Summary
Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.
Abstract
Génération de cellules souches induites pluripotentes (CSPi) à partir de fibroblastes adultes de la peau et de la différenciation subséquente dans des cellules somatiques fournit des perspectives fascinantes pour la dérivation de greffes autologues qui contournent les barrières d'histocompatibilité. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et la différenciation complète subséquente en lignées désirées reste un obstacle pour la traduction clinique de la technologie iPSC raison de l'instabilité génomique potentiel et néoplasiques. Récemment, nous et d'autres avons montré que les cellules somatiques peuvent non seulement être converties en CSPi mais aussi en différents types de cellules souches somatiques multipotentes en utilisant des facteurs définis, contournant ainsi la progression à travers l'état pluripotent. En particulier, la conversion directe de fibroblastes humains en cellules progénitrices neurales induites (iNPCs) annonce la possibilité d'une source cellulaire autologue roman pour diverses applications telles que le remplacement de la cellule, la modélisation des maladieset le dépistage de la drogue. Ici, nous décrivons l'isolement des adultes fibroblastes primaires humains par biopsie de la peau et de leur conversion directe efficace en temps opportun iNPCs par l'expression restreinte de Oct4, Sox2, Klf4, ainsi que c-Myc. Colonies neuroépithéliales Sox2 positifs apparaissent après 17 jours d'induction et de lignes INPC peuvent être établies de manière efficace par l'isolement et l'expansion monoclonal. Réglage précis de la multiplicité de l'infection virale et la supplémentation du facteur inhibiteur de la leucémie au cours de la phase d'induction représentent des facteurs critiques pour atteindre des rendements de conversion de jusqu'à 0,2%. Jusqu'à présent, les lignes INPC spécifiques au patient pourraient être élargis pour plus de 12 passages et uniformément présentent des caractéristiques morphologiques et moléculaires de cellules souches / progénitrices neurales, comme l'expression de la nestine et Sox2. Les lignes INPC peuvent être différenciées en neurones et les astrocytes comme jugé par coloration TUJ1 et contre GFAP, respectivement. En conclusion, nous rapportons un protocole robuste pour la dérivation et de direconversion de ct de fibroblastes humains en cellules progénitrices neurales stable extensibles qui pourraient fournir une source cellulaire pour des applications biomédicales telles que le remplacement des cellules neurales autologue et de la modélisation de la maladie.
Introduction
En 2006 Yamanaka et ses collègues ont pu montrer pour la première fois la possibilité d'une reprogrammation de cellules somatiques dans un état pluripotent 1. Cette dédifférenciation a été obtenue par la surexpression de quatre facteurs de transcription Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc dans des fibroblastes murins. Les dits induits des cellules souches pluripotentes générés (CISP) montrent l'équivalence fonctionnelle de cellules souches embryonnaires (CSE) et peuvent donc être différenciées en tous les types de l'organisme adulte cellulaires. Un an plus tard, à la reprogrammation CSPi pourrait aussi être atteint pour les fibroblastes humains 2. Des expériences sur des modèles animaux démontrent que les cellules iPSC dérivés peuvent généralement être utilisées pour la thérapie de remplacement cellulaire, par exemple dans des maladies (le PD) de Parkinson 5.3. Cependant, plusieurs limites associées à l'utilisation des CSPi représentent barrages routiers pour la pleine réalisation de leur potentiel thérapeutique. De tous, la reprogrammation de cellules d'abord dans un état pluripotent et aprèscontrôle de la qualité est généralement un temps et processus inefficace rendement dans les procédures de culture cellulaire vastes et donc coûteuses. Deuxièmement, iPSCs doivent être re-différencié dans le type cellulaire souhaité d'intérêt avant l'application biomédicale et de la probabilité de cellules pluripotentes résiduels dans la population différenciée recèle un important potentiel tumorigène et affiche ainsi un risque élevé après la transplantation de cellules 6. En troisième lieu, le processus de reprogrammation est habituellement obtenue en induisant les facteurs de reprogrammation par infection rétrovirale ou lenti-. L'intégration de ces virus dans le génome de l'hôte pourrait conduire à la mutagenèse par insertion et / ou la réactivation incontrôlée des transgènes 7,8. Les systèmes non-intégration ont été développés pour fournir les facteurs de reprogrammation pour cibler les cellules, ce qui minimise le risque de mutagenèse insertionnelle et transgène réactivation. Des exemples de ces approches sans transgène sont la reprogrammation de cellules en utilisant non-intégrationAdeno virus Sendai ou 9,10, vecteurs à base d'ADN 11 ou l'application de méthodes exempts d'ADN, comme la transfection de l'ARNm synthétique 12 ou transduction de protéines recombinantes 13,14. Un autre procédé prometteur pour la dérivation de iPSC libre transgène est l'utilisation de constructions de reprogrammation loxP lentiviral modifié et suppression ultérieure de transgènes en utilisant le système de recombinaison Cre-loxP ADN 15,16.
