Summary
Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.
Abstract
Generación de células madre pluripotentes inducidas (CMPI) a partir de fibroblastos de la piel de adultos y la posterior diferenciación en células somáticas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos que eluden las barreras de histocompatibilidad. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y la posterior diferenciación en linajes deseados completa sigue siendo un obstáculo para la traducción clínica de la tecnología de IPSC debido a la inestabilidad potencial y genómico neoplásica asociada. Recientemente, nosotros y otros mostraron que las células somáticas no sólo pueden ser convertidos en iPSCs sino también en diferentes tipos de células madre somáticas multipotentes mediante el uso de factores definidos, eludiendo así la progresión a través del estado pluripotente. En particular, la conversión directa de fibroblastos humanos en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) anuncia la posibilidad de una nueva fuente de células autólogas para diversas aplicaciones tales como el reemplazo de células, el modelado de la enfermedady la detección de drogas. Aquí se describe el aislamiento de fibroblastos primarios humanos adultos por biopsia de la piel y su conversión directa eficiente en iNPCs por expresión oportuna restringido de Oct4, Sox2, Klf4, así como c-Myc. Colonias neuroepiteliales Sox2 positivos aparecen después de 17 días de inducción y líneas INPC se pueden establecer de manera eficiente por el aislamiento y la expansión monoclonal. Ajuste preciso de la multiplicidad de la infección viral y la suplementación de factor inhibidor de leucemia durante la fase de inducción representan factores críticos para lograr eficiencias de conversión de hasta el 0,2%. Hasta el momento, INPC líneas específicas del paciente podrían ampliarse por más de 12 pasajes y uniformemente muestran rasgos morfológicos y moleculares de las células madre / progenitoras neuronales, como la expresión de nestina y Sox2. Las líneas INPC pueden diferenciarse en neuronas y astrocitos, a juzgar por la tinción contra Tuj1 y GFAP, respectivamente. En conclusión, se presenta un protocolo robusto para la derivación y gravect conversión de fibroblastos humanos en células progenitoras neurales de forma estable expandibles que podrían proporcionar una fuente celular para aplicaciones biomédicas, tales como el reemplazo de células neurales autólogo y el modelado de la enfermedad.
Introduction
En 2006 Yamanaka y sus colegas pudieron mostrar por primera vez la posibilidad de reprogramación de células somáticas en un estado pluripotente 1. Este desdiferenciación se logró mediante la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc y en fibroblastos murinos. Los llamados células madre pluripotentes inducidas generadas (iPSCs) muestran equivalencia funcional a las células madre embrionarias (CES) y por lo tanto pueden diferenciarse en todos los tipos celulares del organismo adulto. Un año más tarde la reprogramación de células iPS también podría lograrse para los fibroblastos humanos 2. Los experimentos en modelos animales demuestran que las células derivadas de IPSC generalmente se pueden utilizar para la terapia de reemplazo celular, por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson (PD) 3-5. Sin embargo, varias limitaciones asociadas con el uso de iPSCs representan obstáculos para la plena realización de su potencial terapéutico. En primer lugar, la reprogramación de las células en un estado pluripotente y posteriorcontrol de calidad es generalmente un tiempo y proceso ineficiente rendimiento en los procedimientos extensos y por lo tanto costosos de cultivo celular. En segundo lugar, iPSCs necesitan ser re-diferenciado en el tipo de célula deseada de interés antes de la aplicación biomédica y la probabilidad de células pluripotentes residuales en la población diferenciada alberga un potencial tumorigénico significativa y por lo tanto muestra un alto riesgo después de trasplante de células 6. En tercer lugar, el proceso de reprogramación se consigue normalmente mediante la inducción de los factores de reprogramación por la infección lenti- o retroviral. La integración de estos virus en el genoma huésped podría conducir a la mutagénesis de inserción y / o reactivación incontrolada de los transgenes 7,8. Los sistemas no integrativos se han desarrollado para entregar los factores de reprogramación a las células diana, que minimizan el riesgo de mutagénesis por inserción y la reactivación del transgén. Ejemplos de estos enfoques transgenes libre son la reprogramación de las células utilizando no la integraciónAdeno o virus Sendai 9,10, vectores basados en ADN 11 o la aplicación de métodos de ADN libre, como la transfección de ARNm sintético 12 o transducción de proteínas recombinantes 13,14. Otro método prometedor para la derivación de-transgén libre IPSC es el uso de constructos de reprogramación lentiviral modificado loxP-y la posterior eliminación de los transgenes utilizando el sistema de recombinación Cre-loxP de ADN 15,16.
