Summary
Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.
Abstract
Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus adulten Hautfibroblasten und nachfolgende Differenzierung in somatische Zellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten, die Histocompatibility Barrieren zu umgehen. , Die Progression durch einem pluripotenten Zustand und anschließende vollständige Differenzierung in die gewünschten Linien bleibt jedoch ein Hindernis für die klinische Umsetzung von iPS-Technologie wegen der damit verbundenen neoplastischen Potential und genomische Instabilität. Vor kurzem haben wir und andere zeigten, dass Körperzellen kann nicht nur in iPSCs sondern auch in verschiedene Arten von multi somatischen Stammzellen mit definierten Faktoren, wodurch Umgehung Progression durch den pluripotenten Zustand umgewandelt werden. Insbesondere die direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten zu induzierten neuronalen Progenitorzellen (iNPCs) kündigt die Möglichkeit eines neuen autologen Zellquelle für verschiedene Anwendungen, wie beispielsweise Zell-Ersatz, Krankheitsmodelleund Wirkstoff-Screening. Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten humanen primären Fibroblasten durch Hautbiopsie und deren effiziente direkte Umwandlung in iNPCs durch rechtzeitige beschränkte Expression von Oct4, Sox2, Klf4, sowie c-Myc. Sox2-positive neuroepithelialen Kolonien erscheinen nach 17 Tagen der Induktion und INPC Linien effizient durch monoklonale Isolation und Expansion geschaffen werden. Genaue Einstellung der virale Multiplizität der Infektion und Ergänzung Leukämiehemmfaktor während der Induktionsphase stellen kritische Faktoren Umwandlungswirkungsgrade von bis zu 0,2% zu erreichen. Bisher konnte patientenspezifischen INPC Linien für mehr als 12 Durchgänge expandiert werden und zeigen morphologische und molekulare Merkmale von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, wie die Expression von Nestin und Sox2 gleichmäßig. Die INPC Linien können in Neuronen und Astrozyten differenziert werden, wie durch Färbung gegen TuJ1 und GFAP bzw. beurteilt. Zusammenfassend haben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung und dire meldenct Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in stabiler Weise erweiterbar neuralen Vorläuferzellen, die eine Zellquelle für biomedizinische Anwendungen, wie beispielsweise autologe neuronalen Zell-Ersatz und Krankheitsmodelle liefern könnten.
Introduction
Im Jahr 2006 Yamanaka und Kollegen zum ersten Mal zeigen, könnte die Möglichkeit der Reprogrammierung von somatischen Zellen in einem pluripotenten Zustand 1. Diese Dedifferenzierung wurde durch Überexpression von vier Transkriptions Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc in murinen Fibroblasten erreicht Faktoren. Die erzeugten sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zeigen funktionale Äquivalenz zu embryonalen Stammzellen (ESC) und können so in alle Zelltypen des erwachsenen Organismus differenziert werden. Ein Jahr später Umprogrammierung zu iPSCs könnte auch für die menschliche Fibroblasten 2 erreicht werden. Experimente in Tiermodellen zeigen, dass iPSC abgeleiteten Zellen können allgemein zur Zellersatztherapie, beispielsweise bei der Parkinson-Krankheit (PD) 3-5 verwendet werden. Jedoch einige Einschränkungen bei der Verwendung von iPSCs assoziiert stellen Hindernisse für die volle Verwirklichung der ihr therapeutisches Potential. Zunächst Reprogrammierung von Zellen in einem pluripotenten Zustand und anschließendeQualitätskontrolle ist in der Regel ein zeitaufwendiger und ineffizienter Prozess was in umfangreichen und damit kostspielige Zellkulturverfahren. Zweitens müssen iPSCs in den gewünschten Zelltyp von Interesse, bevor die Biomedizin mit der Wahrscheinlichkeit des Rest pluripotenten Zellen in differenzierten Bevölkerung wieder unterscheiden birgt eine bedeutende tumorerzeugenden Potential und zeigt somit ein hohes Risiko nach Zelltransplantation 6. Drittens wird die Umprogrammierung in der Regel durch die Induktion der Umprogrammierung Faktoren Lenti- oder retroviralen Infektion erzielt. Die Integration dieser Viren in das Wirtsgenom vielleicht Insertionsmutagenese und / oder unkontrollierte Reaktivierung der Transgene 7,8 führen. Nicht-integrative Systeme entwickelt worden, um die Umprogrammierung Faktoren liefern an Zielzellen, die das Risiko einer Insertionsmutagenese und Transgen Reaktivierung zu minimieren. Beispiele für diese transgene freie Ansätze sind die Reprogrammierung von Zellen unter Verwendung von nicht-IntegrationAdeno oder Sendaivirus 9,10, auf DNA basierende Vektoren 11 oder die Anwendung von DNA-freien Verfahren, wie Transfektion von synthetischer mRNA 12 oder Transduktion von rekombinanten Proteinen 13,14. Ein weiteres vielversprechendes Verfahren für die Ableitung von Transgen freien iPSC ist die Verwendung von loxP-modifizierten lentiviralen Umprogrammierung Konstrukten und anschließendem Löschen von Transgenen unter Verwendung des Cre-loxP DNA Rekombinationssystem 15,16.
