Summary
유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.
Abstract
체세포에 성인 피부 섬유 아세포에서 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs) 이후 분화의 세대는 조직 적합성 장벽을 우회자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 원하는 계보로 이어지는 완벽한 차별화를 통해 진행하기 때문에 관련 종양 잠재력과 게놈 불안정성의 IPSC 기술의 임상 번역 장애물 남아있다. 최근에, 우리와 다른 체세포만을시켜 만능 상태를 통해 진행을 우회 정의 요소를 이용하여 iPSCs으로뿐만 아니라 다 능성 줄기 세포의 체세포의 다른 유형으로 변환 할 수 없다는 것을 보여 주었다. 특히, 유도 된 신경 전구 세포 (iNPCs)에 인간의 섬유 아세포의 직접 변환은 셀 교체, 질병 모델링과 같은 다양한 애플리케이션을위한 새로운자가 셀 소스의 가능성을 알린다및 약물 검사. 여기, 우리는 적시에 제한 인 Oct4, Sox2이, Klf4의 표현뿐만 아니라, C-Myc와에 의해 iNPCs에 피부 생검과 효율적인 직접 변환하여 성인의 주요 섬유 아 세포의 분리에 대해 설명합니다. SOX2 양성 neuroepithelial 식민지 유도 17 일 후에 나타나며 INPC 라인은 단일 클론 분리 및 확장에 의해 효율적으로 설정할 수 있습니다. 유도 단계에서 감염과 백혈병 억제 인자의 보충의 바이러스 성 다양성의 정확한 조정은 최대 0.2 %의 변환 효율을 달성하기 위해 중요한 요소를 나타냅니다. 지금까지, 환자 맞춤형 INPC 라인은 12 개 이상의 구절에 대한 확장 및 균일하게 네 스틴 및 Sox2이의 발현으로 신경 줄기 / 전구 세포의 형태 학적 및 분자 기능을 표시 할 수있다. 각각 TUJ1 및 GFAP,에 염색하여 판단으로 INPC 라인은 신경 세포와 성상 세포로 분화 할 수있다. 결론적으로 유도하고 디레위한 강력한 프로토콜 신고이러한자가 신경 세포 교체 및 질병 모델링으로 생물 의학 응용 프로그램에 대한 휴대 소스를 제공 할 수 있습니다 안정적으로 확장 신경 전구 세포로 인간 섬유 아세포의 CT 변환.
Introduction
2006 년 야마나카와 동료들은 처음 능성 상태 (1)로, 체세포의 프로그래밍 가능성을 보여줄 수있다. 이 탈분화는 인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 c-Myc와는 쥐의 섬유 아세포에서 네 전사의 과발현에 의해 요인 달성되었다. 생성 된 소위 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)는 배아 줄기 세포 (는 ESC)에 동등한 기능을 보여 주며, 따라서 성인 유기체의 모든 유형의 세포로 분화 될 수있다. 나중에 iPSCs에 재 프로그래밍 한 해는 인간 섬유 아세포이 달성 될 수있다. 동물 모델에서 실험 IPSC 유래 세포는 일반적으로 파킨슨 병 (PD) 등의 세포 대체 요법, 3-5에 사용될 수 있음을 입증한다. 그러나, iPSCs의 사용과 관련된 몇 가지 제한은 치료 가능성의 완전한 실현을위한 방책을 나타냅니다. 만능 상태 이후에 세포의 리 프로그래밍, 우선품질 관리는 일반적으로 시간이 많이 소요되고, 따라서 비용이 많이 드는 광범위한 세포 배양 과정에서 산출 비효율적 과정이다. 둘째, iPSCs 상당한 발암 가능성을 품고 생의학 도장 전에 관심 원하는 세포 유형과 차별화 인구 잔류 다 능성 세포의 확률로 다시 구분 될 필요가있어 세포 이식 6 후의 높은 위험을 표시한다. 셋째, 프로그래밍 프로세스는 일반적 렌티 또는 레트로 바이러스 감염에 의해 재 프로그램 인자를 유도함으로써 달성된다. 숙주 게놈에이 바이러스의 통합은 삽입 성 돌연변이 유발 및 / 또는 유전자 7,8의 제어되지 않은 활성화로 이어질 수 있습니다. 비 통합 시스템은 삽입 성 돌연변이 유발 및 트랜스 활성화의 위험을 최소화하는 표적 세포 리 프로그래밍 요소들을 제공하기 위해 개발되었다. 이러한 유전자가없는 방식의 예로는 비 - 적분을 이용한 세포의 리 프로그래밍 아르아데노 또는 센다이 바이러스 9, 10, DNA 기반 벡터 (11) 또는 재조합 단백질 (13, 14)의 합성 mRNA의 12 또는 전달의 형질 같은 DNA가없는 방법의 응용 프로그램. 트랜스 프리 IPSC의 유도를위한 또 다른 방법은 유망한에 loxP 변성 렌티 프로그래밍 구조와 Cre 호텔-DNA에 loxP 재조합 시스템 (15, 16)를 사용하여 유전자의 삭제 이후의 사용이다.
