Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

वयस्क मानव fibroblasts की व्युत्पत्ति और विस्तार तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में उनके प्रत्यक्ष रूपांतरण

Published: July 29, 2015 doi: 10.3791/52831
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3, 1,2
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Würzburg, 2Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn, 3German Cancer Research Center, Heidelberg

Summary

प्रेरित स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण की व्युत्पत्ति के लिए आकर्षक संभावनाओं प्रदान करता है। हालांकि, एक pluripotent राज्य और श्रमसाध्य फिर से भेदभाव के माध्यम से प्रगति अभी भी नैदानिक ​​अनुवाद hinders। यहाँ हम वयस्क मानव fibroblasts की व्युत्पत्ति और प्रेरित तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं में उनके प्रत्यक्ष रूपांतरण और तंत्रिका प्रजातियों में बाद में भेदभाव का वर्णन है।

Abstract

दैहिक कोशिकाओं में वयस्क त्वचा fibroblasts से प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) और बाद में भेदभाव का सृजन उतक अनुरूपता बाधाओं को दरकिनार कि ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण की व्युत्पत्ति के लिए आकर्षक संभावनाओं प्रदान करता है। हालांकि, एक pluripotent राज्य और इच्छित प्रजातियों में बाद में पूरा भेदभाव के माध्यम से प्रगति क्योंकि एसोसिएटेड नियोप्लास्टिक क्षमता और जीनोमिक अस्थिरता की IPSC प्रौद्योगिकी के नैदानिक ​​अनुवाद के लिए एक अंधी गली बनी हुई है। हाल ही में, हम और अन्य लोगों के दैहिक कोशिकाओं केवल जिससे pluripotent राज्य के माध्यम से प्रगति circumventing, परिभाषित कारकों का उपयोग करके IPSCs में भी है लेकिन multipotent दैहिक स्टेम कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार में परिवर्तित नहीं किया जा सकता है कि पता चला है। विशेष रूप से, प्रेरित तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (iNPCs) में मानव fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण इस तरह के सेल प्रतिस्थापन, रोग मॉडलिंग के रूप में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एक उपन्यास ऑटोलॉगस सेल स्रोत की संभावना heraldsऔर दवा स्क्रीनिंग। यहाँ, हम समय पर प्रतिबंधित Oct4, Sox2, Klf4 की अभिव्यक्ति है, साथ ही सी-Myc द्वारा iNPCs में त्वचा बायोप्सी और उनके कुशल प्रत्यक्ष रूपांतरण द्वारा वयस्क मानव प्राथमिक fibroblasts की अलगाव का वर्णन है। Sox2 पॉजिटिव neuroepithelial कालोनियों शामिल करने के 17 दिनों के बाद दिखाई देते हैं और INPC लाइनों मोनोक्लोनल अलगाव और विस्तार से कुशलता से स्थापित किया जा सकता है। शामिल चरण के दौरान संक्रमण और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक की पूरकता के वायरल बहुलता की सटीक समायोजन अप करने के लिए 0.2% की रूपांतरण क्षमता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कारकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस प्रकार अब तक, रोगी-विशिष्ट INPC लाइनों अधिक से अधिक 12 मार्ग के लिए विस्तार किया है और समान रूप से इस तरह के nestin और Sox2 की अभिव्यक्ति के रूप में तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की रूपात्मक और आणविक सुविधाओं को प्रदर्शित किया जा सकता है। क्रमशः TUJ1 और GFAP के खिलाफ धुंधला द्वारा न्याय के रूप में INPC लाइनों न्यूरॉन्स और astrocytes में भेदभाव किया जा सकता है। अंत में, हम व्युत्पत्ति और सख्त करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल रिपोर्टऐसे ऑटोलॉगस तंत्रिका कोशिका प्रतिस्थापन और रोग मॉडलिंग के रूप में जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक सेलुलर स्रोत प्रदान हो सकता है कि स्थिरतापूर्वक विस्तार योग्य तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं में मानव fibroblasts की सीटी रूपांतरण।