Un enfoque más directo para generar células neurales de la terapia de reemplazo celular representa la conversión directa de los fibroblastos en neuronas post-mitóticas 17-20. Vierbuchen et al. Informó de que la sobreexpresión de factores de transcripción Ascl1, Brn2 y Myt1l resultados en la generación de 20% neuronas de fibroblastos murinos 17. En 2011 se demostró, que los mismos tres factores de transcripción en combinación con sobreexpresión de NeuroD1 permiten transdiferenciación de fibroblastos humanos en neuRons 19. Neuronas inducida humanos también podrían ser generados por la sobreexpresión de Ascl1 y Ngn2 bajo dual SMAD- e inhibición GSK3β- 20. En particular, la conversión directa de los fibroblastos en neuronas genera una población de células no proliferativa, post-mitótico que no permite una mayor expansión y bancos biológicos.
Recientemente, la conversión directa de fibroblastos en una población de células neurales madre / progenitoras proliferantes se informó 21-26. Para mayor claridad, todos estos tipos de células se denominan como células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) en este informe. Han et al. Sobreexpresa Brn4, Sox2, c-Myc y Klf4 para generar iNPCs. Al igual que sus contrapartes de células madre neurales derivadas de células de tejido, ya sea primaria o pluripotentes estos iNPCs son tripotential y podrían diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos 21. Nuestro grupo informó de un protocolo de conversión ligeramente diferente que implica la sobreexpresión de Sox2, Klf4, Y c-Myc y inducida Oct4-expresión para sólo 5 días. Con este enfoque podemos generar de forma estable en proliferación iNPCs desde embrionarias y adultas fibroblastos murinos que exhiben silenciamiento completo de la reprogramación factores 22. En contraste con la CMPI, iNPCs no presentan un potencial tumorigénico después del trasplante 27. Utilizamos células convertidos con éxito en un modelo animal de la desmielinización, ratas con deficiencia de mielina, lo que demuestra que iNPCs son clínicamente útil 22. Hasta entonces, los NPCs podrían solamente generan a partir de células madre pluripotentes o tejido neuronal primaria 28-32. iNPCs son células de forma estable expandibles que pueden ser criopreservados y son capaces de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Se han hecho grandes esfuerzos para adaptar el protocolo de conversión directa de ratón para células humanas 23,26,33,34. En 2012 se publicó que la sobreexpresión de la Sox2 solo factor en fibroblastos es suficiente para generar murinos y humanos iNPCs
Varios estudios demuestran la funcionalidad celular de NSCs o sus homólogos diferenciados en diferentes modelos de enfermedad animal. Progenitores neuronales a partir de células madre pluripotentes humanas se han trasplantado en modelos de ratón de la enfermedad neuroinflamatoria esclerosis múltiple 35,36. La aplicabilidad de las células progenitoras neuronales de células madre derivadas de la EAE (encefalomielitis autoinmune experimental) -mice fue mostrado por primera vez en 2008 35. Células precursoras neuronales multipotentes fueron inyectadas en los ventrículos del cerebro de ratón, y el resultado del trasplanteed en la reducción de los signos clínicos de EAE. Kim et al. Generada precursores oligodendrogliales de hESCs y trasplantado los intracerebroventricular en EAE-ratones. Aunque los trasplantes no sobrevivieron durante más de 10 días, los ratones mostraron una mejoría significativa de la función neurológica y la reducción de las células inmunitarias proinflamatorias en la materia blanca 36. Terapia con células madre también se ha aplicado para preclínicamente focalización de la enfermedad de Parkinson como NPCs podrían ser empleados con éxito en los modelos animales respectivos. Para ello, las células progenitoras o bien se derivan de tejido cerebral fetal 37 diferenciadas a partir de células madre pluripotentes 38-40 o células madre mesenquimales 41 se han utilizado. En 2012 se demostró que iNPCs ratón son capaces de producir la proteína proteolipídica, el principal componente de proteína de la mielina, después del trasplante en el cerebro de ratas (md) mielina deficientes 22. Por ese experimento el applicabil terapéutica prueba de principiodad de iNPCs fue probado en primer lugar y luego confirmado por otro estudio 32. Sin embargo, el potencial de uso terapéutico de iNPCs humanos queda por explorar.