Ein einfacher Ansatz für die Nervenzellen zu erzeugen, für Zellersatztherapie stellt direkte Umwandlung von Fibroblasten in post-mitotischen Neuronen 17-20. Vierbuchen et al. Berichteten, dass die Überexpression von Transkriptionsfaktoren ASCL1, BRN2 und Myt1l resultiert in der Erzeugung von 20% Neuronen aus Mäusefibroblasten 17. Im Jahr 2011 konnte gezeigt werden, dass die gleichen drei Transkriptionsfaktoren in Kombination mit Überexpression von NeuroD1 ermöglichen Transdifferenzierung von menschlichen Fibroblasten in neurons 19. Menschen verursachten Nervenzellen könnten auch durch Überexpression von ASCL1 und Ngn2 unter dual SMAD- und GSK3β- Hemmung 20 erzeugt werden. Bemerkenswert ist, erzeugt direkte Umwandlung von Fibroblasten in Neuronen eine nicht-proliferative, post-mitotischen Zellpopulation, die keine weitere Expansion und Biobanken zulässt.
Vor kurzem wurde die direkte Umwandlung von Fibroblasten in einer proliferierenden neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellpopulation 21-26 berichtet. Aus Gründen der Klarheit werden alle diese Zelltypen als induzierte neurale Vorläuferzellen (iNPCs) die in diesem Bericht genannt werden. Han et al. Überexprimiert Brn4, Sox2, c-Myc und Klf4 zu iNPCs generieren. Wie ihre neuronalen Stammzellen Amtskollegen aus entweder primäre Gewebe oder pluripotenten Zellen abgeleitet sind diese iNPCs tripotential und könnte in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten 21 unterschieden werden. Unsere Gruppe berichtete eine etwas andere Umwandlung Protokoll mit Überexpression von Sox2, Klf4Und c-Myc und induzierte Oct4-Expression für nur 5 Tage. Mit diesem Ansatz konnten wir stabil wuchernden iNPCs aus murinen embryonalen und adulten Fibroblasten, die komplette Silencing Exponat des Reprogrammierungsfaktoren 22 zu erzeugen. Im Gegensatz zu iPSCs, weiß iNPCs keine tumorigene Potential zeigen nach der Transplantation 27. Wir verwendeten erfolgreich in einem Tiermodell der Demyelinisierung, Myelin-defizienten Ratten Zellen umgewandelt, die belegen, dass iNPCs sind klinisch nützlich 22. Bis dahin könnte NPCs nur aus pluripotenten Stammzellen oder primären Nervengewebe 28-32 erzeugt werden. iNPCs stabil expandierbaren Zellen, kryokonserviert und sind in der Lage, sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren können. Große Anstrengungen wurden unternommen, um die direkte Umwandlung Protokoll von Maus, menschliche Zellen 23,26,33,34 anzupassen. Im Jahr 2012 wurde veröffentlicht, dass die Überexpression des einzigen Faktor Sox2 in Fibroblasten ist ausreichend, um Maus und des Menschen iNPCs erzeugen
Mehrere Studien zeigen, die zelluläre Funktion von NSCs oder deren Gegenstücken unterschieden in verschiedenen Tierkrankheitsmodellen. Neuralen Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen wurden in Maus-Modellen der neuroinflammatorischen Erkrankung Multiple Sklerose 35,36 verpflanzt worden. Die Anwendbarkeit hES-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen in EAE (experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis) -mice wurde zuerst im Jahr 2008 35 gezeigt. Multipotenten neuralen Vorläuferzellen wurden in den Ventrikeln des Gehirns der Maus injiziert, und die