Summary
Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.
Abstract
Geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de fibroblastos da pele de adultos e subsequente diferenciação em células somáticas oferece perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos que contornar as barreiras de histocompatibilidade. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e subsequente diferenciação completa em linhagens desejadas continua a ser um obstáculo para a tradução clínica da tecnologia iPSC por causa do potencial instabilidade genômica e neoplásico associado. Recentemente, nós e os outros mostraram que as células somáticas não só pode ser convertido em iPSCs mas também em diferentes tipos de células-tronco somáticas multipotentes usando fatores definidos, evitando assim a progressão através do estado pluripotente. Em particular, a conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) anuncia a possibilidade de uma fonte de células autólogas novo para várias aplicações tais como a substituição de células, modelagem doençae o rastreio de drogas. Aqui, descrevemos o isolamento de fibroblastos primários humanos adultos por biópsia da pele e sua eficiente conversão direta em iNPCs por expressão oportuna restrito de Oct4, Sox2, Klf4, bem como c-Myc. Colónias neuroepiteliais Sox2-positivos aparecem após 17 dias de indução e linhas INPC pode ser estabelecida de forma eficiente pelo isolamento monoclonal e expansão. Ajuste preciso da multiplicidade de infecção viral e suplementação do fator inibidor de leucemia durante a fase de indução representam fatores críticos para alcançar a eficiência de conversão de até 0,2%. Até agora, as linhas INPC específicos do paciente poderia ser expandida para mais do que 12 passagens e uniformemente exibir características morfológicas e moleculares de células estaminais / progenitoras neurais, tais como a expressão de nestina e Sox2. As linhas INPC podem ser diferenciados em neurônios e astrócitos como avaliado por coloração contra TUJ1 e GFAP, respectivamente. Em conclusão, nós relatamos um protocolo robusto para a derivação e direct conversão de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais de forma estável expansíveis que podem fornecer uma fonte celular para aplicações biomédicas, tais como a substituição da célula neural autólogo e modelagem de doença.
Introduction
Em 2006 Yamanaka e colegas pode mostrar pela primeira vez, a possibilidade de reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente 1. Este desdiferenciação foi conseguida por sobre-expressão de quatro factores de transcrição Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc em fibroblastos de murino. Os chamados células estaminais pluripotentes induzidas gerados (IPSCs) mostram a equivalência funcional para células estaminais embrionárias (CES) e pode, assim, ser diferenciadas em todos os tipos de células do organismo adulto. Um ano mais tarde, a reprogramação iPSCs também poderia ser conseguido, por fibroblastos humanos 2. Experiências em modelos animais demonstraram que as células iPSC derivados podem em geral ser utilizadas para a terapia de substituição de células, por exemplo, na doença de Parkinson (DP) de 3-5. No entanto, várias limitações associadas com o uso de iPSCs representam obstáculos para a plena realização de seu potencial terapêutico. Em primeiro lugar, a reprogramação das células para um estado pluripotente e subsequentecontrolo de qualidade é geralmente um processo demorado e ineficiente, produzindo, em procedimentos de cultura de células extensos e, portanto, dispendiosas. Em segundo lugar, iPSCs precisa de voltar a ser diferenciadas em células do tipo desejado de interesse antes da aplicação biomédica e a probabilidade de células pluripotentes residuais na população diferenciada abriga um potencial tumorigénico significativa e, assim, exibe um risco elevado após o transplante de células 6. Em terceiro lugar, o processo de reprogramação é normalmente conseguida através da indução de factores de reprogramação por infecção lenti- ou retroviral. A integração destes vírus no genoma do hospedeiro pode levar a mutagénese por inserção e / ou reactivação descontrolada dos transgenes 7,8. Sistemas não-integrativos foram desenvolvidos para entregar os fatores de reprogramação para células alvo, o que minimiza o risco de mutagénese de inserção do transgene e reactivação. Exemplos para essas abordagens livre de transgenes são a reprogramação de células usando não-integraçãoAdeno ou vírus Sendai 9,10, vectores baseados em DNA ou 11 a aplicação de métodos de DNA-free, como a transfecção de ARNm sintético 12 ou transdução de proteínas recombinantes 13,14. Outro método promissor para a derivação de livre-iPSC transgene é a utilização de construções de reprogramação de lentivírus modificadas-loxP e eliminação subsequente de transgenes que utilizam o sistema de recombinação Cre-loxP DNA 15,16.