Une approche plus simple pour générer des cellules neurales pour la thérapie de remplacement de la cellule représente la conversion directe des fibroblastes en neurones post-mitotiques 17-20. Vierbuchen et al. A rapporté que la surexpression de facteurs de transcription ASCL1, Brn2 Myt1l et des résultats dans la production de 20% des neurones à partir de 17 fibroblastes murins. En 2011, il a été montré que les trois mêmes facteurs de transcription, en combinaison avec la surexpression de NeuroD1 permettent transdifférenciation des fibroblastes humains en neurons 19. neurones humaines induite pourraient également être générés par la surexpression de Ascl1 et Ngn2 sous double SMAD- et GSK3β- inhibition 20. Notamment, la conversion directe des fibroblastes en neurones génère, une population de cellules post-mitotique non-prolifération qui ne permet pas d'expansion et de biobanques.
Récemment, la conversion directe des fibroblastes dans une population de cellules souches neurales / progénitrices prolifération a été signalé 21-26. Par souci de clarté, tous ces types cellulaires seront nommés en tant que cellules progénitrices neurales induites (de iNPCs) dans ce rapport. Han et al. Surexprimé Brn4, Sox2, c-Myc et Klf4 pour générer iNPCs. Comme leurs homologues de cellules souches neurales dérivées de cellules de tissus soit primaire ou pluripotentes ces iNPCs sont tripotential et pourraient être différenciées en neurones, astrocytes et oligodendrocytes 21. Notre groupe a rapporté un protocole de conversion légèrement différente impliquant la surexpression de Sox2, Klf4Et c-Myc et induite Oct4-expression pour 5 jours seulement. Avec cette approche, nous pourrions générer proliférant de manière stable iNPCs de embryonnaires et adultes fibroblastes murins qui présentent silencieux complet des facteurs de la reprogrammation 22. Contrairement à iPSCs, iNPCs ne présentent pas de pouvoir tumorigène 27 après la transplantation. Nous avons utilisé des cellules converti avec succès dans un modèle animal de démyélinisation, rats déficients en myéline, ce qui démontre que iNPCs sont cliniquement utiles 22. Jusque-là, les PNJ ne pourraient être générés à partir de cellules souches pluripotentes ou tissu neural primaire 28-32. iNPCs sont des cellules de manière stable extensibles qui peuvent être cryoconservés et sont capables de se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes. Beaucoup d'efforts ont été faits pour adapter le protocole de conversion directe de la souris à des cellules humaines 23,26,33,34. En 2012, il a été publié que la surexpression du facteur de Sox2 unique dans des fibroblastes est suffisante pour générer murin et humain iNPCs
Plusieurs études démontrent la fonctionnalité cellulaire de NNC ou leurs homologues différenciées dans les différents modèles de maladies animales. Progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines ont été transplantées dans des modèles murins de la maladie de la sclérose en plaques neuroinflammatoire 35,36. L'applicabilité de cellules progénitrices neurales CSEh dérivées dans l'EAE (encéphalomyélite auto-immune expérimentale) -mice a été montré la première fois en 2008 35. Cellules précurseurs neurales multipotentes ont été injectés dans les ventricules du cerveau de la souris, et le résultat de la transplantationed dans la réduction des