세포 대체 요법은 포스트 - 유사 분열 뉴런 17-20으로 섬유 아세포의 직접 변환을 나타낸다위한보다 간단한 방법은 신경 세포를 생성한다. Vierbuchen 등은. 전사의 과발현은 쥐의 섬유 아세포를 17에서 20 %의 신경 세포의 생성에 Ascl1, Brn2 및 Myt1l 결과를 요인 보도했다. 그것은 2011 년 NeuroD1 과발현과 조합 같은 세 가지 전사 인자가 NEU로 인간 섬유 아세포의 분화를 사용하는 것이 도시되었다rons 19. 인간 유도 된 신경 세포는 또한 듀얼 SMAD-과 GSK3β- 억제 (20) 아래 Ascl1과 Ngn2의 과발현에 의해 생성 될 수있다. 특히, 신경 세포에 섬유 아 세포의 직접 변환은 추가 확장 및 biobanking을 허용하지 않는 비 증식, 후 유사 분열 세포 인구를 생성합니다.
최근, 신경 줄기 증식 / 전구 세포 집단으로 섬유 아세포의 직접 변환은 21-26을보고 하였다. 명확성을 위해, 모든 세포 유형은이 보고서에서 유도 된 신경 전구 세포 (iNPCs)로 지정됩니다. 한 등은. iNPCs를 생성하는 Brn4, Sox2이, C-Myc와 Klf4과를 과발현. 기본 조직 또는 만능 중 세포에서 파생 된 자신의 신경 줄기 세포의 대응과 마찬가지로이 iNPCs는 tripotential하고 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포 (21)로 분화 될 수있다. 우리 그룹은 Sox2이, Klf4의 과발현을 포함하는 약간 다른 변환 프로토콜을보고, C-Myc와와 5 일 동안 유도 인 Oct4 표현합니다. 이 방법을 우리는 재 프로그래밍 (22) 요인의 완전한 침묵을 나타내는 쥐의 배아와 성인 섬유 아세포에서 안정적으로 증식 iNPCs을 생성 할 수 있습니다. iPSCs는 대조적으로, iNPCs 이식 27 일 후 종양 가능성을 나타내지 않는다. 우리는 iNPCs 임상 (22) 유용한 것으로 보여, 동물 탈수 초화의 모델, 수초 결핍 쥐에서 성공적으로 세포를 변환 할 때 사용합니다. 그때까지의 NPC은 다 능성 줄기 세포 또는 기본 신경 조직 28-32에서 생성 될 수있다. iNPCs는 동결 보존 및 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포로 분화 할 수있는 수를 안정적으로 확장 세포이다. 많은 노력이 인간의 세포 23,26,33,34 마우스에서 직접 변환 프로토콜을 적응하기 위해 만들어졌다. 2012 년은 섬유 아세포의 단일 요인 Sox2이의 과발현은 쥐와 인간의 iNPCs를 생성하는 데 충분하다고 출판 되었음
몇몇 연구 NSCs의 또는 다른 동물 질병 모델에서의 분화 세포의 대조 기능을 보여준다. 인간 다 능성 줄기 세포로부터 신경 전구 세포가 여러 35,36 경화증 신경 염증성 질환의 마우스 모델에 이식 하였다. EAE에 hESC의 유래 신경 전구 세포의 적용 (실험자가 면역 뇌척수염) 때문이야 먼저 2008 35에 도시 하였다. 능성 신경 전구 세포는 마우스 뇌의 심실에 주입하고, 이식 결과EAE의 임상 증상의 감소에 에드. Kim 등. 인간 배아 줄기 세포로부터 희 돌기 전구체를 생성 EAE-마우스로 뇌 실내 사람들을 이식. 이식이 10 일 이상 생존하지 않았지만, 마우스는 신경 학적 기능과 백질 (36)의 염증성 면역 세포의 감소의 상당한 개선을 보여 주었다. 줄기 세포 치료는 또한 NPC가 성공적으로 각각의 동물 모델에서 이용 될 수 있기 전임상 파킨슨 병 타겟팅 적용되었다. 이를 위해 전구 세포는 어느 능성 줄기 세포를 38 ~ 40 또는 41을 사용 하였다는 중간 엽 줄기 세포로부터 분화 태아 뇌 조직 (37)로부터 유래되었다. 2012에서는 마우스 iNPCs는 미엘린 결손 (MD) (22) 쥐의 뇌에 이식 후 테오 단백질, 주요 미엘린 단백질 성분을 생산할 수 있음을 보여 주었다. 그 원리 증명 실험 치료 applicabil으로iNPCs의 성만이 먼저 입증 곧 또 다른 연구 (32)에 의해 확인되었다. 그러나, 인간의 iNPCs의 치료 적 사용의 잠재력을 탐구 일이다.
