добавление человека LIF в наших руках имеет решающее значение для самообновления установленных линий INPC как было описано для дифференциации плюрипотентных клеток человека в НПС 31. Без добавления LIF, клетки начинают дифференцироваться, как еще два дня после выхода в не-обратимым образом.
Культура клеток после заражения проводят при 39 ° С и не использованием стандартных 37 ° C условий культивирования клеток. Это повышение температуры начинается уже через один день после заражения и приводит к тепловой инактивации вируса Сендай. Культура при 39 ° С до 14 дня после инфицирования является существенным для генерации нейроэпителиальных колоний.
Собственно говоря, иногда INPC колонии приходят позже, чем описано в разделе протокола. По нашему опыту, при условии, что клетки остаются пролиферативная они могут быть поликлонально пассировать и изолированы с помощью ручного сбора. Установленные клеточные линии из этих колоний показывают сходные свойства, как описано в начале, происходящих колоний.
Во время расщепления установленных клеточных линий важно не сеять слишком небольшое количество клеток, поскольку они требуют от клетки к клетке контактов или паракринные сигналы размножаться также. Если клетки высевают в слишком низкой плотности распространения прекратится. В этом случае клетки могут быть спасены replating на клеточной культуральной чашке с меньшим поверхности повторно инициировать пролиферацию.
Для глиальных дифференциации iNPCs очень важно, чтобы отобрать клетки в высокой плотностью и разделить их, когда пластина практически вырожденная. Если клетки делятся слишком рано, преимущественно дифференцировка нейронов будет наблюдаться.
Содержание "> Процесс, описанный в этой рукописи таит потенциал, который будет применен в полу- или полностью автоматизированным способом, который был бы необходим, чтобы достичь желаемого биомедицинских потенциал, в том числе моделирования болезни и заместительной клеточной терапии. Автоматизация также позволит экономически эффективность масштаба и распараллеливание поколения нейронных клеток-предшественников.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех членов Stem Cell и регенеративной медицины группы университета Вюрцбурга за полезные предложения и Мартина Гебхардт, а также Хайке Arthen за отличную техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами от Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), немецкого министерства образования и научных исследований BMBF (01 GN 0813), баварский исследовательской сети индуцированных плюрипотентных стволовых клеток "forIPS" и "Stiftung Sibylle Ассмуса ". На рисунке 1 было получено с использованием Servier Medical Art, доступные из www.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
- Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657 (2012).
- Bosnali, M., Edenhofer, F.
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87 (2013).
- Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47 (2014).
- Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
- Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
- Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283 (2005).
- Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252 (2013).
- Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
- Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
- Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145 (2008).
- Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
- Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
- Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
- Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
- Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
- Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
- Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).