Transplantationsergebnisbei der Verringerung der klinischen Anzeichen von EAE ed. Kim et al. Erzeugten oligodendroglial Vorstufen von HES-Zellen und in EAE-Mäuse transplantiert diejenigen intracerebroventricularly. Obwohl Transplantate nicht für mehr als 10 Tage überleben, Mäuse zeigten eine signifikante Verbesserung der neurologischen Funktion und Reduktion proinflammatorischer Immunzellen in der weißen Substanz 36. Stammzelltherapie wurde auch für vorklinische Targeting der Parkinson-Krankheit als NSC erfolgreich für die jeweiligen Tiermodellen eingesetzt werden angewendet. Hierzu wurden Vorläuferzellen entweder aus fötalem Hirngewebe 37 aus pluripotenten Stammzellen 38-40 oder mesenchymalen Stammzellen 41 verwendet wurden, unterschieden, abgeleitet. Im Jahr 2012 haben wir gezeigt, dass der Maus iNPCs können Proteolipidprotein, das Hauptmyelinprotein-Komponente, nach der Transplantation in das Gehirn von Myelin-defizienten (md) Ratten 22 zu produzieren. Zu dieser Proof-of-principle experiment das therapeutische applicabilkeit von iNPCs wurde zunächst bewährte und bald von einer anderen Studie 32 bestätigt. , Das volle Potential der Verwendung menschlicher iNPCs bleibt, erkundet zu werden.
Hier zeigen wir eine robuste und integrierten Verfahren (i) Gewinnung menschlicher Primärzellen von erwachsenen Patienten mittels Hautbiopsie, (ii) die direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in einer neuralen Vorläuferzustand und (iii) die Fähigkeit der iNPCs in neuronalen unterschieden und Glia-Linien. Die Verwendung dieses Protokoll wird dazu beitragen, für therapeutische Anwendungen beschleunigen Generation von autologen menschlichen Zellen.
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Protocol
Die menschlichen Fibroblasten in dieser Studie verwendet wurden aus einer Haut Stanzbiopsie nach dem Aufstehen von der Ethikkommission der Universität Würzburg, Deutschland informierte Zustimmung und ethischen Freiraum erhalten (ethische Bericht Nr: 96/11 vom 10.06.2011).
1. Stanzbiopsie
- Desinfizieren Sie die Haut des Patienten. Betäuben Haut Teil davon Biopsie aus (vorzugsweise weniger sonnenexponierten Bereich) entnommen werden mit 0,5 bis 1 ml Mepivacainhydrochlorid intrakutan und bereiten Hautbiopsie mit einer sterilen 3mm Biopsie Punsch, spülen Biopsie mit DPBS + 1 ul / 1 ml Gentamicin und entfernen Fett. Zweimal spülen Biopsie mit DPBS + Gentamicin, absaugen DPBS vollständig und Abdeckung Biopsie mit Dispase II (2,4 U / ml) und Inkubation von 16 bis 18 Stunden bei 4 ° C.
- Saugen Sie Dispase vollständig, waschen zweimal mit DPBS und Epidermis mit einer Pinzette entfernen. Zweimal waschen Biopsie mit DPBS, 2 ml Collagenase Typ 2 (500 U / ml CDU), Transfer in 15-ml-Röhrchen und fügen Collagenase bis zu 5 ml Gesamtvolumen. Inkubieren für 45 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Zentrifuge 5 min bei 180 xg und Überstand verwerfen danach. Pellet in 10 ml DMEM-FCS-Gentamicin-Medium (10% FCS, 1 ul / ml Gentamicin) und zentrifugiert erneut 5 min bei 180 x g. Überstand verwerfen und Pellet in 1,5 ml DMEM-FCS-Gentamicin-Medien. Transfer zum adhärenten Zellkulturflasche T25 und bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Ändern Medien alle 3 Tage.