Introduction

2006 में यामानाका और उनके सहयोगियों ने पहली बार के लिए एक pluripotent राज्य 1 में दैहिक कोशिकाओं के reprogramming की संभावना दिखा सकता है। इस dedifferentiation Oct4, Sox2, Klf4, और सी-Myc murine fibroblasts में चार प्रतिलेखन की overexpression द्वारा कारकों हासिल की थी। उत्पन्न तथाकथित प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) के लिए कार्यात्मक तुल्यता दिखाने के लिए और इस प्रकार वयस्क जीव की सभी प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है। बाद में IPSCs को reprogramming एक साल भी मानव fibroblasts 2 के लिए प्राप्त किया जा सकता है। पशु मॉडल में प्रयोगों IPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं आम तौर पर पार्किंसंस रोग (पीडी) में जैसे सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी, 3-5 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है। हालांकि, IPSCs के इस्तेमाल से जुड़े कई सीमाएं उनके चिकित्सीय क्षमता का पूरा अहसास के लिए बाधाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक pluripotent राज्य और बाद में कोशिकाओं के reprogramming, सब से पहलेगुणवत्ता नियंत्रण आम तौर पर एक समय लेने वाली और व्यापक है और इस तरह महंगा सेल संस्कृति प्रक्रियाओं में से बेदखल अक्षम प्रक्रिया है। दूसरा, IPSCs एक महत्वपूर्ण tumorigenic संभावित बंदरगाहों जैव चिकित्सा आवेदन से पहले ब्याज के वांछित सेल प्रकार और विभेदित आबादी में अवशिष्ट pluripotent कोशिकाओं की संभावना में फिर से भेदभाव किया जा करने की जरूरत है और इस प्रकार कोशिका प्रत्यारोपण 6 के बाद एक उच्च जोखिम प्रदर्शित करता है। तीसरा, reprogramming प्रक्रिया आम तौर पर lenti- या रेट्रोवायरल संक्रमण से reprogramming के कारकों उत्प्रेरण द्वारा हासिल की है। मेजबान जीनोम में इन वायरस के एकीकरण insertional उत्परिवर्तजनन और / या ट्रांसजीन 7,8 के अनियंत्रित पुनर्सक्रियन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। गैर-एकीकृत प्रणालियों insertional उत्परिवर्तजनन और transgene पुनर्सक्रियन के जोखिम को कम है, जो कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए reprogramming के कारकों वितरित करने के लिए विकसित किया गया है। इन transgene से मुक्त दृष्टिकोण के लिए उदाहरण गैर समेकित करने का उपयोग कोशिकाओं की reprogramming हैंएडिनो या सेंडाइ वायरस 9,10, डीएनए आधारित वैक्टर 11 या पुनः संयोजक प्रोटीन 13,14 के सिंथेटिक mRNA के 12 या पारगमन के अभिकर्मक की तरह डीएनए से मुक्त तरीकों के आवेदन,। Transgene मुक्त IPSC की व्युत्पत्ति के लिए एक और होनहार विधि loxP संशोधित lentiviral reprogramming के निर्माणों और रचनात्मक-loxP डीएनए पुनर्संयोजन प्रणाली 15,16 का उपयोग कर ट्रांसजीन के बाद के विलोपन का इस्तेमाल होता है।

सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी बाद mitotic न्यूरॉन्स 17-20 में fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण का प्रतिनिधित्व करता है के लिए एक और अधिक सरल दृष्टिकोण तंत्रिका कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए। Vierbuchen एट अल। प्रतिलेखन की overexpression murine fibroblasts के 17 से 20% न्यूरॉन्स की पीढ़ी में Ascl1, Brn2 और Myt1l परिणामों कारकों की सूचना दी। 2011 में यह NeuroD1 की overexpression के साथ संयोजन में ही तीन प्रतिलेखन कारक Neu में मानव fibroblasts की transdifferentiation कि सक्षम, दिखाया गया थाRons 19। मानव प्रेरित न्यूरॉन्स भी दोहरी SMAD- और GSK3β- निषेध 20 के तहत Ascl1 और Ngn2 की overexpression द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। विशेष रूप से, न्यूरॉन्स में fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण आगे विस्तार और biobanking की अनुमति नहीं है कि एक गैर प्रफलन, बाद mitotic सेल की आबादी उत्पन्न करता है।