Aquí mostramos un proceso robusto e integrado de (i) obtención de células primarias humanas de pacientes adultos a través de biopsia de la piel, (ii) la conversión directa de los fibroblastos humanos en un estado progenitor neural y (iii) la capacidad de iNPCs a diferenciarse en neuronal y linajes gliales. El uso de este protocolo ayudará a acelerar la generación de células humanas autólogas para aplicaciones terapéuticas.
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Protocol
Los fibroblastos humanos utilizados en este estudio se obtuvieron a partir de una biopsia de la piel después de obtener el consentimiento informado y la aprobación ética por el comité de ética de la Universidad de Würzburg, Alemania (informe de ética no: 96/11 de fecha 06/10/2011).
1. Golpe Biopsia
- Desinfectar la piel del paciente. Anestesiar parte de la piel de los que la biopsia se tomará de (preferentemente una zona menos expuesta al sol) con 0,5 a 1 ml de clorhidrato de mepivacaína intracutáneamente y preparar biopsia de la piel utilizando un punzón de biopsia 3mm estéril, enjuague biopsia con DPBS + 1 l / 1 ml de gentamicina y quitar grasa. Enjuague biopsia dos veces con DPBS + Gentamicina, aspirado DPBS biopsia por completo y portada con dispasa II (2,4 U / ml) e incubar 16-18 horas a 4 ° C.
- Aspirar Dispasa completamente, lavar dos veces con DPBS y eliminar la epidermis con pinzas. Lavar dos veces con DPBS biopsia, añadir 2 ml de colagenasa de tipo 2 (500 U / ml CDU), la transferencia en el tubo de 15 ml y añadir CollagenaSE hasta 5 ml de volumen total. Incubar durante 45 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Centrífuga 5 min a 180 xg y desechar el sobrenadante después. Resuspender pellet en 10 ml de DMEM-FCS-gentamicina-media (10% de FCS, 1 l / ml de gentamicina) y centrifugar de nuevo durante 5 min a 180 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1,5 ml de DMEM-FCS-gentamicina-medios de comunicación. Transferencia a T25 matraz de cultivo de tejido adherente y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Cambie medios cada 3 días.
- Después de aproximadamente 2 semanas, cuando las células son confluentes alrededor de las partes de la piel, células de división utilizando tripsina / EDTA (0,05%): Lavar las células una vez con DPBS, se incuban 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 después de la adición de 2 ml de tripsina / EDTA (0,05%), añadir 2 ml de DMEM-FCS-gentamicina-media, traslado al tubo de 15 ml y centrifugar a 180 xg durante 5 min; deseche pellet sobrenadante y resuspender en cantidad apropiada de DMEM-FCS-gentamicina-medios de comunicación.
- Ampliar aún más las células cambiando el medio cada 3 rd día y la división como se describió anteriormente cuando las células son confluentes; adición de gentamicina puede ser detenido después del paso 2.
- Antes de utilizar las células para los experimentos de conversión directa, asegúrese de excluir la contaminación por micoplasma mediante ensayos normalizados.
- Cuando las células se han ampliado, puede iniciar directamente la conversión o congelar las células hacia abajo usando DMSO al 10% y el 90% de FCS. Las células deben ser almacenados en -80 ° C durante 2 días y luego transferidas a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
- Para la preparación de conversión, lavar las células una vez con DPBS, aspirado DPBS y añadir 2,5 ml de tripsina / EDTA (0,05%). Mantenga durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2. Frasco Toque suavemente para separar las células, resuspender en 2,5 ml de medio de fibroblastos (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% + 1% NEAA piruvato de sodio) y traslado al tubo de 15 ml. Centrifugar a 180 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de medio de fibroblastos y pipeta de arriba y abajo para generar la suspensión de células individuales. </ Li>
- Contar el número de células por medio de una cámara de recuento Fuchs-Rosenthal- o de células Neubauer y la placa 3 x 10 4 células por pocillo de una placa de 24. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
2. La infección de fibroblastos humanos con Sendai Virus y transdiferenciación
NOTA: Para garantizar la seguridad, los siguientes pasos que manipulen virus tienen que realizarse en una cabina de seguridad biológica y una campana de flujo laminar, y con el equipo adecuado personal de seguridad, sobre todo una máscara quirúrgica, para evitar la exposición de la mucosa.