- Nach etwa 2 Wochen, wenn die Zellen um Hautteile, Split-Zellen unter Verwendung von Trypsin / EDTA (0,05%) konfluent: Wasch Zellen einmal mit DPBS, inkubieren 5 min bei 37 ° C, 5% CO 2 nach Zugabe von 2 ml Trypsin / EDTA (0,05%), 2 ml DMEM-FCS-Gentamicin-Medien, Transfer zum 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 180 xg für 5 min; Überstand verwerfen und Pellet in entsprechende Menge an DMEM-FCS-Gentamicin-Medien.
- Weiter ausbauen, die Zellen, indem das Medium alle 3 rd Tag und Spaltung wie oben, wenn die Zellen konfluent beschrieben; Zugabe von Gentamycin können nach dem Durchgang 2 angehalten werden.
- Vor der Verwendung der Zellen zur direkten Umwandlung Experimente, stellen Sie sicher, Mycoplasmenkontamination von Standardtests auszuschließen.
- Wenn Zellen wurden erweitert, können Sie direkt die Konvertierung zu starten oder Gefrierzellen nach unten mit 10% DMSO und 90% FCS. Zellen sollten in -80 ° C für 2 Tage gelagert und dann in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung überführt.
- Für die Herstellung der Umwandlung, waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS, absaugen DPBS und fügen Sie 2,5 ml Trypsin / EDTA (0,05%). Halten für 5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2. Tap Kolben sanft zu Zellen in 2,5 ml Fibroblastenmedium (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% Natriumpyruvat) abzunehmen, resuspendieren und Transfer auf 15 ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 180 × g für 5 min und saugt den Überstand. Die Zellen in 1 ml Fibroblasten Medien und Pipette auf und ab, um Einzelzellsuspension zu erzeugen. </ Li>
- Die Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Fuchs-Rosenthal- oder Neubauer-Zellzählung Kammer und Platte 3 x 10 4 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO 2.
2. Infektion von menschlichen Fibroblasten mit Sendai-Virus und Transdifferenzierung
HINWEIS: Um die Sicherheit zu gewährleisten, werden die folgenden Schritte Umgang mit Virus in einer biologischen Sicherheitswerkbank und einer Steril und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, insbesondere einem OP-Maske, um Schleimhaut-Exposition zu verhindern durchgeführt werden.
- Schaltzellen zu 100 ul Medium Fibroblasten (Schritt 1.9). Auftauen Aliquots von Oct4-, Klf4-, Sox2- und c-myc-Sendai-Virus und Resuspendieren jedes Virus in 1 ml Fibroblastenmedium. Fügen Sie jede Virus mit einer MOI von 3 bis Zellen (Virustiter variiert von Charge zu Charge, aber man Aliquot jeder Virus kann in der Regel für die Infektion von 10 Wells einer 24-Well-Platten verwendet werden) und vorsichtig mischen. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO 2
- Nach 24 Stunden absaugen das Medium und fügen Sie 500 ul neuroinduction Medien (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) und Kultur bei 39 ° C, 5% CO 2 von nun an. Ändern Sie jeden zweiten Tag die Medien.
- Am Tag 6 nach der Infektion vorbereiten Laminin beschichteten 6-Well-Platten: Laminin verdünnt, um 1 ug / ml in DPBS, 1 ml der Lösung auf 6 Well-Platten und halten bei 4 ° C für 24 Stunden.
- Am Tag 7 nach der Infektion der Zellen unter Verwendung aufgeteilt DPBS / EDTA: absaugen Medien und wasche die Zellen einmal mit DPBS, dann fügen 500 ul DPBS / EDTA und Inkubation für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Fügen Sie 500 ul DMEM / F12 und Suspension zu entfernen von der Platte in einer 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 180 xg für 5 min.
- Saugen Sie den Überstand und das Pellet in 1,5 ml neuroinduction Medien, Teller auf Laminin beschichteten 6 Well-Platten und fügen ROCK-Inhibitor Y27632 in einem letzten concentration von 10 & mgr; M zu den Zellen, der Kultur bei 39 ° C, 5% CO 2.
- Ändern Sie jeden zweiten Tag die Medien.
- Von Tag 14 nach der Infektion Kultur werden die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2. Neuroepithelialen Kolonien werden nach der Infektion durch Phasenkontrastmikroskopie offensichtlich um Tag 17. Sie sollte groß genug sein, um 20 Tage nach der Infektion aufgenommen werden können.