हाल ही में, एक proliferating तंत्रिका स्टेम / पूर्वज सेल की आबादी में fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण 21-26 सूचना मिली थी। स्पष्टता के लिए, इन सभी प्रकार की कोशिकाओं इस रिपोर्ट में प्रेरित तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (iNPCs) के रूप में नामित किया जाएगा। हान एट अल। INPCs उत्पन्न करने के लिए Brn4, Sox2, सी Myc और Klf4 overexpressed। प्राथमिक ऊतक या pluripotent या तो कोशिकाओं से व्युत्पन्न उनके तंत्रिका स्टेम सेल समकक्षों की तरह इन iNPCs tripotential हैं और न्यूरॉन्स, astrocytes और oligodendrocytes 21 में भेदभाव किया जा सकता है। हमारे समूह Sox2, Klf4 की overexpression से जुड़े एक अलग रूपांतरण प्रोटोकॉल सूचना दीसी-Myc और केवल 5 दिनों के लिए प्रेरित Oct4-अभिव्यक्ति और। इस दृष्टिकोण के साथ हम reprogramming के 22 कारकों का पूरा मुंह बंद दिखा रहे हैं कि murine भ्रूण और वयस्क fibroblasts से स्थिरतापूर्वक proliferating iNPCs उत्पन्न कर सकता है। IPSCs के विपरीत, iNPCs प्रत्यारोपण के बाद 27 एक tumorigenic संभावित प्रदर्शन नहीं करते। हम iNPCs चिकित्सकीय 22 उपयोगी होते हैं कि प्रदर्शन, एक जानवर demyelination के मॉडल, माइलिन कमी चूहों में सफलतापूर्वक कोशिकाओं परिवर्तित करते थे। तब तक, NPCs के ही स्टेम सेल या प्राथमिक तंत्रिका ऊतक 28-32 से उत्पन्न हो सकता है। iNPCs cryopreserved और न्यूरॉन्स, astrocytes और oligodendrocytes में अंतर करने में सक्षम हैं कि हो सकता है स्थिरतापूर्वक विस्तार योग्य कोशिकाओं रहे हैं। बहुत प्रयास मानव कोशिकाओं 23,26,33,34 करने के लिए माउस से प्रत्यक्ष रूपांतरण प्रोटोकॉल अनुकूल बनाया गया है। 2012 में यह fibroblasts में एक कारक Sox2 की overexpression murine और मानव iNPCs उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है कि प्रकाशित किया गया था 34 या तो की overexpression द्वारा मानव भ्रूण fibroblasts से न्यूरोनल प्रतिबंधित progenitors के पीढ़ी का वर्णन है। उत्पन्न सेल लाइनों आत्म नवीकरण क्षमता दिखाई और टर्मिनल न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकारों में भेदभाव किया जा सकता है। इन कोशिकाओं विषम मूल के हैं और एक अवशिष्ट जैसे, तैयारी में तंत्रिका शिखा स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति को अलग नहीं कर सकते हैं लेकिन, जैसा कि भ्रूण fibroblasts की उपयोग, प्रतिकूल है। 2014 में, झू एट अल। मानव वयस्क और नव के प्रत्यक्ष रूपांतरण सूचना दीअकेले Oct4 या Oct4 के साथ मिलकर Sox2 की overexpression और सेल संस्कृति मीडिया के लिए छोटे अणुओं के अलावा द्वारा tripotential तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं में प्रसव fibroblasts। विशेष रूप से, अपनी पढ़ाई Sox2 के आधार पर अकेले प्रत्यक्ष रूपांतरण 26 को प्रेरित करने के लिए अपर्याप्त था। हाल ही में, लू एट अल। यामानाका की overexpression विस्तार योग्य tripotential तंत्रिका की पीढ़ी में तापमान में वृद्धि के परिणाम से वायरस के 24 घंटा और बाद में निष्क्रियता के लिए सेंडाइ वायरस से Oct4-, Sox2-, Klf4-, सी Myc कारकों की रिपोर्ट है कि अग्रदूत कोशिकाओं 23। मानव कोशिकाओं के लिए प्रकाशित रूपांतरण प्रोटोकॉल इस प्रकार अब तक एक समय पर प्रतिबंधित ढंग से अक्सर यामानाका कारकों में से कम से कम एक या अधिक है, के आम overexpression में है, हालांकि अंत में, प्रत्यक्ष ड्राइव करने के लिए आवश्यक न्यूनतम आणविक कारकों में से कोई स्पष्ट संकेत नहीं है iNPCs में रूपांतरण। या तो आनुवंशिक साधन के द्वारा Oct4 का समय पर प्रतिबंधित overexpression, सिंथेटिक mRNA के साथ अभिकर्मक, या सीएक साथ Sox2, KLF-4, और सी-Myc के विधान अभिव्यक्ति के साथ पक्ष-permeant प्रोटीन अभी तक स्थिर मानव INPC लाइनों में परिणाम नहीं था। इस प्रकार, सेंडाइ वायरस के आवेदन के सभी यामानाका कारकों overexpress करने के लिए और समय पर 22,31 इस प्रकार अब तक वरीय रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है एक साथ अनुकूलित तंत्रिका मीडिया प्रेरण शर्तों के साथ वायरस 23 की गर्मी निष्क्रियता से उनकी गतिविधियों को सीमित।

कई अध्ययनों से एनएससी या विभिन्न पशु रोग मॉडल में उनके विभेदित समकक्षों के सेलुलर कार्यक्षमता प्रदर्शित करता है। मानव स्टेम सेल से तंत्रिका progenitors कई 35,36 काठिन्य neuroinflammatory विकार के माउस मॉडल में प्रत्यारोपित किया गया है। EAE में hESC व्युत्पन्न तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं की प्रयोज्यता (प्रायोगिक स्व-प्रतिरक्षित इंसेफैलोमाईलिटिस) -mice पहली बार 2008 में दिखाया गया था 35। multipotent तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं माउस मस्तिष्क के निलय में इंजेक्शन थे, और प्रत्यारोपण परिणामEAE के नैदानिक ​​लक्षण को कम करने में एड। किम एट अल। HESCs से oligodendroglial व्यापारियों और उत्पन्न EAE-चूहों में intracerebroventricularly उन प्रत्यारोपित। प्रत्यारोपण के 10 से अधिक दिनों के लिए जीवित नहीं किया है, चूहों स्नायविक समारोह और सफेद पदार्थ 36 में proinflammatory प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कमी के महत्वपूर्ण सुधार दिखाया। स्टेम सेल थेरेपी भी NPCs के सफलतापूर्वक संबंधित पशु मॉडल में नियोजित किया जा सकता है के रूप preclinically पार्किंसंस रोग के लक्षित करने के लिए लागू किया गया है। इस के लिए, मूल कोशिकाओं या तो स्टेम सेल 38-40 या 41 का इस्तेमाल किया गया mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से भेदभाव भ्रूण के मस्तिष्क के ऊतकों 37 से निकाले गए थे। 2012 में हम माउस iNPCs माइलिन की कमी (एमडी) चूहों 22 के दिमाग में प्रत्यारोपण के बाद proteolipid प्रोटीन, प्रमुख माइलिन प्रोटीन घटक, उत्पादन कर रहे हैं कि पता चला है। कि सबूत के सिद्धांत प्रयोग चिकित्सकीय applicabil तकiNPCs के अल्पसंख्यक सबसे पहले सिद्ध और जल्द ही एक अन्य अध्ययन में 32 से पुष्टि की गई। बहरहाल, मानव iNPCs के चिकित्सकीय प्रयोग की पूरी क्षमता का पता लगाया जाना बाकी है।