여기에 우리가 피부 조직 검사를 통해 성인 환자에서 인간의 일차 전지의 (I) 유도의 강력하고 통합 된 과정을 보여, (II) 신경 전구 상태와 iNPCs의 (ⅲ) 능력으로 인간의 섬유 아 세포의 직접 변환은 신경 세포로 분화 할 그리고 아교 계통. 이 프로토콜의 사용은 치료 응용 프로그램에 대한자가 인간 세포의 생성을 가속화하는 데 도움이 될 것입니다.
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Protocol
이 연구에 사용 된 인간의 섬유 아세포는 뷔르츠부르크, 독일 대학의 윤리위원회의 동의와 윤리 허가를 통보받은 후 피부 펀치 생검에서 얻었다 (윤리적 보고서 번호 : 11분의 96 2011년 10월 6일 일자).
1. 펀치 생검
- 환자의 피부를 소독. 피내 0.5 ml의 1에 mepivacaine 염산염을 사용하여 조직 검사가 (우선적으로 덜 태양에 노출 된 지역)에서 촬영 될의 피부 부분을 마취 및 멸균 3mm 생검 펀치를 사용하여 피부 조직 검사를 준비, DPBS와 조직 검사 + 1 μL / 1ml를 젠타 마이신을 씻어 제거 지방. DPBS + 겐타 마이신, 스파 아제 (Dispase) II를 흡인 DPBS 완전히 커버 생검 (2.4 U / ml)로 두 번 생검을 씻어 16 품어 - 4 ℃에서 18 시간을.
- 대기음 스파 아제 (Dispase) 완전히 DPBS로 두 번 씻어 핀셋으로 표피를 제거합니다. 15 ML 튜브에서, 전송 2 ml의 콜라게나 제 2 형 (500 U / ㎖ CDU)을 추가, DPBS로 두 번 생검을 씻고 Collagena 추가SE 최대 5 ml의 총 부피. 37 ° C, 5 % CO 2에서 45 분 동안 인큐베이션.
- 원심 분리기 (5) 180 XG에 분, 그 후 상층 액을 버린다. 180 x g에서 5 분 다시 10 ml의 DMEM-FCS-겐타 마이신 미디어 (10 % FCS, 1 μL / ㎖ 젠타 마이신)과 원심 분리기를 Resuspend 펠렛. 1.5 ml의 DMEM-FCS-겐타 마이신 미디어에서 뜨는에 resuspend 펠렛을 폐기하십시오. 자기편 조직 배양 플라스크 T25, 37 ° C, 5 % CO 2에서 부화 전송합니다.
- 3 일마다 미디어를 변경합니다.
- 후 약 2 주, 세포가 피부 부품, 트립신 / EDTA (0.05 %)를 사용하여 분할 세포 주위에 컨 플루 언트 때 : 세척 세포를 한 번 DPBS로, 37 ℃에서 5 분을 품어, 5 % CO 2 2 ㎖의 트립신 / EDTA를 첨가 한 후 (0.05 %), DMEM-FCS-겐타 마이신 미디어 2 ㎖를 추가 5 분 동안 180 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기로 전송; DMEM-FCS-겐타 마이신 미디어의 적절한 양 뜨는에 resuspend 펠렛을 폐기합니다.