- Interruptor de células a 100 l de medios de fibroblastos (Paso 1.9). Descongele alícuotas de Oct4-, Klf4-, Sox2- y virus c-myc-Sendai y resuspender cada virus en 1 ml de medio de fibroblastos. Añadir cada virus con una MOI de 3 para las células (título de virus varía de lote a lote, pero una parte alícuota de cada virus generalmente se puede utilizar para la infección de 10 pocillos de una placa de 24 pocillos) y mezclar suavemente. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2
- Después de 24 hr aspirado el medio y añadir 500 l de medios de comunicación neuroinduction (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 M CHIR99021, 2 M SB431542) y cultivo a 39 ° C, 5% de CO 2 a partir de ahora. Cambie los medios de comunicación cada dos días.
- El día 6 después de la infección preparar 6-así placas recubiertas con laminina: diluir laminina a 1 g / ml en DPBS, añadir 1 ml de solución sobre 6 pocillos placas y mantener a 4 ° C durante 24 horas.
- En el día 7 después de la infección dividir las células utilizando DPBS / EDTA: Aspirar los medios de comunicación y lavar las células una vez con DPBS, a continuación, añadir 500 l de DPBS / EDTA y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Añadir 500 l de DMEM / F12 y retirar la suspensión de la placa en un tubo de 15 ml y centrifugar a 180 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1,5 ml de medio neuroinduction, placa en 6 pocillos placas recubiertas con laminina y añadir ROCA inhibidor Y27632 en un conce definitivantration de 10 mM a las células, de cultivo a 39 ° C, 5% de CO 2.
- Cambie los medios de comunicación cada dos días.
- De día 14 después de la infección las células de cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2. Colonias neuroepiteliales se manifiestan alrededor de 17 días después de la infección por microscopía de contraste de fase. Deben ser lo suficientemente grande como para ser recogidos alrededor del día 20 después de la infección.
3. El aislamiento de colonias Putativos INPC
- Un día antes de recoger, capa un 48 bien plato con laminina: diluir laminina a 1 g / ml en DPBS, añadir 300 l de solución en placas y mantener a 4 ° C durante 24 horas. Un día después aspirado de la laminina de las placas y añadir 200 l de medios de comunicación neuroinduction a los pocillos.
- Lave bien las placas que contenían las colonias para ser recogidos una vez con DPBS y añaden DPBS 6 2 ml por pocillo de 6 pocillos de la placa. Escoja las colonias mecánicamente: raspar alrededor de las colonias utilizando una aguja fina para deshacerse de las células circundantes; establecer el 2001; l Pipetman en 50 l y recoger las colonias utilizando las respectivas puntas de pipeta.
- Transferir una colonia cada uno en un pocillo de una placa de 48 pocillos-laminina-revestido y generar una única suspensión de células mecánicamente por pipeteando arriba y abajo 10 veces. Añadir Y27632 inhibidor de ROCK en una concentración final de 10 mM a las células.
- Cultivar las células en la placa de pocillos 48 a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 días. Cambie los medios de comunicación cada dos días hasta que las células alcanzan el 80 - 90% de confluencia (aprox. 3 - 4 días).
4. Ampliación y Cryo-preservación de iNPCs
- Pases y Expansión de iNPCs
- Aspirar el medio y lavar las células con DPBS. Aspirar el DPBS y añadir 200 l DPBS / EDTA y se incuba durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, añadir 200 l de DMEM / F12 y retirar la suspensión de la placa en un tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 min .
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 0,5 ml de Neuroimedios nduction (Paso 2.2), la placa de 12 pocillos en placas recubiertas con laminina y añadir Y27632 inhibidor de ROCK en una concentración final de 10 mM a las células, de cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2. Después las células alcanzan el 80 - 90% de confluencia que puede ser o bien más expandido o congelados de la siguiente manera.