यहाँ हम त्वचा बायोप्सी के माध्यम से वयस्क रोगियों से मानव प्राथमिक कोशिकाओं (i) व्युत्पत्ति का एक मजबूत और एकीकृत प्रक्रिया दिखाने के लिए, (ii) तंत्रिका पूर्वज राज्य और iNPCs (iii) की क्षमता में मानव fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण न्यूरोनल में भेदभाव किया जा करने के लिए और glial प्रजातियों। इस प्रोटोकॉल का उपयोग चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए ऑटोलॉगस मानव कोशिकाओं की पीढ़ी में तेजी लाने में मदद मिलेगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस अध्ययन में इस्तेमाल मानव fibroblasts वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय, जर्मनी की नैतिकता समिति द्वारा सहमति और नैतिक निकासी सूचित मिलने के बाद एक त्वचा पंच बायोप्सी से प्राप्त किया गया (नैतिक रिपोर्ट नहीं: 96/11 2011/10/06 दिनांकित)।

1. पंच बायोप्सी

  1. रोगी की त्वचा कीटाणुरहित। Intracutaneously 0.5 मिलीलीटर करने के लिए 1 mepivacaine हाइड्रोक्लोराइड का उपयोग कर बायोप्सी (अधिमान्यतया एक कम धूप में उजागर क्षेत्र) से ले जाया जाएगा, जिनमें से त्वचा भाग anesthetize और एक बाँझ 3mm बायोप्सी पंच का उपयोग त्वचा बायोप्सी तैयार करते हैं, DPBS के साथ बायोप्सी + 1 μl / 1ml Gentamicin कुल्ला और निकालने वसा। DPBS + Gentamicin, Dispase द्वितीय के साथ महाप्राण DPBS के पूरी तरह से और कवर बायोप्सी (2.4 यू / एमएल) के साथ दो बार बायोप्सी कुल्ला और 16 सेते - 4 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटा।
  2. महाप्राण Dispase पूरी तरह से, DPBS के साथ दो बार धोने और चिमटी के साथ बाह्य त्वचा को हटा दें। 15 मिलीलीटर ट्यूब में, स्थानांतरण 2 मिलीलीटर Collagenase टाइप 2 (500 यू / एमएल सीडीयू) जोड़ने के लिए, DPBS के साथ दो बार बायोप्सी धो लें और Collagena जोड़नेएसई अप करने के लिए 5 मिलीलीटर कुल मात्रा। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 45 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. अपकेंद्रित्र 5 180 XG पर न्यूनतम और बाद में सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 180 x जी पर 5 मिनट के लिए फिर से 10 मिलीलीटर DMEM-एफसीएस-Gentamicin मीडिया (10% एफसीएस, 1 μl / एमएल Gentamicin) और अपकेंद्रित्र में resuspend गोली। 1.5 मिलीलीटर DMEM-एफसीएस-Gentamicin मीडिया में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें। पक्षपाती टिशू कल्चर फ्लास्क T25 और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते पर स्थानांतरण।
  4. हर 3 दिन मीडिया बदलें।
  5. बाद लगभग 2 सप्ताह, कोशिकाओं त्वचा भागों, trypsin / EDTA (0.05%) का उपयोग कर विभाजित कोशिकाओं के चारों ओर मिला हुआ हैं जब: धो कोशिकाओं एक बार DPBS के साथ, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट सेते हैं, 5% सीओ 2 के 2 मिलीलीटर trypsin / EDTA के अलावा के बाद (0.05%), DMEM-एफसीएस-Gentamicin मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने के 5 मिनट के लिए 180 XG पर 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए स्थानांतरण; DMEM-एफसीएस-Gentamicin मीडिया की उचित मात्रा में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें।
  6. इसके अलावा मध्यम हर 3 आर बदलकर कोशिकाओं का विस्तारकोशिकाओं मिला हुआ हैं जब ऊपर वर्णित के रूप में डी दिन और बंटवारे; Gentamicin के अलावा के पारित होने के 2 के बाद बंद कर दिया जा सकता है।
  7. प्रत्यक्ष रूपांतरण के प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले, मानक assays के द्वारा माइकोप्लाज्मा संदूषण बाहर करने के लिए सुनिश्चित करें।
  8. कोशिकाओं का विस्तार किया गया है, तो आप सीधे रूपांतरण शुरू या 10% DMSO और 90% एफसीएस का उपयोग कोशिकाओं नीचे स्थिर हो सकता है। कोशिकाओं 2 दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत और फिर लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए।
  9. रूपांतरण की तैयारी के लिए, DPBS, महाप्राण DPBS के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने और 2.5 मिलीलीटर trypsin / EDTA (0.05%) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 5 मिनट के लिए रखें। ठोकर कुप्पी धीरे तंतुप्रसू मीडिया के 2.5 एमएल (DMEM incl। एल ग्लू + 10% एफसीएस + 1% NEAA + 1% सोडियम पाइरूवेट) में, resuspend कोशिकाओं को अलग कर 15 मिलीलीटर ट्यूब को स्थानांतरित करने के लिए। 5 मिनट के लिए 180 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। 1 मिलीलीटर नीचे तंतुप्रसू मीडिया और विंदुक ऊपर और में Resuspend कोशिकाओं एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करने के लिए। </ ली>
  10. एक फुच्स-Rosenthal- या Neubauer-सेल गिनती कक्ष और थाली में एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 3 एक्स 10 4 कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं की संख्या की गणना। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 हे / एन सेते हैं।