- 또한 매체마다 3 R을 변화시킴으로써 세포를 확장세포가 합류 할 때 전술 한 바와 같이 D의 하루 분할; 겐타 마이신이 첨가 경과 후 정지 될 수있다.
- 직접 변환 실험에 대한 세포를 사용하기 전에, 표준 분석에서 마이코 플라스마 오염을 제외해야합니다.
- 세포가 확장되었을 때, 당신은 직접 변환을 시작하거나 10 % DMSO 90 % FCS를 사용하여 세포를 정지 할 수 있습니다. 세포를 2 일 동안 -80 ° C에 저장하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 전송되어야한다.
- 변환의 준비를위한, DPBS, 흡인 DPBS 한 번 세포를 씻으 2.5 ml의 트립신 / EDTA (0.05 %)를 추가합니다. 37 ℃, 5 % CO 2에서 5 분 동안 유지합니다. 탭 플라스크 부드럽게 섬유 아세포 배지 2.5 ㎖ (DMEM 포함. L-Glu가 + 10 % FCS + 1 % NEAA + 1 % 나트륨 피루 베이트)에 재현 탁을 세포를 분리하고 15 ㎖의 튜브로 전송. 5 분 180 XG에 원심 분리기와 뜨는을 대기음. 1 ml의 아래로 섬유 아세포 미디어와 피펫 위로에 재현 탁 세포는 단일 세포 현탁액을 생성합니다. </ 리>
- Fuchs의-Rosenthal- 또는 노이 바 우어 - 셀 카운팅 챔버와 플레이트 24 웰 플레이트의 웰 당 3 × 104 세포를 이용하여 세포의 수를 계산. 37 ℃, 5 % CO 2에서 O / N을 품어.
센다이 바이러스와 분화 인간의 섬유 아세포 2. 감염
주 : 바이러스 운반 다음 단계 생물학적 안전 캐비넷과 층류 후드에서 점막 노출을 방지하기 위해 적절한 보호 장비, 특히 외과 마스크로 수행 될 필요가, 안전성을 보장한다.
- 100 μL 섬유 아세포 미디어 (단계 1.9)에 세포를 전환합니다. Oct4-, Klf4-, Sox2-의 분취 및 C-myc의 - 센다이 바이러스를 해동하고 1 ml의 섬유 아세포 미디어에 각각의 바이러스를 재현 탁. 셀 3의 관성 모멘트 (바이러스 역가가 많은에 많이 다릅니다 만, 각각의 바이러스 중 하나 나누어지는 일반적으로 24 잘 플레이트의 10 우물의 감염에 사용할 수 있습니다) 각 바이러스를 추가하고 부드럽게 섞는다. 37 ℃, 5 % CO 2에서 O / N을 품어
- 24 시간의 흡인 후 매체와 neuroinduction 미디어 (: 1 DMEM / F-12로 Neurobasal, 1X N2, 1X B27, 1 % 루타, 10 NG / ㎖ hLIF, 3 μm의 CHIR99021, 2 μm의 SB431542 1)의 500 μl를 추가 지금부터 39 ° C, 5 % CO 2에서 문화. 매일 미디어를 변경합니다.
- , DPBS에 1 μg의 / ml의 라미닌을 희석 6 잘 판에 액 1ml를 추가하고 24 시간 동안 4 ° C에서 유지 : 1 일 6 일 감염 후 라미닌 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다.
- 미디어를 기음과 DPBS 한 번 세포를 세척 한 후 DPBS / EDTA의 500 μl를 추가하고 37 ℃, 5 % CO 2에서 10 분 동안 품어 : 7 일에 감염 후 DPBS / EDTA를 사용하여 세포를 분리.
- DMEM / F12 500 μl를 추가하고 5 분 동안 180 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 판에서 정지를 제거합니다.
- 뜨는을 기음과 neuroinduction 미디어, 라미닌 코팅 6 잘 접시에 플레이트의 1.5 ml의 펠렛을 재현 탁하고 최종 conce 락 억제제 Y27632 추가39 ° C에서 세포 배양에 10 μM의 ntration, 5 % CO 2.
- 매일 미디어를 변경합니다.