Uma abordagem mais simples para gerar células neurais para a terapia de substituição de células representa conversão directa de fibroblastos em neurônios pós-mitóticas 17-20. Vierbuchen et ai. Relatou que a sobre-expressão de factores de transcrição Ascl1, Brn2 Myt1l e resulta na geração de 20% de neurónios de fibroblastos de murino 17. Em 2011 ele foi mostrado para que os mesmos três fatores de transcrição em combinação com superexpressão de NeuroD1 permitir transdiferenciação dos fibroblastos humanos em neurons 19. Neurônios humanos induzida também pode ser gerada por superexpressão de Ascl1 e NGN2 sob dupla SMAD- e GSK3β- inibição 20. Notavelmente, a conversão directa de fibroblastos em neurónios gera, uma população de células pós-mitóticas não proliferativa que não permite uma maior expansão e biobanking.
Recentemente, a conversão directa de fibroblastos para uma população de células neurais tronco / progenitoras proliferam foi relatado 21-26. Por razões de clareza, todos estes tipos de células serão nomeados como células progenitoras neurais induzidas (iNPCs) neste relatório. Han et al. Overexpressed Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 para gerar iNPCs. Tal como os seus homólogos de células-tronco neurais derivadas de células ou de tecidos primária ou pluripotentes estes iNPCs são tripotential e poderia ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos 21. Nosso grupo relatou um protocolo de conversão ligeiramente diferente envolvendo superexpressão de Sox2, Klf4, E c-Myc e induzida por expressão para Oct4 apenas 5 dias. Com esta abordagem que poderia gerar de forma estável proliferação de iNPCs embrionárias e adultas fibroblastos de murino que exibem silencioso completo da reprogramação fatores 22. Em contraste com iPSCs, iNPCs não apresentam um potencial tumorigénico 27 após o transplante. Utilizamos com sucesso células convertido em um modelo animal de desmielinização, ratos deficientes em mielina, demonstrando que são clinicamente úteis iNPCs 22. Até então, NPCs só poderia ser gerada a partir de células-tronco pluripotentes ou tecido neural primário 28-32. iNPCs são estavelmente células expansíveis que podem ser criopreservadas e são capazes de se diferenciar em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Muito esforço tem sido feito para adaptar o protocolo conversão direta de mouse para células humanas 23,26,33,34. Em 2012, foi publicado que a superexpressão do único fator Sox2 em fibroblastos é suficiente para gerar murino e humanos iNPCs
Vários estudos demonstram a funcionalidade celular de NSCs ou os seus homólogos diferenciadas em diferentes modelos de doença animal. Progenitores neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas foram transplantadas em modelos do rato da doença neuroinflamatória esclerose múltipla 35,36. A aplicabilidade de células progenitoras neurais derivadas de células estaminais embrionárias humanas, em EAE (encefalomielite auto-imune experimental) -mice foi mostrado pela primeira vez em 2008 35. As células precursoras neurais multipotentes foram injetadas nos ventrículos do cérebro do rato, e o resultado do transplanteed na redução dos sinais clínicos da EAE. Kim et al., Gerado a partir de precursores oligodendrogliais hESCs e aqueles transplantado por via intracerebroventricular em ratinhos EAE. Embora transplantes não sobreviveram por mais de 10 dias, os ratos apresentaram melhora significativa da função neurológica e redução de células imunes pró-inflamatórios na substância branca 36. Terapia com células-tronco também tem sido aplicada para pré-clínicos segmentação da doença de Parkinson como NPCs poderia ser empregada com sucesso em seus respectivos modelos animais. Para isso, as células progenitoras ou foram derivados a partir de tecido de cérebro fetal 37 diferenciadas a partir de células estaminais pluripotentes 38-40 ou células estaminais mesenquimais foram 41 utilizados. Em 2012, mostrou que iNPCs rato são capazes de produzir a proteína proteolipídica, a principal componente de proteína de mielina, após a transplantação para o cérebro de ratos (MD) deficiente em mielina 22. Por esse experimento prova de princípio a applicabil terapêuticodade de iNPCs foi primeiramente provado e logo confirmada por outro estudo 32. No entanto, o potencial de utilização terapêutica de humanos iNPCs continua a ser explorado.