3. Isolierung von mutmaßlichen INPC Kolonien
- Einen Tag vor Kommissionierung überfällt eine 48 Well-Platte mit Laminin: Laminin verdünnt, um 1 ug / ml in DPBS, fügen Sie 300 ul Lösung auf Teller und halten bei 4 ° C für 24 Stunden. Einen Tag später absaugen Laminin aus Platten und fügen Sie 200 ul neuroinduction Medien in die Vertiefungen.
- Waschen Sie die 6-Loch-Platten, die die Kolonien auf einmal mit DPBS abgeholt und 2 ml DPBS pro Vertiefung 6 Well-Platte. Wählen Sie die Kolonien mechanisch: kratzen Sie an Kolonien mit einer dünnen Nadel in der umgebenden Zellen loszuwerden; stellen Sie die 2001; l Pipetman auf 50 & mgr; und wählen Sie die Kolonien unter Verwendung der jeweiligen Pipettenspitzen.
- Übertragen Sie jede eine Kolonie in eine Vertiefung einer Laminin beschichteten 48-Well-Platte und erzeugen eine Einzelzellsuspension mechanisch durch Auf- und Abpipettieren 10 mal. Hinzuzufügen ROCK Inhibitor Y27632 in einer Endkonzentration von 10 & mgr; M zu den Zellen.
- Wachsen die Zellen auf 48-Well-Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 Tage. Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag, bis die Zellen 80 zu erreichen - 90% Konfluenz (ca. 3 -. 4 Tage).
4. Ausbau und Kryokonservierung von iNPCs
- Passagieren und Ausbau der iNPCs
- Saugen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. Saugen Sie das DPBS und fügen Sie 200 ul DPBS / EDTA und Inkubation für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2, fügen Sie 200 ul DMEM / F12 und Suspension zu entfernen von der Platte in einer 15 ml Tube, Zentrifuge bei 180 xg für 5 min .
- Saugt den Überstand und das Pellet in 0,5 ml Neuroinduction Medien (Schritt 2.2), Platte auf Laminin-beschichtete 12-Well-Platten und fügen ROCK Inhibitor Y27632 in einer Endkonzentration von 10 & mgr; M zu den Zellen, der Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. Nachdem die Zellen 80 zu erreichen - 90% Konfluenz sie entweder weiter ausgebaut oder gefroren sich wie folgt sein.
- Einfrieren von iNPCs
- Saugen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. Saugen Sie die DPBS und fügen Sie 300 ul DPBS / EDTA und Inkubation für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2, fügen Sie 300 ul DMEM / F12 und Suspension zu entfernen von der Platte in einer 15 ml Tube, Zentrifuge bei 180 xg für 5 min.
- Saugt den Überstand und das Pellet in 0,5 ml handelsüblicher NSC Einfriermedium. Transfer Suspension auf das Einfrieren Fläschchen und in Zell-Gefrierbehälter setzen. Bei -80 ° C für 2 Tage, dann in flüssigen Stickstoff über für langfristige Lagerung.
5. Differenzierung iNPCs
- Differenzierung gegenüber Neuronal-Linie
- Kultur Zellen auf Laminin-beschichteten Platten, wie oben beschrieben. Verändern Medien neuro diff-Medium (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 uM Vitamin C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF), wenn die Zellen bei etwa 70% konfluent. Ändern Medien jeden zweiten Tag für drei Wochen. Nicht spalten Zellen während der Differenzierung.
- Nach drei Wochen sollte die Zellen neuronalen Marker TuJ1 auszudrücken. Um reifer Neuronen gewinnen und neuronale Subtypen weiter Differenzierung bis zu 3 Monaten.
- Differenzierung gegenüber Gliazellen Abstammung
- Verändern Medien glial Induktionsmedium (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 & mgr; M β-Mercaptoethanol, 100 & mgr; M nicht-essentiellen Aminosäuren, 1,5 mM L-Glutamin, 5 ug / ml Insulin, 40 ng / ml T3) mit 20 ng / ml EGF, um die Differenzierung in glialen Vorläuferzellen zu induzieren. Entfernen Sie die Hälfte der Medien und ersetzen durch frisches Medium jeden zweiten Tag für ca. 2 Wochen. Während dieser Zeit sollten die Zellen aufgeteilt werden1: 3 in Gegenwart von 10 uM ROCK Inhibitor Y27632 bei 100% Konfluenz erreicht wird.