- 감염 배양 후 14 일째부터 37 ° C에서 세포, 5 % CO 2. Neuroepithelial 식민지는 위상차 현미경에 의한 감염 후 하루 (17)의 주위에 명확하게. 그들은 감염 후 20 일 주위에 뽑힐 정도로 커야한다.
추정 적 INPC의 식민지 3. 분리
- 따기 전에 어느 날, 코트 한 48 라미닌 잘 플레이트 : DPBS에 1 μg의 / ml의 라미닌을 희석 판에 솔루션 300 μl를 추가하고 24 시간 동안 4 ℃에서 보관하십시오. 어느 날 후에 흡인 라미닌 판에서와 우물에 neuroinduction 매체의 200 μl를 추가합니다.
- 6 잘 플레이트 잘 당 6 잘 플레이트 식민지를 포함하는이 DPBS 한 번 포착하고 추가 할 2 ML의 DPBS을 씻으십시오. 기계적으로 식민지를 선택 : 세포를 둘러싼 제거하는 얇은 바늘을 사용하여 식민지 주위 긁어; (200)를 설정1, L 50 μL에 pipetman과 각각의 피펫 팁을 사용하여 식민지를 선택합니다.
- 라미닌 코팅 48 잘 플레이트 잘 하나에 하나의 식민지 각 이동 및 아래로 10 회를 피펫 팅에 의해 기계적으로 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 세포에 10 μm의 최종 농도 락 억제제 Y27632를 추가합니다.
- 2 일 동안 37 ℃, 5 % CO 2에서 48 잘 접시에 세포를 성장. 90 % 컨 플루 (약 3 - -. 4 일) 세포가 80에 도달 할 때까지의 모든 둘째 날 미디어를 변경합니다.
4. 확장 및 iNPCs의 곳을 알아내는 보존
- 계대 및 iNPCs 확대
- 매체를 기음과 DPBS로 세포를 씻어. DPBS를 대기음 200 μL의 DPBS / EDTA를 추가하고, 37 ℃, 5 % CO 2에서 10 분 동안 품어, 추가 DMEM / F12 200 μl를 5 분 동안 180 XG에, 15 ML 튜브에 판에서 원심 분리기를 정지 제거 .
- 뜨는을 기음과 neuroi 0.5 ml의 펠렛을 재현 탁nduction 미디어 (2.2 단계), 라미닌 코팅 12 잘 접시에 플레이트와 세포에 10 μm의 최종 농도 락 억제제 Y27632를 추가, 37 ° C에서 문화, 5 % CO 2. 세포가 80에 도달 한 후 - 90 % 포화 상태 그들 중 하나를 추가로 확장 할 수 있습니다 또는 다음과 같이 아래로 고정.
- iNPCs의 동결
- 매체를 기음과 DPBS로 세포를 씻어. 기음 DPBS와 300μl DPBS / EDTA를 추가하고, 37 ℃, 5 % CO 2에서 10 분 동안 품어, DMEM / F12 300 μl를 추가하고 5 분 동안 180 XG에, 15 ML 튜브에 판에서 원심 분리기를 정지를 제거합니다.
- 뜨는을 대기음 및 상업 NSC 동결 매체의 0.5 ml의 펠렛을 재현 탁. 냉동 유리 병에 전송 중단 및 세포 냉동 컨테이너에 넣어. 2 일간 -80 ° C에서 보관 후 장기간 저장을 위해 액체 질소로 옮긴다.
iNPCs 5. 차별화
- 뉴런으로 차별화알 계보
- 라미닌 - 코팅 된 플레이트에서 배양 된 세포를 전술 한 바와 같이. 세포는 약 70 %이다 신경 DIFF 미디어 (DMEM / F-12, 1X N2, 1X B27, 300 NG / ㎖ 캠프, 200 μm의 비타민 C, 10 NG / ㎖ BDNF, 10 NG / ㎖ GDNF) 미디어를 변경 합류. 3 주 동안 매일 미디어를 변경합니다. 분화 동안하지 분할 세포를 수행합니다.
- 삼주 후 세포는 신경 세포 마커 TUJ1을 표현한다. 더 성숙한 신경 세포를 얻고 신경 하위 유형 3 개월 차별화까지 계속합니다.