- Congelación de iNPCs
- Aspirar el medio y lavar las células con DPBS. Aspirar el DPBS y añadir 300μl DPBS / EDTA y se incuba durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, añadir 300 l de DMEM / F12 y retirar la suspensión de la placa en un tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 0,5 ml de medio de congelación NSC comercial. Suspensión de transferencia a viales de congelación y poner en un recipiente de congelación de células. Conservar a -80 ° C durante 2 días, luego traslado al nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
5. Diferenciación de iNPCs
- Diferenciación hacia neuronaal linaje
- Células de cultivo en placas recubiertas con laminina como se describió anteriormente. Cambiar medios para neuro-diff-media (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml de AMPc, 200 mM de vitamina C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) cuando las células son de aproximadamente 70% confluente. Cambie medios cada dos días durante tres semanas. Haga células no divididas durante la diferenciación.
- Después de tres semanas células deben expresar la Tuj1 marcador neuronal. Para obtener más neuronas maduras y subtipos neuronales continuar la diferenciación de hasta 3 meses.
- Diferenciación hacia el linaje glial
- Cambio de medio a medio de inducción glial (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 mM β-mercaptoetanol, 100 mM de aminoácidos no esenciales, 1,5 mM L-glutamina, insulina 5 mg / ml, 40 ng / ml T3) incluyendo 20 ng / ml de EGF para inducir la diferenciación en células precursoras gliales. Retire la mitad de los medios de comunicación y reemplazar por medio fresco cada dos días durante 2 semanas. Durante este período, las células deben dividirse1: 3 en presencia de 10 mM inhibidor ROCA Y27632 cuando se alcanza 100% de confluencia.
- Después de 2 semanas diferenciar las células más en astrocitos: cuando las células son los medios de comunicación de cambio de casi confluentes a los medios de comunicación disponibles astrocito comercial, cambio de medio cada dos días. Después de aproximadamente 7 días las células comienzan a expresar marcadores de astrocitos (por ejemplo, GFAP). Si las células consiguen 100% confluentes durante el protocolo de diferenciación, dividirlos en una proporción de 1: 2 en presencia de 10 mM inhibidor ROCA Y27632.
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Representative Results
Aquí presentamos descripción de un proceso integrado que permite la generación de células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) a partir de fibroblastos humanos que se han obtenido por una biopsia en sacabocados de la piel en menos de 8 semanas (Figura 1). INPCs-Paciente specifc se pueden diferenciar aún más en linajes neuronales y gliales y albergan un enorme potencial para la terapia de reemplazo celular y el modelado de la enfermedad.
La infección de los fibroblastos con Oct4-, Klf4-, Sox2- y c-Myc Sendai virus 23 y la cultura en condiciones de medios neuroinductive 22,31 dado lugar a un cambio de la morfología de los fibroblastos y la posterior aparición de colonias de 17 días después de la infección (Figura 2). Líneas de células monoclonales generados se pueden expandir y mancha positiva para los marcadores de células madre neurales como Sox2, Sox1, nestina, vimentina, Otx2 y Pax6, así como para el marcador de proliferación Ki67, mientras que no expresan el pluripotency-marcador asociado Oct4 (Figura 3).
Por otra parte, mediante la adición de factores de crecimiento neuronales a los medios de cultivo celular de las células progenitoras neurales pueden diferenciarse en neuronas. Mediante la aplicación de un protocolo de diferenciación basada en Izrael et al. 42 y diferenciación final posterior con líneas celulares de los medios de inducción de astrocitos también pueden diferenciarse en linajes gliales como se juzga por análisis de los cambios morfológicos típicos y tinción contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (Figura 4 ).