सेंडाइ वायरस और Transdifferentiation साथ मानव fibroblasts 2. संक्रमण

नोट: वायरस से निपटने के लिए निम्न चरणों का एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट और एक लामिना का प्रवाह हुड में और श्लैष्मिक प्रदर्शन को रोकने के लिए उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, विशेष रूप से एक सर्जिकल मास्क, के साथ प्रदर्शन किया जा रहा है, सुरक्षा को सुनिश्चित करने के लिए।

  1. 100 μl तंतुप्रसू मीडिया (चरण 1.9) के लिए कोशिकाओं स्विच करें। Oct4-, Klf4-, Sox2- की aliquots और सी-MYC-सेंडाइ वायरस गला लें और 1 मिलीलीटर तंतुप्रसू मीडिया में प्रत्येक वायरस resuspend। कोशिकाओं के लिए 3 के एक MOI (वायरस अनुमापांक बहुत कुछ करने के लिए बहुत से भिन्न होता है, लेकिन प्रत्येक वायरस में से एक विभाज्य आम तौर पर एक 24 अच्छी तरह से थाली के 10 कुओं में से संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) के साथ एक वायरस जोड़ें और धीरे मिश्रण। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 हे / एन सेते
  2. और 24 घंटा महाप्राण के बाद मध्यम और neuroinduction मीडिया (: 1 DMEM / F-12 Neurobasal, 1x एन 2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 एनजी / एमएल hLIF, 3 माइक्रोन CHIR99021, 2 माइक्रोन SB431542 1) के 500 μl जोड़ने अब से 39 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में संस्कृति। हर दूसरे दिन मीडिया बदलें।
  3. , DPBS में 1 माइक्रोग्राम / एमएल laminin पतला 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना: 6 दिन के संक्रमण के बाद laminin लेपित 6 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करते हैं।
  4. मीडिया महाप्राण और DPBS के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने, तो DPBS / EDTA के 500 μl जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 10 मिनट के लिए सेते हैं: 7 दिन पर संक्रमण के बाद DPBS / EDTA का उपयोग कोशिकाओं को विभाजित।
  5. DMEM / F12 के 500 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 180 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में थाली से निलंबन हटा दें।
  6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और neuroinduction मीडिया, laminin लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर थाली के 1.5 मिलीलीटर में गोली resuspend और एक अंतिम conce में रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 जोड़ने39 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं, संस्कृति के लिए 10 माइक्रोन की ntration, 5% सीओ 2।
  7. हर दूसरे दिन मीडिया बदलें।
  8. संक्रमण संस्कृति के बाद दिन में 14 से 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं, 5% सीओ 2। Neuroepithelial कालोनियों चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा संक्रमण के बाद 17 दिन के आसपास स्पष्ट हो गया है। वे संक्रमण के बाद दिन में 20 के आसपास उठाया जा करने के लिए पर्याप्त बड़ा होना चाहिए।