- 아교 혈통으로 차별화
- 아교 유도 매체 (1 미디어를 변경 : 1 DMEM / F-12로 Neurobasal, 1X N2, 1X B27, 10 μM의 β - 머 캅토 에탄올, 100 μm의 비 필수 아미노산, 1.5 mM의 L 글루타민, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 각 40ng / ㎖의 T3) 20 NG / ㎖ EGF는 신경교 전구 세포로의 분화를 유도하는 방법 등. 미디어의 절반을 제거하고 약 2 주 동안 매일 신선한 매체로 대체합니다. 이 기간 동안 세포는 분리되어야한다1 : 100 % 컨 플루 언시가 10 μM ROCK Y27632 억제제의 존재하에 3에 도달 할 때.
- 세포가 상업 사용할 수 성상 세포 미디어에 거의 합류 변경 미디어 때마다 둘째 날 미디어를 변경 : 2 주 후 더 성상 세포에 세포를 분화. 약 7 일 후 세포 성상 세포 마커 (예를 들어, GFAP)을 표현하기 시작합니다. 10 μm의 ROCK 억제제 Y27632의 존재 2 비율 : 세포 분화 프로토콜 동안 100 % 합류를 얻을 경우, 1을 분할합니다.
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Representative Results
여기에서는 이하 8주 (도 1) 내에서 피부 생검 펀치에 의해 수득 된 인간 섬유 아세포에서 유도 된 신경 전구 세포 (iNPCs)의 생성을 허용하는 통합 공정에 대한 설명을 제시한다. 환자로, 특정 iNPCs 더 신경 세포와 교세포 계보로 분화 및 세포 대체 요법과 질병 모델링을위한 거대한 잠재력을 정박 할 수있다.
Oct4-, Klf4-, Sox2- 및 C-myc- 센다이와 섬유 아 세포의 감염은 섬유 아세포와 십칠일 감염 후 식민지의 후속 출현의 형태의 변화 결과 neuroinductive 미디어 조건 22,31에서 23과 문화를 바이러스 (그림 2). 그들은 pluripotency-을 표현하지 않는 반면, 생성 된 단일 클론 세포 라인 확장 및 Sox2이, Sox1, 네 스틴, 멘틴,의 Otx2 및 PAX6 같은 신경 줄기 세포 마커에 대한 긍정적 인 얼룩뿐만 아니라 증식 마커 사료된다 위해 할 수 있습니다관련 마커 인 Oct4 (그림 3).
또한, 세포 배양 배지에 신경 성장 인자를 첨가함으로써 신경 전구 세포는 신경 세포로 분화 될 수있다. 글 리아 섬유 성 산성 단백질에 대해 전형적인 형태 학적 변화 및 염색 (GFAP) (도 4의 분석에 의해 판정 된 바와 같이 Izrael에 기초하여 분화 프로토콜을 적용함으로써 외. (42) 및 성상 세포 유도 미디어 세포주 후속 최종 분화는 아교 계통으로 분화 될 수있다 ).
도 1 도식이 연구에 적용 세 단계 프로토콜의 표현. 섬유 모세포는 펀치 생검에 의해 환자로부터 단리 및 확장 될 수있다. 이들 세포주는 직접 유도 된 다 능성 신경 전구 세포 (iNPCs) 및 MO로 변환 할 수있다noclonally 확대했다. INPC 라인 (반복 또는 표준화 된 사용 biobanking) 장기 저장을 위해 사용 될 수도 있고 신경 세포와 교세포 계보로 분화 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2. 형태학은 위상차 현미경을 사용하여 유도 된 신경 전구 세포로 인간 섬유 아세포의 직접 변환 분석 (A) 인간의 섬유 아세포 삼일 OKSM 감염 후 -. 센다이 바이러스와 neuroinduction 배지의 첨가 후 2 일입니다. 세포는 일반적으로 섬유 아세포와 같은 형태를 보여줍니다. (B) 세븐 일 변경된 형태 쇼까지 감염 세포를 게시합니다. 세포를 같은 날에 생장을 줄이기 위해 분할되어있다. (C) 십일S 포스트 감염은 변경된 형태학을 가진 세포는 존재한다. (D) 제 1 미소 neuroepithelial 같은 콜로니 십칠일 감염 후 발견 될 수있다. 이러한 콜로니의 크기 (E)의 증가와 세포 벗어나지 세 일 후 (F)을 찾을 수있다. 