Figura 1. Representación esquemática del protocolo de tres pasos aplicado en este estudio. Los fibroblastos pueden aislarse de pacientes por una biopsia en sacabocados y expandido. Estas líneas celulares pueden ser luego convertidos directamente en las células inducidas multipotentes progenitoras neurales (iNPCs) y monoclonally expandido. líneas INPC se pueden utilizar para el almacenamiento a largo plazo (de biobancos para su uso repetido o estandarizada) o pueden diferenciarse en linajes neuronales y gliales. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. morfológica analiza de conversión directa de fibroblastos humanos en células progenitoras neuronales inducidas utilizando microscopía de contraste de fase (A) fibroblastos humanos tres días después de la infección con OKSM -. Virus Sendai y dos días después de la adición de medio de neuroinduction. Las células muestran típica morfología similar a fibroblastos. (B) Siete días después de la infección, las células con morfología cambiada aparezca. Las células se dividen para reducir la confluencia en el mismo día. (C) Diez díasinfección post s solamente células con morfología cambiada están presentes. (D) pequeñas colonias de primeros neuroepiteliales como se pueden encontrar 17 días después de la infección. Estas colonias aumentan de tamaño (E), y las células outgrowing se pueden encontrar (F) tres días después. Las células se recogieron en el día 21 después de la infección y las líneas celulares expandibles pueden ser generados a partir de ellos (GI). Diferentes clones se muestran en el paso 1 (G), el paso 3 (H) y el paso 10 (I) después de recoger, respectivamente. Barra de escala = 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de neural de células madre marcador de la expresión del gen de cel generada progenitor neurall líneas. La tinción de anticuerpos de líneas de células después de 10 pasajes reveló que las células expresan los marcadores de células madre neurales Sox1, Sox2 (A), así como Nestin y Pax6 (B). Las células son negativas para la pluripotencia Oct4 marcador que indica ausencia de pluripotencia (C). La mayoría de las células mancha positiva para el marcador Ki67, que muestra un estado proliferativo alto (C). La barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Análisis de NPCs después dirigió la diferenciación en linajes neuronales y gliales. (A) Para lograr iNPCs especificación neuronal se diferenciaron durante siete días en la presencia de BDNF, GDNF, la vitamina C y cAMP. (B) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí mostramos el aislamiento y la conversión directa de fibroblastos humanos en células progenitoras neurales-transgenes libre expandibles y su progenie diferenciada como base putativo para la terapia de células de reemplazo o aplicación en los análisis de detección de drogas. Conversión linaje directo de las células somáticas en los NPCs se ha logrado mediante la expresión forzada de transcripción específicos de linaje factores 26,33,34. Sin embargo, en muchos casos se utilizaron fibroblastos fetales para los experimentos de transdiferenciación 33,34. Para aplicaciones biomédicas el uso de estas células es inconveniente ya que esta fuente de células impide el uso clínico de la terapia de reemplazo celular autóloga. Recientemente, se han publicado estudios que describen la generación de células precursoras neurales de más fácil acceso tejidos, tales como las células hematopoyéticas 43,44. La generación exitosa de líneas de células madre neurales tripotent pudo demostrar para las células derivadas de la sangre murinos B por el overexpr inducibleEsion de ocho transgenes 43. Por otra parte, Castano et al. Publicaron un enfoque para la inducción de células progenitoras neuronales a partir de células hematopoyéticas humanas utilizando Sox2- y c-myc-Sendai virus 44. El protocolo descrito permite la generación rápida y eficiente de las células neuronales a partir de células de sangre de cordón CD133 +. Sin embargo, cuando se aplica para la conversión de las células mononucleares de sangre periférica de adultos el protocolo produjo una baja eficiencia y la capacidad de expansión de las líneas celulares generadas fue muy limitados 44. Por lo tanto, el único estudio publicado con células de sangre periférica en el sistema humano hasta la fecha 44 muestra claramente las limitaciones de este tipo de célula particular en los experimentos de conversión directa. Dado que la disponibilidad de las células específicas del paciente es crucial para el reemplazo de células autólogas, el tipo de célula preferido aún representan los fibroblastos adultos, que se puede derivar fácilmente a través de una biopsia en sacabocados de la piel como se describe en nuestro estudio.