Aqui mostramos um processo robusto e integrado de (i) a derivação de células primárias humanas a partir de doentes adultos por biópsia da pele, (ii) a conversão directa de fibroblastos humanos em um estado progenitora neuronal e (iii) a capacidade de iNPCs ser diferenciadas em neuronal e linhagens gliais. O uso deste protocolo vai ajudar a acelerar a geração de células humanas autólogas para aplicações terapêuticas.
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Protocol
Os fibroblastos humanos utilizados neste estudo foram obtidos a partir de uma biópsia da pele após a obtenção do consentimento informado ea depuração ética pelo comitê de ética da Universidade de Würzburg, Alemanha (relatório ético não: 96/11 datada de 10.06.2011).
1. punção para biópsia
- Desinfectar a pele do paciente. Anestesiar parte pele dos quais biópsia será feita a partir de (preferencialmente uma área menos exposta ao sol) com 0,5 a 1 ml de cloridrato de mepivacaína intracutaneamente e preparar biópsia da pele utilizando um punção biópsia 3 milímetros estéril, lavar biópsia com DPBS + 1 ml / 1 ml de gentamicina e remova gorda. Lavar biópsia duas vezes com DPBS + gentamicina, aspirado completamente DPBS e tampa biópsia com Dispase II (2,4 U / ml) e incuba-se 16 - 18 h a 4 ° C.
- Aspirar Dispase completamente, lave duas vezes com DPBS e remover epiderme com uma pinça. Lave duas vezes com DPBS biópsia, adicionar 2 ml de colagenase tipo 2 (500 U / ml CDU), a transferência em 15 ml de tubo e adicionar Collagenase até 5 ml de volume total. Incubar durante 45 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Centrifugar 5 min a 180 xg e descartar o sobrenadante depois. Ressuspender o sedimento em 10 ml de DMEM-FCS-Gentamicina-meios (10% de FCS, 1 ul / ml de gentamicina) e centrifuga-se novamente durante 5 min a 180 x g. Elimine o sobrenadante e ressuspender sedimento em 1,5 ml DMEM-FCS-gentamicina-media. Transferir para frascos de cultura T25 tecido aderente e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Mudança de mídia a cada 3 dias.
- Após aproximadamente 2 semanas, quando as células são confluentes em torno de partes da pele, células divididas utilizando tripsina / EDTA (0,05%): células de lavagem uma vez com DPBS, incube 5 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2, após a adição de 2 ml de tripsina / EDTA (0,05%), adicionar 2 ml de DMEM-FCS-Gentamicina-media, transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar a 180 xg durante 5 min; descartar pellet sobrenadante e ressuspender em quantidade adequada de DMEM-FCS-gentamicina-media.
- Além disso expandir as células, alterando a forma cada 3Rd dia e divisão, tal como descrito acima, quando as células estão confluentes; adição de gentamicina pode ser interrompido após a passagem 2.
- Antes de usar as células para experiências de conversão direta, certifique-se de excluir a contaminação por micoplasma por ensaios padrão.
- Quando as células foram expandidas, você pode começar directamente a conversão ou congelar células para baixo usando 10% de DMSO e 90% FCS. As células devem ser armazenados em -80 ° C durante 2 dias e, em seguida, transferida para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.
- Para a preparação de conversão, lave as células uma vez com DPBS, aspirado de DPBS e adicionar 2,5 ml de tripsina / EDTA (0,05%). Manter durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2. Toque balão suavemente para separar células, ressuspender em 2,5 mL de meio de fibroblastos (DMEM incl. L-Glu + FCS a 10% + NEAA a 1% + 1% de piruvato de sódio) e transferir para tubo de 15 ml. Centrifugar a 180 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. Ressuspender as células em 1 ml de mídia de fibroblastos e pipeta cima e para baixo para gerar suspensão de células individuais. </ Li>
- Contar o número de células utilizando uma câmara de contagem Fuchs-Rosenthal- ou Neubauer-célula e a placa 3 x 10 4 culas por po de uma placa de 24 poços,. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
2. Infecção de fibroblastos humanos com Sendai vírus e Transdiferenciação
NOTA: Para garantir a segurança, as seguintes etapas de manuseamento dos vírus tem que ser realizado numa câmara de segurança biológica e uma câmara de fluxo laminar, e com equipamento apropriado pessoal de segurança, especialmente uma máscara cirúrgica, para evitar a exposição da mucosa.