ख्यात INPC कालोनियों 3. अलगाव

  1. चुनने से पहले एक दिन, कोट एक 48 laminin के साथ अच्छी तरह से थाली: DPBS में 1 माइक्रोग्राम / एमएल laminin पतला प्लेटों पर समाधान के 300 μl जोड़ने के लिए और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं। एक दिन बाद महाप्राण laminin के प्लेटों से और वेल्स को neuroinduction मीडिया के 200 μl जोड़ें।
  2. 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटें कालोनियों युक्त DPBS के साथ एक बार उठाया और जोड़ने जा करने के लिए 2 मिलीलीटर DPBS धो लें। यंत्रवत् कालोनियों उठाओ: कोशिकाओं के आसपास से छुटकारा पाने के लिए एक पतली सुई का उपयोग कालोनियों के आसपास परिमार्जन; 200 सेट1, एल 50 μl पर Pipetman और संबंधित पिपेट युक्तियों का उपयोग कालोनियों उठाओ।
  3. एक laminin लेपित 48 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में एक कॉलोनी प्रत्येक हस्तांतरण और नीचे में 10 बार से ऊपर pipetting और से यंत्रवत् एक एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करते हैं। कोशिकाओं को 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता में रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 जोड़ें।
  4. 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 48 अच्छी तरह से थाली पर कोशिकाओं को विकसित। 90 confluency% (लगभग 3 - -। 4 दिन) कोशिकाओं 80 तक पहुंचने तक हर दूसरे दिन मीडिया बदलें।

4. विस्तार और iNPCs की क्रायो-संरक्षण

  1. Passaging और iNPCs का विस्तार
    1. मध्यम Aspirate और DPBS के साथ कोशिकाओं को धो लें। DPBS के Aspirate और 200 μl DPBS / EDTA जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 10 मिनट के लिए सेते हैं, जोड़ DMEM / F12 के 200 μl और 5 मिनट के लिए 180 XG पर, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में थाली से सेंट्रीफ्यूज निलंबन हटा दें ।
    2. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और neuroi के 0.5 मिलीलीटर में गोली resuspendnduction मीडिया (2.2 चरण), laminin लेपित 12 अच्छी तरह से प्लेटों पर थाली और कोशिकाओं को 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता में रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 जोड़ने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति, 5% सीओ 2। कोशिकाओं को 80 तक पहुंचने के बाद - 90% confluency वे या तो आगे का विस्तार किया जा सकता है या इस प्रकार के रूप नीचे जमे हुए।
  2. INPCs की ठंड
    1. मध्यम Aspirate और DPBS के साथ कोशिकाओं को धो लें। महाप्राण DPBS और 300μl DPBS / EDTA जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 10 मिनट के लिए सेते हैं, DMEM / F12 के 300 μl जोड़ने और 5 मिनट के लिए 180 XG पर, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में थाली से सेंट्रीफ्यूज निलंबन हटा दें।
    2. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और वाणिज्यिक एनएससी ठंड माध्यम के 0.5 मिलीलीटर में गोली resuspend। ठंड शीशियों पर स्थानांतरण निलंबन और सेल ठंड कंटेनर में डाल दिया। 2 दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, तो लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण।

INPCs 5. भेदभाव

  1. न्यूरॉन की दिशा में भेदभावअल वंश
    1. Laminin लेपित प्लेटों पर संस्कृति कोशिकाओं ऊपर वर्णित है। कोशिकाओं लगभग 70% हैं जब न्यूरो अन्तर-मीडिया (DMEM / एफ -12, 1x एन 2, 1x B27, 300 एनजी / एमएल शिविर, 200 माइक्रोन विटामिन सी, 10 एनजी / एमएल BDNF, 10 एनजी / एमएल GDNF) करने के लिए मीडिया को बदलें मिला हुआ। तीन सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन मीडिया बदलें। भेदभाव के दौरान नहीं विभाजित कोशिकाओं करो।
    2. तीन सप्ताह के बाद कोशिकाओं neuronal मार्कर TUJ1 व्यक्त करना चाहिए। अधिक परिपक्व न्यूरॉन्स लाभ और neuronal उपप्रकार 3 महीने के लिए भेदभाव तक जारी करने के लिए।
  2. Glial वंश के प्रति भेदभाव
    1. Glial प्रेरण मीडिया (1 करने के लिए मीडिया को बदलें: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x एन 2, 1x B27, 10 माइक्रोन β-mercaptoethanol, 100 माइक्रोन गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 1.5 मिमी एल Glutamine, 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 40 एनजी / एमएल टी 3) 20 एनजी / एमएल EGF glial अग्रदूत कोशिकाओं में भेदभाव प्रेरित करने के लिए भी शामिल है। मीडिया के आधे से निकालें और के बारे में 2 सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन ताजा मीडिया द्वारा की जगह। इस अवधि के दौरान कोशिकाओं को विभाजित किया जाना चाहिए1: 100% confluency 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 की उपस्थिति में 3 पर पहुंच गया है।
    2. कोशिकाओं वाणिज्यिक उपलब्ध अस्थिकणिका मीडिया के लिए लगभग मिला हुआ परिवर्तन मीडिया रहे हैं, हर दूसरे दिन मीडिया को बदलने: 2 सप्ताह के बाद आगे की astrocytes में कोशिकाओं को अलग। के बारे में 7 दिनों के बाद कोशिकाओं अस्थिकणिका मार्कर (जैसे, GFAP) को व्यक्त करने के लिए शुरू करते हैं। 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 की उपस्थिति में 2 अनुपात: कोशिकाओं भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान 100% मिला हुआ मिलता है, एक 1 में उन्हें विभाजित।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ हम कम से कम 8 सप्ताह (चित्रा 1) के भीतर त्वचा से एक पंच बायोप्सी से प्राप्त किया गया है कि मानव fibroblasts से प्रेरित तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (iNPCs) की पीढ़ी की अनुमति देता है कि एक एकीकृत प्रक्रिया का विवरण प्रस्तुत करते हैं। रोगी-specifc iNPCs आगे neuronal और glial प्रजातियों में भेदभाव और सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी और रोग मॉडलिंग के लिए विशाल क्षमता बंदरगाह जा सकता है।