signes cliniques de l'EAE. Kim et al. Généré précurseurs oligodendrogliales de CSEh et transplanté ceux intracérébroventriculairement dans EAE-souris. Bien que les greffes ne survivent pas plus de 10 jours, les souris ont montré une amélioration significative de la fonction et de la réduction des cellules immunitaires pro-inflammatoires dans la substance blanche 36 neurologique. la thérapie de cellules souches a également été appliquée pour le ciblage préclinique de la maladie de Parkinson que les PNJ peuvent être utilisés avec succès dans les modèles animaux respectifs. Pour cela, les cellules progénitrices ont été soit dérivées de tissu cérébral fœtal 37 différenciées à partir de cellules souches pluripotentes 38 à 40 ou de cellules souches mésenchymateuses 41 ont été utilisés. En 2012, nous avons montré que iNPCs de souris sont capables de produire une protéine protéolipidique, la principale composante de protéine de la myéline, après la transplantation dans le cerveau de rats (md) de la myéline déficient 22. Par cette expérience preuve-de-principe APPLICABIL thérapeutiquelité de iNPCs a d'abord été prouvé et bientôt confirmé par une autre étude 32. Toutefois, le potentiel d'utilisation thérapeutique de iNPCs humains reste à explorer.
Ici, nous montrons un processus robuste et intégré de (i) la dérivation de cellules primaires humaines de patients adultes par biopsie de la peau, (ii) la conversion directe de fibroblastes humains dans un état progénitrices neurales et (iii) la capacité de iNPCs à se différencier en neurones et lignages gliales. L'utilisation de ce protocole aidera à accélérer la génération de cellules humaines autologues pour des applications thérapeutiques.
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Protocol
Les fibroblastes humains utilisés dans cette étude ont été obtenues à partir d'une biopsie de poinçon de la peau après l'obtention du consentement et de la clairance éthique informé par le comité d'éthique de l'Université de Würzburg, Allemagne (rapport éthique no: 96/11 en date du 10.06.2011).
1. biopsie de
- Désinfectez la peau du patient. Anesthésier partie de la peau dont la biopsie sera prélevé (de préférence une zone exposée au soleil moins) à l'aide de 0,5 à 1 ml de chlorhydrate de mépivacaïne intradermique et préparer biopsie de la peau en utilisant une biopsie 3mm poinçon stérile, rincer biopsie avec du DPBS + 1 pl / 1 ml gentamicine et retirer graisse. Rincer la biopsie deux fois avec DPBS + gentamicine, aspirer DPBS complètement et couvercle biopsie avec Dispase II (2,4 U / ml) et incuber 16 - 18 h à 4 ° C.
- Aspirer Dispase complètement, se laver deux fois avec DPBS et enlever l'épiderme avec des pincettes. Laver deux fois avec DPBS biopsie, ajouter 2 ml de collagénase de type 2 (500 U / ml CDU), le transfert en tube de 15 ml et ajouter CollagenaSE jusqu'à 5 ml volume total. Incuber pendant 45 min à 37 ° C, 5% CO 2.
- Centrifugeuse 5 min à 180 xg et éliminer le surnageant après. Resuspendre le culot dans 10 ml de DMEM-FCS-gentamicine-médias (10% de FCS, 1 pl / ml de gentamicine) et centrifuger à nouveau pendant 5 min à 180 x g. Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 1,5 ml de DMEM-FCS-gentamicine-médias. Transfert à T25 adhérent ballon de culture de tissu et incuber à 37 ° C, 5% CO 2.
- Changer de support tous les 3 jours.