- Mudar as células a 100 ul de meios de fibroblastos (Passo 1.9). Descongele alíquotas de Oct4-, Klf4-, Sox2- e vírus c-myc-Sendai e ressuspender cada vírus em 1 ml de mídia de fibroblastos. Adicionar cada vírus com uma MOI de 3 para as células (título do vírus varia de lote para lote, mas uma parte alíquota de cada um dos vírus pode ser geralmente utilizado para a infecção de 10 cavidades de uma placa de 24 poços-) e misturar suavemente. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2
- Após 24 h o meio aspirado e adicionar 500 ul de meios neuroinduction (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x atmosfera de N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) e cultura a 39 ° C, 5% de CO 2 a partir de agora. Troque a mídia todos os dias.
- No dia 6 após a infecção preparar 6-Bem placas revestidas com laminina: diluir a laminina de 1 ug / ml em DPBS, adicionar 1 ml de solução em 6 bem-placas e manter a 4 ° C durante 24 h.
- No dia 7, após a infecção dividir as células utilizando DPBS / EDTA: aspiram os meios de comunicação e lave as células uma vez com DPBS, em seguida, adicionar 500 mL de DPBS / EDTA e incubar durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Adicionar 500 ul de DMEM / F12 e remover a partir da placa de suspensão em um tubo de 15 ml e centrifugar a 180 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1,5 ml de meio neuroinduction, placa de 6 poços em placas revestidas com laminina e adicionar ROCHA inibidor Y27632 no final de um concentration de 10 pM para as células, a cultura a 39 ° C, 5% de CO 2.
- Troque a mídia todos os dias.
- A partir do dia 14 após a infecção, as células de cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. Colónias Neuroepiteliais se tornar aparente por volta do dia 17 após a infecção por microscopia de contraste de fase. Eles devem ser grandes o suficiente para ser escolhido por volta do dia 20 após a infecção.
3. isolamento de colónias putativas INPC
- Um dia antes da colheita, um revestimento 48 bem-placa com laminina: diluir a laminina de 1 ug / ml em DPBS, adicionar 300 ul de solução em placas e manter a 4 ° C durante 24 h. Um dia mais tarde laminina aspirado das placas e adicionar 200 uL de meio aos poços neuroinduction.
- Lave os 6 bem-placas contendo as colônias para ser retirado uma vez com DPBS e adicionar DPBS 2 ml por poço de 6 bem-placa. Escolha as colônias mecanicamente: raspar em torno de colônias usando uma agulha fina para se livrar das células circundante; definir o 2001; l Pipetman em 50 ul e escolher as colônias utilizando as respectivas pontas de pipeta.
- Transferir uma colônia cada um em um poço de um 48 bem-placa revestida com laminina e gerar uma suspensão única célula mecanicamente por pipetagem cima e para baixo 10 vezes. Adicionar inibidor ROCHA Y27632 numa concentração final de 10 uM para as células.
- Crescer as células na placa de 48 poços-a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 dias. Troque a mídia a cada segundo dia até que as células chegar a 80-90% de confluência (aproximadamente 3 - 4 dias.).
4. Expansão e Cryo-preservação do iNPCs
- Passaging e Expansão da iNPCs
- Aspirar o meio e lava-se as células com DPBS. Aspirar o DPBS e adicionar 200 ul de DPBS / EDTA e incubar durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, adicionar 200 uL de meio DMEM / F12 e remover a partir da placa de suspensão em um tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 minutos .
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de Neuroimeios nduction (Passo 2.2), placa em placas de 12 poços revestidas com laminina e adicionar inibidor ROCHA Y27632 numa concentração final de 10 uM para as células, a cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. Após as células atingem 80-90% de confluência elas podem ser quer expandido ou congelado para baixo como se segue.