Oct4-, Klf4-, Sox2- और सी-myc- सेंडाइ के साथ fibroblasts के संक्रमण fibroblasts और 17 दिन के संक्रमण के बाद कालोनियों के बाद के उद्भव की आकृति विज्ञान का एक परिवर्तन के परिणामस्वरूप neuroinductive मीडिया शर्तों 22,31 में 23 और संस्कृति वायरस (चित्रा 2)। वे pluripotency- व्यक्त नहीं करते, जबकि सृजित मोनोक्लोनल सेल लाइनों का विस्तार और Sox2, Sox1, nestin, vimentin, Otx2 और Pax6 जैसे तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर के लिए सकारात्मक दाग है, साथ ही प्रसार मार्कर Ki67 के लिए किया जा सकता हैजुड़े मार्कर Oct4 (चित्रा 3)।

इसके अलावा, सेल संस्कृति मीडिया के लिए न्यूरोनल वृद्धि कारकों के अलावा द्वारा तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं न्यूरॉन्स में भेदभाव किया जा सकता है। Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन के खिलाफ ठेठ morphological परिवर्तन और धुंधला (GFAP) (चित्रा 4 के विश्लेषण से न्याय के रूप में Izrael पर आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल लागू करके एट अल। 42 और अस्थिकणिका प्रेरण मीडिया सेल लाइनों के साथ बाद अंतिम भेदभाव भी glial प्रजातियों में भेदभाव किया जा सकता )।