- Après environ 2 semaines, lorsque les cellules sont confluentes dans les parties de la peau, des cellules divisées à l'aide de trypsine / EDTA (0,05%): des cellules de lavage une fois avec du DPBS, incuber 5 minutes à 37 ° C, 5% CO 2 après addition de 2 ml de trypsine / EDTA (0,05%), ajouter 2 ml de DMEM-FCS-gentamicine médias, transfert à tube de 15 ml et centrifuger à 180 g pendant 5 min; jeter le surnageant du culot et remettre en suspension dans quantité appropriée de DMEM-FCS-gentamicine-médias.
- Étendre les cellules en changeant le milieu tous les 3 rd jour et le clivage comme décrit ci-dessus lorsque les cellules sont confluentes; ajout de gentamicine peut être arrêté après le passage 2.
- Avant d'utiliser les cellules pour des expériences de conversion directe, assurez-vous d'exclure toute contamination par des mycoplasmes par des dosages standard.
- Lorsque les cellules ont été élargis, vous pouvez commencer directement la conversion ou congeler les cellules vers le bas en utilisant 10% de DMSO et 90% de FCS. Les cellules doivent être stockées dans -80 ° C pendant 2 jours, puis transférés dans de l'azote liquide pour un stockage à long terme.
- Pour la préparation de la conversion, laver les cellules une fois avec DPBS, aspirer DPBS et ajouter 2,5 ml de trypsine / EDTA (0,05%). Maintenir pendant 5 min à 37 ° C, 5% CO 2. Appuyez ballon doucement pour détacher les cellules, remettre en suspension dans 2,5 ml de milieu de fibroblastes (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% de NEAA + 1% de pyruvate de sodium) et à transférer 15 ml tube. Centrifuger à 180 g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 1 ml de médias fibroblastes et pipette haut et en bas pour générer suspension cellulaire unique. </ Li>
- Comptez le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage Fuchs-Rosenthal- ou Neubauer-cellule et la plaque 3 x 10 4 cellules par puits d'une plaque 24. Incuber O / N à 37 ° C, 5% CO 2.
2. L'infection des fibroblastes humains avec Sendai virus et transdifférenciation
REMARQUE: Pour assurer la sécurité, les étapes suivantes virus de manutention doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique et d'une hotte à flux laminaire, et avec un équipement personnel approprié de sécurité, notamment un masque chirurgical, pour prévenir l'exposition des muqueuses.
- Mettez cellules à 100 pi médias fibroblastes (Étape 1.9). Décongeler aliquotes de Oct4-, Klf4-, Sox2- et virus c-myc-Sendai et remettre chaque virus dans 1 ml de médias fibroblastes. Ajouter chaque virus avec un MOI de 3 à cellules (titre de virus varie d'un lot à, mais une aliquote de chaque virus peut généralement être utilisé pour l'infection de 10 puits d'une plaque 24) et mélanger doucement. Incuber O / N à 37 ° C, 5% CO 2
- Après 24 heures aspirer le milieu et ajouter 500 ul de milieu de neuroinduction (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) et la culture à 39 ° C, 5% de CO 2 à partir de maintenant. Changer les médias tous les jours.
- Au jour 6 après l'infection préparer 6 puits des plaques de laminine-enduit: diluer la laminine à 1 pg / ml dans du DPBS, ajouter 1 ml de solution sur 6 ainsi des plaques et de garder à 4 ° C pendant 24 heures.
- Au jour 7 après l'infection diviser les cellules en utilisant DPBS / EDTA: aspirer les médias et laver les cellules une fois avec DPBS, puis ajouter 500 ul de DPBS / EDTA et incuber pendant 10 min à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Ajouter 500 pi de DMEM / F12 et retirer la suspension de la plaque dans un tube de 15 ml et centrifuger à 180 g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 1,5 ml de milieu de neuroinduction, plaque sur 6 et plaques de laminine-couché et ajouter inhibiteur ROCK Y27632 dans un conce finalentration de 10 uM dans les cellules, la culture à 39 ° C, 5% CO 2.
- Changer les médias tous les jours.