- Nach 2 Wochen differenzieren Zellen weiter in Astrozyten: Wenn Zellen nahezu konfluenten Wechselmedien zu kommerziellen verfügbar Astrozyten Medien, ändern Medien jeden zweiten Tag. Nach ca. 7 Tagen Zellen beginnen, Astrozyten Marker (zB GFAP) zum Ausdruck bringen. Wenn Zellen 100% konfluent während der Differenzierung Protokoll, teilen Sie sie in einem Verhältnis 1: 2 in Gegenwart von 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor Y27632.
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Representative Results
Hier stellen wir Beschreibung eines integrierten Verfahrens, das die Erzeugung von induzierten neuronalen Progenitorzellen (iNPCs) aus humanen Fibroblasten, die durch eine Stanzbiopsie von der Haut innerhalb von weniger als 8 Wochen (Figur 1) erhalten worden sind, ermöglicht. Patient-specifc iNPCs kann weiter in neuronalen und glialen Linien unterschieden werden und bergen ein enormes Potenzial für Zellersatztherapie und Krankheit Modellierung.
Infektion der Fibroblasten mit Oct4-, Klf4-, Sox2- und c-myc Sendaiviren 23 und Kultur in neuroinductive Medienbedingungen 22,31 führte zu einer Änderung der Morphologie der Fibroblasten und die anschließende Entstehung von Kolonien 17 Tage nach der Infektion (Fig 2). Erzeugten monoklonalen Zelllinien erweitert werden kann und schmutz positiv für neuronale Stammzellmarker wie Sox2, SOX1, Nestin, Vimentin, Otx2 und Pax6, sowie für die Proliferationsmarker Ki67, während sie nicht die pluripotency- auszudrückenMarker Oct4 (Abbildung 3).
Darüber hinaus kann durch Zusatz von neuronalen Wachstumsfaktoren auf die Zellkulturmedien die neuralen Vorläuferzellen in Neuronen differenzieren. Durch Anlegen eines Differenzierungsprotokoll basierend auf Izrael et al. 42 und nachfolgende Endphase Differentiation Astrozyten Induktionsmedium Zelllinien können auch in glial Linien differenziert, wie durch Analyse von typischen morphologischen Veränderungen und Anfärbung gegen saures Gliafaserprotein (GFAP) (Abbildung 4 beurteilt ).
Abbildung 1 Schematische Darstellung der in dieser Studie verwendet dreistufiges Protokoll. Fibroblasten aus Patienten mit einer Stanzbiopsie isoliert und expandiert werden. Diese Zelllinien können dann direkt in induzierte multipotente neurale Vorläuferzellen (iNPCs) und mo umgewandelt werdennoclonally erweitert. zur Langzeitlagerung (Biobank zur wiederholten oder standardisierten Einsatz) kann INPC Leitungen verwendet werden, oder sie können in neuronalen und glialen Linien unterschieden werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Morphologische Analysen der direkten Umwandlung von menschlichen Fibroblasten zu induzierten neuronalen Vorläuferzellen unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie (A) Menschliche Fibroblasten drei Tage nach Infektion mit OKSM -. Sendai-Virus und zwei Tage nach der Zugabe von neuroinduction Medium. Zellen zeigen typische Fibroblasten-ähnliche Morphologie. (B) Sieben Tage nach der Infektion Zellen mit veränderten Morphologie zeigen. Zellen sind aufgeteilt, um Konfluenz am selben Tag zu reduzieren. (C) Zehn Tages nach der Infektion nur Zellen mit veränderten Morphologie vorhanden sind. (d) eine erste kleine neuroepithelialen artige Kolonien können 17 Tage nach der Infektion gefunden werden. Diese Kolonien an Größe zunehmen (E), und auswachsenden Zellen gefunden werden kann (F) drei Tage später. Die Zellen werden am Tag 21 nach der Infektion und erweiterbar Zelllinien können von ihnen (GI) erzeugt werden abgeholt. Verschiedene Klone werden in Durchgang 1 (g), Durchgang 3 (H) und Kanal 10 (I) nach dem Aufnehmen gezeigt. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Analyse der neuronalen Stammzellmarker Genexpression erzeugt neuralen Vorläufer cell Zeilen. Antikörper-Färbung von Zelllinien nach 10 Durchgängen zeigte, dass Zellen das neuronale Stammzellmarker SOX1, Sox2 (A) sowie Nestin und Pax6 (B). Zellen sind negativ für Pluripotenz Marker Oct4 die Abwesenheit von Pluripotenz (C). Der Großteil der Zellen zu färben positiv für marker Ki67, die eine hohe proliferative Zustand zeigt (C). Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Analyse von NPCs nach gerichtet Differenzierung in neuronalen und glialen Linien. (A), die neuronale Spezifikation iNPCs erreichen, wurden sieben Tage lang in Gegenwart von BDNF, GDNF, Vitamin C und cAMP differenziert. (B) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier zeigen wir die Isolierung und direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in erweiterbaren Transfreien neuralen Vorläuferzellen und deren differenzierte Nachkommen als vermeintlichen Grundlage für Zell-Ersatz-Therapie oder eine Anwendung in Arzneimittel-Screening-Analysen. Direkte Linie Umwandlung von Körperzellen in NPCs wurde von Zwangs Ausdruck der linienspezifischen Transkriptionsfaktoren 26,33,34 erreicht. Dennoch wird in vielen Fällen fötalen Fibroblasten wurden zur Trans Experimente 33,34 eingesetzt. Für biomedizinische Anwendungen die Verwendung dieser Zellen ist unzweckmässig, da diese Zellquelle schließt die klinische Verwendung zur autologen Zellersatztherapie. Kürzlich wurden Studien veröffentlicht, die die Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen von leichter zugänglichen Geweben, wie beispielsweise hämatopoetische Zellen 43,44 beschreiben. Die erfolgreiche Erzeugung tripotent neuronale Stammzelllinien für murines Blut abgeleiteten B-Zellen von dem induzierbaren overexpr gezeigtEsion acht Transgene 43. Außerdem Castano et al. Veröffentlicht einen Ansatz zur Induktion von neuronalen Vorläuferzellen aus menschlichen hämatopoetischen Zellen mit Sox2- und c-myc-Sendai-Virus-44. Das Protokoll beschrieben ermöglicht die schnelle und effiziente Erzeugung von neuronalen Zellen von CD133 + Nabelschnurblutzellen. Allerdings, wenn für die Umwandlung von Erwachsenen einkernigen peripheren Blutzellen angewandt das Protokoll ergab, geringe Effizienz und den Ausbau Kapazität der erzeugten Zelllinien war sehr begrenzt 44. Somit ist die einzige Studie mit peripheren Blutzellen im menschlichen System bisher veröffentlichten 44 zeigt deutlich die Grenzen dieser bestimmten Zelltyp in direkten Umwandlung Experimenten. Da die Verfügbarkeit von patientenspezifischen Zellen ist entscheidend für die autologen Zell-Ersatz, der bevorzugte Zelltyp noch vertreten adulten Fibroblasten, die leicht über einen Hautstanzbiopsie als in unserer Studie beschrieben abgeleitet werden können.
Die overexpression von Transgenen für Transdifferenzierung erforderlich ist meist durch integrative virale Vektoren 26,33,34 erreicht. Dies behindert die Anwendbarkeit der abgeleiteten Zelllinien für biomedizinische Anwendungen, da die Integration der Viren in das Wirtsgenom möglicherweise Insertionsmutagenese oder unerwünschten Reaktivierung der Transgene 7,8 führen. Transdifferenzierung in NPCs ohne transgene Überexpression, sondern auf Basis der chemischen Behandlung für den menschlichen Fibroblasten 45 beschrieben. Jedoch wird in dieser Studie Diese Vorläuferzellen wurden nur in einem Übergangszustand vorliegt, wie das Ziel der Studie war es, die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen 45. In jüngster Zeit haben andere transgene freie Ansätze, die auf Antrag des Sendai-Virus für die direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in NPCs 23,44 beschrieben und scheint die bevorzugte Strategie aktuell. Um erweiterbar NPCs, die anschließend in neuronalen und glialen Linien unterschieden werden können ableiten,Wir wenden Expression aller Yamanaka-Faktoren durch Sendai-Virus zusammen mit einer Hitzeinaktivierung Virus 23 sowie neurale Induktion durch Zugabe von kleinen Molekülen zu den Kulturmedien 22,31 wichtige Modifikationen, wie im folgenden beschrieben.