- Congelamento de iNPCs
- Aspirar o meio e lava-se as células com DPBS. Aspirar o DPBS e adicionar 300 ul de DPBS / EDTA e incubar durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, adicionar 300 uL de meio DMEM / F12 e remover a partir da placa de suspensão em um tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de meio de congelação comercial NSC. Suspensão transferência para frascos de congelamento e colocar no recipiente de congelamento celular. Armazenar a -80 ° C durante 2 dias, em seguida, transferir para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.
5. Diferenciação de iNPCs
- Diferenciação em direção neurônioal linhagem
- Células de cultura em placas revestidas com laminina, conforme descrito acima. Meios de comunicação para Alterar neuro-diff-meios (DMEM / F-12, 1x atmosfera de N2, 1x B27, 300 ng / ml de cAMP, 200 uM de vitamina C, 10 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF) quando as células são cerca de 70% confluente. Mudança de mídia todos os dias durante três semanas. Fazer células não divididas durante a diferenciação.
- Depois de três semanas as células devem expressar o marcador neuronal TUJ1. Para ganhar mais neurônios maduros e subtipos neuronais continuar diferenciação até 3 meses.
- Diferenciação em direção linhagem glial
- Mudar meios para meios de indução da glia (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x atmosfera de N2, 1x B27, 10 uM β-mercaptoetanol, 100 uM aminoácidos não essenciais 1,5 mM, L-glutamina, insulina 5 ug / ml, 40 ng / ml de T3) incluindo 20 ng / mL de EGF para induzir a diferenciação em células progenitoras gliais. Retire metade dos meios de comunicação e substituir por meios frescos todos os dias durante cerca de 2 semanas. Durante este período, as células devem ser dividida1: 3 na presença de 10 uM de inibidor ROCHA Y27632 100% de confluência quando for atingido.
- Após 2 semanas diferenciar células ainda em astrócitos: quando as células são mídias de mudança quase confluentes a mídia astrocyte comercial disponível, alteração de mídia a cada segundo dia. Após cerca de 7 dias as células começam a expressar marcadores de astrócitos (por exemplo, GFAP). Se as células obter 100% confluentes durante o protocolo de diferenciação, dividi-los em uma proporção de 1: 2 na presença de 10 uM de inibidor ROCHA Y27632.
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Representative Results
Aqui apresenta-se descrição de um processo integrado que permite a geração de células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) a partir de fibroblastos humanos que tenham sido obtidos por uma biópsia por punção da pele em menos de 8 semanas (Figura 1). INPCs paciente-specifc pode ser ainda mais diferenciado em linhagens neuronais e gliais e abrigar um enorme potencial para a terapia de substituição de células e modelagem doença.
Infecção dos fibroblastos com Oct4-, Klf4-, Sox2- e c-myc- vírus Sendai 23 e cultura em condições de meios neuroinductive 22,31 resultou numa mudança de morfologia de fibroblastos e subsequente aparecimento de colónias de 17 dias após a infecção (Figura 2). Linhas celulares monoclonais gerados podem ser expandidos e mancha positiva para os marcadores de células estaminais neurais como Sox2, Sox1, nestina, vimentina, OTX2 e Pax6, bem como para o marcador de proliferação Ki67, ao passo que eles não expressam o pluripotency-marcadora associada Oct4 (Figura 3).
Além disso, por adição de factores de crescimento neuronais ao meio de cultura celular das células progenitoras neurais podem ser diferenciadas em neurónios. Através da aplicação de um protocolo com base na diferenciação Izrael et al. 42 e diferenciação final subsequente com linhas de células de astrócitos meio de indução também podem ser diferenciadas em linhagens gliais como julgado por análise de alterações morfológicas típicas e coloração contra a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) (Figura 4 ).