- Au jour 14 après infection de la culture les cellules à 37 ° C, 5% CO 2. Neuroépithéliales colonies deviennent apparents autour du jour 17 après l'infection par microscopie à contraste de phase. Ils doivent être suffisamment grand pour être ramassé autour du jour 20 après l'infection.
3. Isolation des Colonies Putative INPC
- Un jour avant la cueillette, manteau un 48 bien-plaque avec la laminine: diluer la laminine à 1 pg / ml dans du DPBS, ajouter 300 pi de solution sur des plaques et de garder à 4 ° C pendant 24 heures. Un jour plus tard aspirer la laminine à partir de plaques et ajouter 200 ul de milieu de neuroinduction dans les puits.
- Laver les 6 bien des plaques contenant les colonies à être ramassé une fois avec DPBS et ajouter 2 ml par puits de DPBS 6 bien-plaque. Choisissez les colonies mécaniquement: gratter autour des colonies à l'aide d'une aiguille fine pour se débarrasser des cellules environnantes; définir le 2001; l Pipetman sur 50 pi et ramasser les colonies en utilisant les embouts de pipette respectifs.
- Transférer une colonie de chaque dans un puits d'une 48 bien-plaque de la laminine-enduit et de générer une suspension cellulaire unique mécaniquement par aspiration et refoulement 10 fois. Ajouter inhibiteur de ROCK Y27632 dans une concentration finale de 10 uM dans les cellules.
- Cultiver les cellules sur la plaque 48-puits à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 2 jours. Changer les médias tous les deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 80 - 90% de confluence (environ 3 - 4 jours.).
4. Expansion et Cryo-conservation de iNPCs
- Le repiquage et expansion de iNPCs
- Aspirer le milieu et laver les cellules avec du DPBS. Aspirer le DPBS et ajouter 200 ul DPBS / EDTA et incuber pendant 10 min à 37 ° C, 5% de CO 2, ajouter 200 pi de DMEM / F12 et retirer la suspension de la plaque dans un tube de 15 ml, centrifuger à 180 g pendant 5 min .
- Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 0,5 ml de neuroinduction médias (étape 2.2), plaque sur des plaques 12 puits revêtues de laminine et ajouter un inhibiteur de ROCK Y27632 dans une concentration finale de 10 uM dans les cellules, la culture à 37 ° C, 5% CO 2. Après que les cellules atteignent 80-90% de confluence, soit ils peuvent être congelés ou encore développés de la façon suivante.
- Gel des iNPCs
- Aspirer le milieu et laver les cellules avec du DPBS. Aspirer le DPBS et ajoutez DPBS 300 pi / EDTA et incuber pendant 10 min à 37 ° C, 5% de CO 2, ajouter 300 pi de DMEM / F12 et retirer la suspension de la plaque dans un tube de 15 ml, centrifuger à 180 g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 0,5 ml de milieu de congélation NSC commerciale. Transfert suspension dans des flacons de gel et de mettre dans un récipient de congélation de cellules. Conserver à -80 ° C pendant 2 jours, puis transfert à l'azote liquide pour le stockage à long terme.
5. Différenciation des iNPCs
- Différenciation vers neuroneal lignée
- Culture de cellules sur des plaques revêtues de laminine, comme décrit ci-dessus. Changer de support de neuro-diff-support (DMEM / F-12, N2 1x, 1x B27, 300 ng / ml AMPc, 200 pM de vitamine C, de 10 ng / ml de BDNF, 10 ng / ml GDNF) lorsque les cellules sont d'environ 70% confluentes. Changer les médias chaque jour pendant trois semaines. Avez cellules non divisées lors de la différenciation.
- Après trois semaines cellules devraient exprimer le marqueur TUJ1 neuronale. Pour gagner neurones plus matures et sous-types de neurones continuer différenciation jusqu'à 3 mois.