세포는 21 일 후 감염과 확장 세포주 그들 (GI)에서 생성 할 수 있습니다에 선택됩니다. 다른 클론은 각각 따기 후 통로 1 (G), 통로 (3) (H) 및 통로 (10) (I)로 표시됩니다. 스케일 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생성 된 신경 전구 CEL의 신경 줄기 세포 마커 유전자 발현의 분석도 3L 라인. 세포주의 항체 염색 (10) 통로가 세포는 신경 줄기 세포 마커 Sox1, Sox2이 (A)뿐만 아니라, 네 스틴 및 PAX6 (B)을 표현하는 것으로 밝혀 후. 세포는 만능 (C)의 부재를 나타내는 만능 마커 인 Oct4 부정적이다. 세포의 대부분은 높은 증식 상태를 나타내는 마커 사료된다, (C)에 대한 양성 염색. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
엔피씨 그림 4. 분석 후 신경 세포와 교세포 계통으로 분화를 지시했다. 신경 사양 iNPCs을 달성하기 위해 (A)가 BDNF, GDNF, 비타민 C 및 캠프의 존재 이레 동안 분화시켰다. (B) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 고립과 확장 형질 전환 유전자가없는 신경 전구 세포로 인간의 섬유 아 세포의 직접 변환 및 세포 대체 요법 또는 약물 검사 분석의 응용 프로그램에 대한 추정 근거로 그들의 차별화 된 자손을 보여줍니다. NPC들에 체세포의 직접 혈통 변환은 혈통 특정 전사의 강제 식 26,33,34 요인에 의해 달성되었다. 그럼에도 불구하고, 많은 경우에 태아 섬유 아세포는 분화 실험 33, 34을 사용 하였다. 이 셀 소스는자가 세포 대체 요법에 대한 임상 적 사용을 배제 같은 생의학 애플리케이션이 세포의 사용은 부적당하다. 최근 연구는 조혈 세포 43,44 같은보다 쉽게 접근 조직에서 신경 전구 세포의 생성을 설명하는 발표되었다. tripotent 신경 줄기 세포의 성공적인 생성을 유도하여 뮤린 overexpr 혈액 유래의 B 세포에 대해 도시 될 수있다팔 유전자 (43)의 esion. 또한, 카스타 등은. 인간의 Sox2-을 사용하여 조혈 세포와 C-myc의-센다이 바이러스 (44)에서 신경 전구 세포의 유도에 대한 접근 방식을 발표했다. 프로토콜 CD133 + 제대혈 세포로부터 신경 세포의 신속하고 효율적인 생성을 가능 바와. 성인 말초 혈액 단핵 세포의 변환을 위해 적용된 경우에는, 프로토콜은 낮은 효율과 생성 된 세포주의 확장 능력은 매우 제한되었다 (44)을 수득 하였다. 따라서, 일 (44) 인간 시스템의 말초 혈액 세포를 발행 만 연구 명확 직접 변환 실험에서 특정 세포 유형의 한계를 나타낸다. 환자 별 셀들의 가용성 세포자가 대체 위해 매우 중요하기 때문에, 바람직한 세포 유형은 여전히 연구에 기술 된 바와 같이 용이하게 피부 펀치 생검을 통해 유도 될 수 성인 섬유 아세포를 나타낸다.
overexpre분화에 필요한 유전자의 ssion은 대부분 통합 바이러스 벡터 26,33,34에 의해 달성되었다. 숙주 게놈 내로 바이러스의 통합이 삽입 성 돌연변이 유발 또는 트랜스 -7,8-의 원치 않는 활성화를 초래할 수 있으므로이 생의학 애플리케이션 유래 세포주의 적용을 방해한다. 유전자 과발현없이 NPC들로 분화하지만 화학적 처리에 기초하여 인간 섬유 아세포 (45)에 대해 설명 하였다. 연구의 목적은 성숙한 슈반 세포 (45)의 생성되었다 그러나, 본 연구에서 이들 전구 세포가 과도 상태로만 존재 하였다. 최근, 센다이 바이러스의 응용 프로그램을 기반으로 다른 형질 전환 유전자가없는 접근 방식의 NPC 23,44으로 인간의 섬유 아 세포의 직접 변환에 대한 설명과 최신 선호하는 전략으로 보인다되었다. 이후 신경 세포와 교세포 계보로 분화 할 수있는 확장의 NPC를 유도하기 위해,이하에 기술 된 바와 같이 우리는 중요한 수정을 배양액 22,31 작은 분자의 첨가에 의해 바이러스의 열 (23)의 불 활성화는 물론 신경 유도 함께 센다이 바이러스의 모든 야마나카 인자 과발현을 적용한다.