Figura 1. Representação esquemática do protocolo de três passos aplicado neste estudo. Os fibroblastos podem ser isolados a partir de pacientes por uma biópsia por punção e expandido. Estas linhas de células podem então ser convertidos directamente em células induzidas progenitoras neurais multipotentes (iNPCs) e Monoclonally expandida. linhas INPC pode ser usado para armazenamento a longo prazo (biobanking para uso repetido ou padronizado) ou eles podem ser diferenciados em linhagens neuronais e gliais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. análises morfológicas de conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neuronais induzidas por meio de microscopia de contraste de fase (A) de fibroblastos humanos, três dias após a infecção com OKSM -. Vírus Sendai e dois dias após a adição do meio de neuroinduction. As células mostram a morfologia de fibroblastos-like típico. (B) Sete dias após a infecção de células com morfologia alterada aparecer. As células são divididas para reduzir confluência no mesmo dia. (C) Dez diass infecção pós única células com morfologia alterada estão presentes. (D) As primeiras colônias pequenas neuroepiteliais-like podem ser encontrados 17 dias após a infecção. Estas colónias aumentar de tamanho (E), e células superando pode ser encontrado (M), três dias mais tarde. As células são colhidas em linhagens de células expansíveis 21 dias após a infecção e pode ser gerado a partir deles (GI). Diferentes clones estão apresentados na passagem 1 (L), a passagem 3 (H) e a passagem 10 (I), após a separação, respectivamente. Barra de escala = 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise da expressão genética de células estaminais neurais de marcador gerado cel progenitora neuronall linhas. coloração de anticorpos de linhas de células depois de 10 passagens revelaram que as células expressam marcadores de células estaminais neurais Sox1, Sox2 (A), bem como a nestina e Pax6 (B). As células são negativas para pluripotência Oct4 marcador indicando ausência de pluripotência (C). A maioria das células coram positivo para o marcador de Ki67, que mostra um estado proliferativo elevado (C). Barra de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Análise de NPCs depois dirigido diferenciação em linhagens neuronais e gliais. (A) Para alcançar iNPCs especificação neuronais foram diferenciadas durante sete dias na presença de BDNF, GDNF, vitamina C e AMPc. (B) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós mostramos o isolamento e conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais livre de transgenes expansíveis e sua progênie diferenciada como base putativo para a terapia de substituição de células ou aplicação em análises de despistagem de drogas. Conversão directa linhagem de células somáticas em NPCs foi conseguido através da expressão forçada de transcrição específicos de linhagem factores 26,33,34. No entanto, em muitos casos, fibroblastos fetais foram usadas para experiências transdiferenciação 33,34. Para aplicações biomédicas, o uso destas células é inconveniente como esta fonte celular impede a utilização clínica para a terapia de substituição de células autólogas. Recentemente, foram publicados estudos que descrevem a geração de células progenitoras neurais a partir de tecidos mais facilmente acessíveis, tais como células hematopoiéticas 43,44. A geração bem sucedida de linhas de células estaminais neurais tripotent pôde ser mostrado para células B derivadas do sangue de murino pelo overexpr indutívelEsion de oito transgenes 43. Além disso, Castano et ai. Publicaram uma abordagem para a indução de células progenitoras neuronais a partir de células hematopoiéticas humanas utilizando Sox2- e c-myc-vírus Sendai 44. O protocolo descrito permite a geração rápida e eficiente de células neurais a partir de células do sangue do cordão CD133 +. No entanto, quando aplicado para a conversão de células mononucleares de sangue periférico adulto o protocolo produziu uma baixa eficiência e a capacidade de expansão das linhas de células geradas foi muito limitada 44. Assim, o único estudo publicado com células de sangue periférico no sistema humano até à data 44 mostra claramente as limitações deste tipo particular de células em experiências de conversão directa. Uma vez que a disponibilidade de células específicas do paciente é crucial para a substituição de células autólogas, o tipo de célula preferido ainda representam fibroblastos adultos, que podem ser facilmente derivados por meio de um perfurador de biópsia de pele, como descrito no nosso estudo.