- Différenciation vers la lignée gliale
- Changer de support de support d'induction des cellules gliales (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 uM de β-mercaptoéthanol, 100 uM d'acides aminés non essentiels, 1,5 mM de L-glutamine, l'insuline 5 ug / ml, 40 ng / ml de T3) comprenant 20 ng / ml d'EGF pour induire une différenciation en cellules précurseurs gliales. Retirer la moitié des médias et le remplacer par un milieu frais chaque jour pendant environ 2 semaines. Pendant cette période, les cellules doivent être divisés1: 3 en présence d'un inhibiteur de ROCK 10 uM Y27632 lorsque 100% de confluence est atteint.
- Après 2 semaines différencier les cellules plus loin dans les astrocytes: lorsque les cellules sont des médias de changement presque confluentes aux médias des astrocytes disponible dans le commerce, changer de support tous les deux jours. Après environ 7 jours cellules commencent à exprimer des marqueurs d'astrocytes (par exemple, GFAP). Si les cellules deviennent confluentes à 100% au cours du protocole de différenciation, les diviser en un rapport de 1: 2 en présence de l'inhibiteur de ROCK 10 uM Y27632.
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Representative Results
Nous présentons ici la description d'un processus intégré qui permet de générer des cellules induites neurales progénitrices (de iNPCs) à partir de fibroblastes humains qui ont été obtenus par une biopsie de poinçon de la peau en moins de 8 semaines (Figure 1). iNPCs Patient-specifc peuvent être davantage différenciées en lignées neuronales et gliales et abritent un énorme potentiel pour la thérapie de remplacement de la cellule et de la modélisation de la maladie.
L'infection des fibroblastes avec Oct4-, Klf4-, Sox2- et c-myc- Sendai virus 23 et de la culture dans des conditions de médias neuroinductive 22,31 abouti à un changement de la morphologie des fibroblastes et l'émergence subséquente de colonies 17 jours après l'infection (Figure 2). Lignées cellulaires monoclonaux générés peuvent être élargies et aux taches positif pour les marqueurs de cellules souches neurales comme Sox2, Sox1, Nestin, vimentine, Otx2 et Pax6, ainsi que pour le marqueur de prolifération Ki67, alors qu'ils ne l'expriment pas pluripotency-marqueur Oct4 (figure 3) associée.
En outre, par l'addition de facteurs de croissance neuronaux aux milieux de culture cellulaire les cellules progénitrices neurales peuvent être différenciées en neurones. En appliquant un protocole de différenciation sur la base de Izrael et al. 42 et la différenciation finale subséquente avec des lignées de cellules astrocytes de supports d'induction peut également être différenciées en lignées gliales la manière jugée par analyse des changements typiques morphologiques et la coloration contre la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) (Figure 4 ).
Figure 1. Représentation schématique du protocole appliqué en trois étapes dans cette étude. Les fibroblastes peuvent être isolés à partir de patients par une biopsie de poinçon et élargies. Ces lignées cellulaires peuvent ensuite être directement converties en cellules neurales pluripotentes induites progénitrices (mo) et iNPCsnoclonally élargi. INPC lignes peuvent être utilisés pour le stockage à long terme (biobanques pour une utilisation répétée ou standardisé) ou ils peuvent être différenciées en lignées neuronales et gliales. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. analyse morphologique de conversion directe de fibroblastes humains dans des cellules progénitrices neurales induites par microscopie à contraste de phase (A) Des fibroblastes humains, trois jours après l'infection avec OKSM -. Virus Sendai et deux jours après l'addition de milieu de neuroinduction. Les cellules montrent la morphologie des fibroblastes comme typique. (B) Sept jours après l'infection, les cellules à morphologie apparaître. Les cellules sont réparties à réduire la confluence le jour même. (C) Dix jourss après l'infection des cellules avec seulement changé la morphologie sont présents. (D) Premières petites colonies de neuroépithéliales-like peuvent être trouvés 17 jours après l'infection. Ces colonies augmentation de la taille (E), et les cellules se trouvent l'étroit (F), trois jours plus tard. Les cellules sont prélevées sur les 21 jours après l'infection et des lignées cellulaires extensibles peuvent être générés à partir de leur (GI). Différents clones sont présentés dans le passage 1 (G), le passage 3 (H) et le passage 10 (I) après la