우리 손에, 프로토콜은 효과적으로 테스트 많은 섬유 모세포 라인과 협력 비록, 이전 기증자로부터 섬유 아세포의 직접 변환은 INPC 발생의 낮은 효율의 나쁨 증식 잠재력 결과를 나타내는 것이 명백한 경향이있다. 우리는 인 Oct4 만 이후 염색으로 세포의 감염에 의해 판단으로 90 % 이상의 바이러스 전달 효율 후 최대 0.2 %의 효율을 형성 식민지를 관찰했다. 이 효율은 23 이전에 간행보다 약 3 배 더 높다.
최적화 된 바이러스 방어의 정밀하게 조정 된 응용 프로그램은 매우 중요하다. 센다이 바이러스 역가에 배치 변화에 배치고려되어야한다. 바이러스는 일반적으로 상업적으로 획득되기 때문에, 각각의 정보는 제조사의 홈페이지에서 찾을 수있다. 우리는 분화 실험을 위해 3의 상대적으로 낮은 관성 모멘트를 사용하는 것이 좋습니다.
NPC가 31로, 인간 다 능성 세포의 분화에 대해 기재 한 바와 같이 우리 손 인간 LIF를 첨가 확립 INPC 선의 자기 갱신 중요하다. LIF 첨가하지 않은 세포는 빠르면 이틀 비가역 방식으로 철수 후와 같이 차별화하기 시작한다.
감염 후 세포 배양은 39 ℃에서 수행하고 37 ° C 표준 세포 배양 조건을 이용하지 않는다. 이러한 온도 상승은 언젠가 감염 후 이미 시작 센다이 바이러스의 열 불 활성화에 이르게. 감염 후 14 일까지 39 ° C에서 문화는 neuroepithelial 식민지의 생성에 필수적이다.
사실, 때로는 INPC 식민지는 프로토콜 절에서 설명하는 것보다 나중에 온다. 우리의 경험에 의하면, 한 세포가 증식 남아 그들은 polyclonally 계대 할 수 있으며 수동 따기에 의해입니다. 초기 발생 콜로니에 대하여 기술 된 바와 같이 이들 콜로니로부터 확립 된 세포주는 유사한 특성을 나타낸다.
확립 된 세포주를 분리하는 동안 그들은 잘 증식하는 세포 간 접촉 또는 분비 신호를 필요로 세포의 수가 너무 작은 종자하지 않는 것이 중요하다. 세포를 접종하는 경우 너무 낮은 밀도의 증식이 정지된다. 이러한 경우에, 세포 증식을 다시 시작하도록 작은 표면 세포 배양 접시에 replating 의해 구조 될 수있다.
iNPCs의 폐해 분화 이것은 고밀도 셀 시드 및 플레이트 거의 합류 때 이들을 분리하는 것이 매우 중요하다. 세포가 너무 일찍 분리하는 경우, 주로 신경 세포의 분화가 관찰됩니다.
콘텐츠 ">이 논문에 설명 된 프로세스는 반 또는 완전 자동 방식으로 적용 할 수있는 잠재적 인 질병 모델링 및 세포 대체 요법을 포함하여, 목적하는 생물 의학적 가능성을 달성하기 위해 필요한 것 항구. 자동화 또한 비용을 가능하게 할 신경 전구 세포의 생성을 효율적으로 스케일 업 및 병렬화.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
우리는 우수한 기술 지원을위한 유용한 제안과 마티 나 겝 하르트뿐만 아니라 헤이 케 Arthen의 줄기 세포와 뷔르츠부르크 대학의 재생 의학 그룹의 모든 회원들에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), 교육의 독일 연구부 BMBF (0813 01 GN), 바이에른 연구 네트워크 유도 만능 줄기 세포 "forIPS"와 "재단 Sibylle Assmus에서 보조금에 의해 지원되었다 ". 그림 1 www.servier.com에서 사용할 수 Servier에 의료 아트를 사용하여 제조 하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
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