El overexpresión de transgenes necesarios para la transdiferenciación en su mayoría se ha logrado mediante vectores virales integradoras 26,33,34. Esto dificulta la aplicabilidad de las líneas celulares derivadas para aplicaciones biomédicas dado que la integración de los virus en el genoma huésped podría conducir a la mutagénesis de inserción o reactivación no deseado de los transgenes 7,8. Transdiferenciación en NPCs sin sobreexpresión del transgen pero basado en el tratamiento químico se ha descrito para los fibroblastos humanos 45. Sin embargo, en este estudio estas células precursoras eran sólo está presente en un estado transitorio como el objetivo del estudio fue la generación de células de Schwann 45 madura. Recientemente, otros enfoques transgenes libre basado en la aplicación de virus Sendai se han descrito para la conversión directa de fibroblastos humanos en NPCs 23,44 y parece ser la estrategia preferida hasta la fecha. Para derivar NPCs expansibles que se pueden diferenciar posteriormente en linajes neuronales y gliales,aplicamos la sobreexpresión de todos los Yamanaka-factores por virus Sendai junto con la inactivación por calor de virus 23, así como la inducción neural mediante la adición de pequeñas moléculas a los medios de cultivo con 22,31 importantes modificaciones como se describe en lo siguiente.
Aunque, en nuestras manos, el protocolo está trabajando eficientemente con muchas líneas de fibroblastos ensayados, existe una tendencia evidente que la conversión directa de células de fibroblastos de los donantes de edad que exhiben un pobre resultado proliferativa potencial en una baja eficiencia de la generación de INPC. Se observó la formación de eficiencias de hasta el 0,2% después de una eficacia de transducción viral de más de 90% como se juzga por la infección de las células con Oct4 solamente y posterior tinción colonia. Esta eficiencia es aproximadamente 3 veces mayor que publicó anteriormente 23.
La aplicación precisamente ajustada de una MOI viral optimizado es crítica. Lotes a la variabilidad del lote en el título del virus Sendaiha de tenerse en cuenta. Dado que el virus es usualmente adquirido comercialmente, la información respectiva se puede encontrar en la página web del fabricante. Sugerimos utilizar un relativamente bajo MOI de 3 para los experimentos transdiferenciación.
La adición de LIF humano en nuestras manos es crucial para la autorrenovación de las líneas INPC establecidos como se ha descrito para la diferenciación de células pluripotentes humanas en NPC 31. Sin la adición de LIF, las células comienzan a diferenciarse tan pronto como dos días después de la retirada de una manera no reversible.
Cultivo celular después de la infección se realiza a 39 ° C y no usar 37 ° C condiciones de cultivo celular estándar. Este aumento de la temperatura comienza ya un día después de la infección y conduce a una inactivación térmica del virus Sendai. El cultivo a 39 ° C hasta 14 días después de la infección es esencial para la generación de colonias neuroepiteliales.
Como una cuestión de hecho, a veces colonias INPC vienen más tarde que se describe en la sección de protocolo. En nuestra experiencia, siempre y cuando las células permanecen proliferativa pueden ser policlonal a pases y aislados por picking manual. Las líneas celulares establecidas a partir de esas colonias muestran propiedades similares a los descritos para las primeras colonias que ocurren.
Durante la separación de líneas celulares establecidas, es importante no para sembrar un demasiado pequeño número de células, ya que requieren contactos de célula a célula o señales paracrinas a proliferar bien. Si las células se siembran en la proliferación demasiado baja densidad cesará. En este caso, las células pueden ser rescatados por resiembra en un plato de cultivo celular con una superficie más pequeña que volver a iniciar la proliferación.
Para la diferenciación glial de iNPCs es muy importante para sembrar las células en una alta densidad y para separarlos cuando la placa es casi confluente. Si las células se dividen demasiado pronto, se observó la diferenciación neuronal predominante.
contenido "> El proceso descrito en este manuscrito alberga el potencial de ser aplicado de una manera semi o totalmente automática, lo que sería necesario para alcanzar el potencial biomédico deseado, incluyendo el modelado de la enfermedad y la terapia de reemplazo celular. Automation también permitiría costo eficiente ampliación y paralelización de la generación de células progenitoras neurales.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros de la célula de vástago y Regenerativa Grupo Medicina de la Universidad de Würzburg para sugerencias útiles y Martina Gebhardt, así como Heike Arthen para soporte técnico excelente. Este trabajo fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), el Ministerio de Educación alemán e Investigación BMBF (01 GN 0813), las de investigación bávara Red pluripotentes inducidas Células Madre "forIPS" y la "Stiftung Sibylle Assmus ". La figura 1 se produjo usando Servier Medical Art, disponible de www.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
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