cueillette, respectivement. Barre d'échelle = 200 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Analyse de neurones cellules souches marqueur expression génique de cel généré progéniteur neuronalL lignes de coloration. Anticorps de lignées cellulaires après 10 passages ont révélé que les cellules expriment les marqueurs de cellules souches neurales SOX1, Sox2 (A) ainsi que nestine Pax6 et (B). Les cellules sont négatifs pour la pluripotence marqueur Oct4 indiquant l'absence de la pluripotence (C). La majorité des cellules tache positif pour le marqueur Ki67, qui montre un état de prolifération élevé (C). La barre d'échelle = 50 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Analyse des PNJ après dirigée différenciation en lignées neuronales et gliales. (A) Pour atteindre spécification neuronales iNPCs ont été différenciées pendant sept jours en présence de BDNF, le GDNF, la vitamine C et de l'AMPc. (B) S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous montrons l'isolement et la conversion directe de fibroblastes humains dans des cellules progénitrices neurales transgène libre-expansibles et leur descendance différenciée en fonction putative pour la thérapie de remplacement cellulaire ou à l'application dans les analyses de dépistage de drogue. La conversion directe de la lignée de cellules somatiques dans NPC a été obtenue par expression forcée de transcription spécifique de la lignée des facteurs 26,33,34. Néanmoins, dans de nombreux cas, les fibroblastes fœtaux ont été utilisés pour des expériences de transdifférenciation 33,34. Pour des applications biomédicales l'utilisation de ces cellules est inopportun car cette source de cellules empêche l'utilisation clinique de la thérapie de remplacement cellulaire autologue. Récemment, des études ont été publiés qui décrivent la production de cellules précurseurs nerveuses de plus facilement accessibles tissus, telles que des cellules hématopoïétiques 43,44. La production réussie de lignées de cellules souches neurales tripotent a pu être démontré pour des cellules B dérivées du sang de souris inductible par la overexprEsion de huit transgènes 43. En outre, Castano et al. Publié une méthode pour l'induction de progéniteurs neuronaux à partir de cellules hématopoïétiques humaines à l'aide de virus Sox2- et c-myc-44 Sendai. Le protocole décrit permet la génération rapide et efficace de cellules neurales à partir de cellules CD133 + de sang de cordon. Cependant, lorsqu'il est appliqué pour la conversion de cellules mononucléaires de sang périphérique adulte protocole a abouti à la faible efficacité et la capacité d'expansion des lignées cellulaires générées était très limitée 44. Ainsi, la seule étude publiée par des cellules du sang périphérique humain dans le système à ce jour 44 montre clairement les limites de ce type cellulaire particulier dans des expériences de conversion directe. Depuis la disponibilité de cellules spécifiques du patient est cruciale pour le remplacement cellulaire autologue, le type de cellule préférée représentent encore des fibroblastes adultes, qui peuvent être facilement dérivées via une biopsie de poinçon de la peau tel que décrit dans notre étude.
Le overexpression de transgènes nécessaires pour transdifférenciation a surtout été réalisés par des vecteurs viraux intégratives 26,33,34. Cela entrave l'applicabilité des lignées cellulaires dérivées pour des applications biomédicales depuis l'intégration des virus dans le génome de l'hôte pourrait conduire à la mutagenèse par insertion ou la réactivation non désirée des transgènes 7,8. Transdifférenciation dans PNJ sans transgène surexpression mais basé sur un traitement chimique a été décrit pour les fibroblastes humains 45. Toutefois, dans cette étude, ces cellules précurseurs étaient seulement présents dans un état transitoire que le but de l'étude était la génération de cellules de Schwann matures 45. Récemment, d'autres approches sans transgène basé sur l'application du virus Sendai ont été décrits pour la conversion directe de fibroblastes humains en OBNL 23,44 et semblent être la tactique privilégiée à ce jour. Pour tirer PNJ extensibles qui peuvent ensuite être différenciées en lignées neuronales et gliales,on applique la surexpression de tous les facteurs Yamanaka par le virus Sendai avec inactivation à la chaleur de 23 virus ainsi que l'induction neurale par addition de petites molécules à des milieux de culture 22,31 avec des modifications importantes de la manière décrite dans ce qui suit.