O overexpreSsion de transgenes necessários para a transdiferenciação foi conseguida principalmente por vectores virais integrativos 26,33,34. Isto dificulta a aplicabilidade das linhas celulares derivadas para aplicações biomédicas uma vez que a integração dos vírus no genoma do hospedeiro pode levar a mutagénese de inserção ou reactivação indesejada dos transgenes 7,8. Transdiferenciação em NPCs sem sobre-expressão do transgene, mas com base no tratamento químico foi descrito para os fibroblastos humanos 45. No entanto, neste estudo, estas células precursoras foram apenas presente em um estado transitório como o objectivo do estudo foi a geração de células de Schwann 45 madura. Recentemente, outras abordagens livre de transgenes com base na aplicação de vírus Sendai foram descritos para a conversão directa de fibroblastos humanos em NPCs 23,44 e parecem ser a estratégia preferida até à data. Para derivar NPCs expansíveis que podem ser subsequentemente diferenciados em linhagens neuronais e gliais,que se aplicam sobre-expressão de todas as Yamanaka-factores pelo vírus Sendai, juntamente com inactivação de vírus de calor 23, bem como a indução neural por adição de moléculas pequenas para o meio de cultura 22,31 com modificações importantes, como se descreve a seguir.
Embora, nas nossas mãos, o protocolo é eficientemente trabalhando com muitas linhas de fibroblastos testados, há uma tendência evidente que a conversão directa de células de fibroblastos a partir de doadores de idade que apresenta um fraco resultado potencial proliferativo numa baixa eficiência de geração INPC. Observou-se a eficiência de formação de colónias de até 0,2% após uma eficiência de transdução virai superior a 90% tal como avaliado por infecção de células com Oct4 única e subsequente coloração. Esta eficiência é cerca de 3 vezes mais elevada do que anteriormente publicado 23.
A aplicação precisamente ajustada de uma MOI viral optimizado é crítica. Batch à variabilidade do lote em Sendai título de vírustem de ser tida em conta. Desde que o vírus é geralmente adquirida comercialmente, respectivas informações podem ser encontradas no site do fabricante. Nós sugerimos usar um relativamente baixo MOI de 3 para experimentos transdiferenciação.
A adição de LIF humano nas nossas mãos é crucial para a auto-renovação das linhas INPC estabelecidas como já foi descrito para a diferenciação de células pluripotentes humanas em 31 NPCs. Sem adição de LIF, as células começam a diferenciar mais cedo, dois dias após a retirada de uma forma não-reversível.
A cultura de células após a infecção é realizada a 39 ° C e não usando 37 ° C condições de cultura de células padrão. Este aumento de temperatura já iniciado um dia após a infecção e conduz a um calor-inactivação do vírus Sendai. A cultura a 39 ° C até ao dia 14 após a infecção é essencial para a geração de colónias neuroepiteliais.
De fato, às vezes colônias INPC chegar mais tarde do que o descrito na seção de protocolo. Na nossa experiência, enquanto as células permanecem proliferativa que pode ser policlonal passadas e isolados por colheita manual. As linhas de células estabelecidas a partir dessas colónias apresentam propriedades semelhantes às descritas para as primeiras colónias que ocorrem.
Durante a cisão de linhas celulares estabelecidas que não é importante para semear um muito pequeno número de células em que requerem contactos célula-a-célula ou sinais parácrinos a proliferar bem. Se as células são semeadas em placas de proliferação muito baixa densidade cessará. Neste caso, as células podem ser resgatados por replating em um prato de cultura de células com uma superfície menor de re-iniciar a proliferação.
Para a diferenciação da glia de iNPCs é muito importante para propagar as células em uma elevada densidade e a dividi-los, quando a placa é quase confluentes. Se as células são divididas muito cedo, a diferenciação neuronal predominantemente será observado.
conteúdo "> O processo descrito neste manuscrito abriga o potencial a ser aplicado de uma forma semi-automatizada ou totalmente, o que seria necessário para alcançar o potencial biomédico desejado, incluindo a doença de modelagem e terapia de substituição de células. A automação também permitiria custo o aumento de escala eficiente e paralelização da geração de células progenitoras neurais.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a todos os membros da célula-tronco e medicina regenerativa Grupo da Universidade de Würzburg para sugestões úteis e Martina Gebhardt, bem como Heike Arthen para excelente suporte técnico. Este trabalho foi financiado por doações do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), o Ministério da Educação e Investigação alemão BMBF (01 GN 0813), os bávaros pesquisa Rede pluripotentes induzidas Stem Cells "forIPS" eo "Stiftung Sibylle Assmus ". A Figura 1 foi produzido usando Servier arte médica, disponível a partir de www.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
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