Obwohl, in unseren Händen wird das Protokoll effizient arbeiten mit vielen getesteten Fibroblastenlinien, gibt es eine Tendenz erkennbar, dass die direkte Umwandlung von Fibroblasten aus alten Spendern die eine schlechte Proliferationspotential führen zu einer geringen Effizienz der INPC Generation. Wir beobachteten Koloniebildungseffizienzen von bis zu 0,2% nach einer viralen Transduktionseffizienz von mehr als 90%, wie durch die Infektion von Zellen mit nur Oct4 und anschließender Färbung beurteilt. Dieser Wirkungsgrad ist etwa 3-mal höher als die zuvor veröffentlichten 23.
Die präzise eingestellt Anwendung eines optimierten viralen MOI ist kritisch. Charge zu Charge Schwankungen in Sendai-Virus-Titermuss in Betracht gezogen werden. Da das Virus ist in der Regel im Handel erworben, können entsprechende Informationen auf der Homepage des Herstellers finden. Wir schlagen vor, eine relativ niedrige MOI von 3 für Trans Experimente verwenden.
Zugabe von humanem LIF in der Hand ist für die Selbsterneuerung der etablierten INPC Linien, wie für die Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in NSC 31 beschrieben. Ohne Zusatz von LIF, Zellen beginnen, so früh wie zwei Tage nach Entzug in einem nicht-reversiblen Weise unterscheiden.
Zellkultur nach der Infektion bei 39 ° C durchgeführt wird und nicht die Verwendung von Standard-37 ° C Zellkulturbedingungen. Dieser Anstieg der Temperatur beginnt schon einen Tag nach der Infektion, und führt zu einer Hitzeinaktivierung des Sendai-Virus. Die Kultur bei 39 ° C bis zum 14. Tag nach der Infektion ist wichtig zur Erzeugung neuroepithelial Kolonien.
In der Tat, manchmal INPC Kolonien kommen spätestens im Protokoll beschrieben. Nach unserer Erfahrung, solange die Zellen proliferative bleiben können sie polyklonal agiert und durch die manuelle Kommissionierung isoliert werden. Die etablierten Zelllinien aus diesen Kolonien zeigen ähnliche Eigenschaften wie für den ersten auftretenden Kolonien beschrieben.
Beim Spalten von etablierten Zelllinien ist es wichtig, nicht zu einer zu geringen Anzahl von Zellen Samen, wie sie erforderlich Zell-zu-Zell-Kontakte oder parakrine Signalen gut vermehren. Wenn Zellen in ausgesät zu werden Dichte Verbreitung niedrig einzustellen. In diesem Fall können die Zellen durch Neubelegung auf einer Zellkulturschale mit einer kleineren Fläche eine erneute Einleitung Proliferation gerettet werden.
Für glialen Differenzierung iNPCs ist es sehr wichtig, um die Zellen von Saatgut in einer hohen Dichte und sie zu spalten, wenn die Platte nahezu konfluent. Wenn Zellen zu früh aufgeteilt wird vorwiegend neuronale Differenzierung zu beobachten.
Inhalt "> Die in dieser Handschrift beschriebenen Verfahren birgt das Potenzial, in einer halb- oder vollautomatische Weise angewandt werden, die notwendig sind, um die gewünschte biomedizinischen Potenzial zu erreichen wäre, einschließlich Krankheit Modellierung und Zellersatztherapie. Automation würde auch kosten effiziente Scale-up und Parallelisierung der Generation von neuralen Vorläuferzellen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wir möchten alle Mitglieder der Stammzell und Regenerative Medizin Gruppe von der Universität Würzburg für Anregungen und Martina Gebhardt sowie Heike Arthen für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), des Bundesministeriums für Bildung und Forschung BMBF (01 GN 0813), der Bayerischen Forschungsverbund induzierten pluripotenten Stammzellen "forIPS" und die "Stiftung Sibylle Assmus unterstützt ". Abbildung 1 wurde unter Verwendung von Servier Medical Art, erhältlich von www.servier.com produziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
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