Bien que, dans nos mains, le protocole est efficace travaille avec de nombreuses lignes fibroblastes testés, il ya une tendance apparente que la conversion directe des cellules de fibroblastes de vieilles donneurs présentant un mauvais résultat potentiel prolifératif dans une faible efficacité de la production INPC. Nous avons observé l'efficacité de formation de colonies de jusqu'à 0,2% après une efficacité de transduction virale de plus de 90% à en juger par infection de cellules avec seulement Oct4 et coloration subséquente. Cette efficacité est environ 3 fois plus élevé que précédemment publié 23.
L'application précisément ajustée d'une MOI virale optimisé est critique. Batch à la variabilité du lot dans le virus Sendai titredoit être pris en compte. Depuis que le virus est généralement acquis dans le commerce, l'information respective peuvent être consultés sur la page d'accueil du fabricant. Nous suggérons d'utiliser un relativement faible MOI de 3 pour des expériences de transdifférenciation.
Addition de LIF humain dans nos mains est crucial pour l'auto renouvellement des lignes établies INPC comme cela a été décrit pour la différenciation des cellules pluripotentes humaines dans PNJ 31. Sans addition de LIF, les cellules commencent à se différencier aussi tôt que deux jours après l'arrêt d'une manière non-réversible.
La culture cellulaire après l'infection est effectuée à 39 ° C et pas 37 ° C en utilisant des conditions de culture cellulaire standard. Cette montée en température commence déjà un jour après l'infection et la chaleur conduit à une inactivation du virus Sendai. La culture à 39 ° C jusqu'au jour 14 après l'infection est essentiel pour la production de colonies neuroépithéliales.
En fait, parfois colonies INPC viennent plus tard que décrit dans la section de protocole. Dans notre expérience, aussi longtemps que les cellules restent proliférative ils peuvent être polyclonale passages et isolés par cueillette manuelle. Les lignées cellulaires établies à partir de ces colonies présentent des propriétés similaires à celles décrites pour les colonies qui se produisent au début.
Au cours de fendage de lignées cellulaires établies, il est important de ne pas trop ensemencer un petit nombre de cellules car elles nécessitent des contacts ou des signaux paracrines de cellule à cellule et à proliférer. Si les cellules sont ensemencées dans des trop basse densité prolifération cessera. Dans ce cas, les cellules peuvent être sauvées par les plaquant sur une boîte de culture cellulaire avec une surface inférieure de ré-initier la prolifération.
Pour la différenciation gliale de iNPCs il est très important pour ensemencer les cellules dans une haute densité et de les diviser lorsque la plaque est presque confluentes. Si les cellules sont divisées trop tôt, la différenciation neuronale sera principalement observée.
content "> Le procédé décrit dans ce manuscrit héberge le potentiel d'être appliquée de façon semi- ou entièrement automatique, ce qui serait nécessaire pour atteindre le potentiel biomédical souhaitée, y compris la modélisation de la maladie et la thérapie de remplacement cellulaire. automatisation permettrait aussi rentable efficace à l'échelle et la parallélisation de la génération de cellules progénitrices neurales.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier tous les membres du Stem Cell et Regenerative Medicine Group de l'Université de Würzburg pour des suggestions utiles et Martina Gebhardt ainsi que Heike Arthen pour un excellent support technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), le ministère allemand de l'éducation et de la recherche BMBF (01 GN 0813), les recherches bavaroise induite Réseau des cellules souches pluripotentes "forIPS» et la «Stiftung Sibylle Assmus ». Figure 1 a été produit en utilisant Servier Medical Art, disponible à partir de www.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
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