चित्र 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध इस अध्ययन में लागू तीन कदम प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व। तंतुकोशिकाएं एक पंच बायोप्सी द्वारा रोगियों से अलग है और विस्तार किया जा सकता है। इन सेल लाइनों तो सीधे प्रेरित multipotent तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (iNPCs) और मो में परिवर्तित किया जा सकता हैnoclonally का विस्तार किया। INPC लाइनें (बार-बार या मानकीकृत उपयोग के लिए biobanking) लंबी अवधि के भंडारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या वे neuronal और glial प्रजातियों में भेदभाव किया जा सकता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 के morphological चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रेरित तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं में मानव fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण का विश्लेषण करती है (ए) मानव fibroblasts तीन दिनों OKSM साथ संक्रमण के बाद -। सेंडाइ वायरस और neuroinduction मध्यम के अलावा के बाद दो दिनों के लिए। प्रकोष्ठों ठेठ तंतुप्रसू-जैसे आकृति विज्ञान दिखा। (बी) के सात दिन में बदले आकृति विज्ञान शो के साथ संक्रमण कोशिकाओं के बाद। कोशिकाओं को एक ही दिन पर confluency कम करने के लिए विभाजित कर रहे हैं। (सी) दस दिनपद संक्रमण केवल बदल आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं मौजूद हैं। (डी) पहले छोटे neuroepithelial की तरह कालोनियों 17 दिनों संक्रमण के बाद पाया जा सकता है। इन कालोनियों आकार (ई) में वृद्धि, और outgrowing कोशिकाओं तीन दिन बाद (एफ) पाया जा सकता है। प्रकोष्ठों 21 दिन के बाद संक्रमण और विस्तार सेल लाइनों उन्हें (सैनिक) से उत्पन्न हो सकता है पर चुना जाता है। विभिन्न क्लोन क्रमशः, चुनने के बाद पारित होने के 1 (जी), बीतने 3 (एच) और पारित होने के 10 (आई) में दिखाया जाता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
उत्पन्न तंत्रिका पूर्वज सेल के तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर जीन अभिव्यक्ति की चित्रा 3. विश्लेषणएल लाइनों। सेल लाइनों के एंटीबॉडी धुंधला 10 अंश कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर Sox1, Sox2 (ए) के साथ-साथ nestin और Pax6 (बी) को व्यक्त पता चला है कि बाद। प्रकोष्ठों pluripotency (सी) के अभाव का संकेत pluripotency मार्कर Oct4 के लिए नकारात्मक हैं। कोशिकाओं के बहुमत के एक उच्च proliferative राज्य से पता चलता है जो मार्कर Ki67, (सी) के लिए सकारात्मक दाग। स्केल बार = 50 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
NPCs के चित्रा 4. विश्लेषण के बाद neuronal और glial प्रजातियों में भेदभाव का निर्देश दिया। न्यूरोनल विनिर्देश iNPCs प्राप्त करने के लिए (ए) BDNF, GDNF, विटामिन सी और शिविर की उपस्थिति में सात दिनों के लिए भेदभाव कर रहे थे। (बी) इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ हम अलगाव और विस्तार transgene मुक्त तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं में मानव fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण और सेल-रिप्लेसमेंट थेरेपी या दवा स्क्रीनिंग विश्लेषण में आवेदन के लिए एक आधार के रूप में ख्यात उनके विभेदित संतान दिखाते हैं। NPCs में दैहिक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष वंश रूपांतरण वंश विशेष प्रतिलेखन के लिए मजबूर अभिव्यक्ति 26,33,34 कारकों से हासिल किया गया है। फिर भी, कई मामलों में भ्रूण fibroblasts के transdifferentiation प्रयोगों 33,34 के लिए इस्तेमाल किया गया। इस सेल स्रोत ऑटोलॉगस सेल प्रतिस्थापन उपचार के लिए नैदानिक ​​इस्तेमाल precludes के रूप में जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग बेमतलब है। हाल ही में, पढ़ाई ऐसे hematopoietic कोशिकाओं 43,44 के रूप में अधिक आसानी से सुलभ ऊतकों से तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं की पीढ़ी का वर्णन है कि प्रकाशित किए गए थे। tripotent तंत्रिका स्टेम सेल लाइनों के सफल पीढ़ी inducible overexpr द्वारा murine रक्त प्राप्त बी कोशिकाओं के लिए दिखाया जा सकता हैआठ ट्रांसजीन 43 की esion। इसके अलावा, कास्तानो एट अल। मानव Sox2- का उपयोग कर hematopoietic कोशिकाओं और सी-MYC-सेंडाइ वायरस 44 से neuronal progenitors के शामिल करने के लिए एक दृष्टिकोण को प्रकाशित किया। प्रोटोकॉल CD133 + गर्भनाल रक्त कोशिकाओं से तंत्रिका कोशिकाओं के तेज और कुशल पीढ़ी के लिए सक्षम बनाता का वर्णन किया। वयस्क परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear के रूपांतरण के लिए आवेदन किया है लेकिन, जब प्रोटोकॉल कम दक्षता और उत्पन्न सेल लाइनों के विस्तार क्षमता बहुत 44 सीमित था झुकेंगे। इस प्रकार, तारीख 44 मानव प्रणाली में परिधीय रक्त कोशिकाओं के साथ प्रकाशित केवल अध्ययन स्पष्ट रूप से प्रत्यक्ष रूपांतरण प्रयोगों में इस विशेष सेल प्रकार की सीमाओं से पता चलता है। रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं की उपलब्धता ऑटोलॉगस सेल प्रतिस्थापन के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से, वरीय सेल प्रकार अभी भी हमारे अध्ययन में वर्णित के रूप में आसानी से एक त्वचा पंच बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जो वयस्क fibroblasts का प्रतिनिधित्व करते हैं।

overexpretransdifferentiation के लिए आवश्यक transgenes की ssion ज्यादातर एकीकृत वायरल वैक्टर 26,33,34 द्वारा हासिल किया गया है। मेजबान जीनोम में वायरस के एकीकरण insertional उत्परिवर्तजनन या ट्रांसजीन 7,8 के अवांछित पुनर्सक्रियन तक ले सकता है के बाद से इस जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए ली गई कोशिका लाइनों की प्रयोज्यता hinders। Transgene overexpression बिना NPCs में Transdifferentiation लेकिन रासायनिक उपचार के आधार पर मानव fibroblasts 45 के लिए वर्णित किया गया है। अध्ययन का उद्देश्य परिपक्व श्वान कोशिकाओं 45 की पीढ़ी के रूप में था हालांकि, इस अध्ययन में इन अग्रदूत कोशिकाओं को एक क्षणिक राज्य में ही मौजूद थे। हाल ही में, सेंडाइ वायरस के आवेदन के आधार पर अन्य transgene से मुक्त दृष्टिकोण NPCs के 23,44 में मानव fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण के लिए वर्णित है और तिथि करने के लिए पसंदीदा रणनीति लग रहे हो गया है। बाद में neuronal और glial प्रजातियों में भेदभाव किया जा सकता है कि विस्तार योग्य NPCs के प्राप्त करने के लिए,निम्नलिखित में वर्णित के रूप में हम महत्वपूर्ण संशोधनों के साथ संस्कृति मीडिया 22,31 करने के लिए छोटे अणुओं के अलावा द्वारा गर्मी वायरस 23 की निष्क्रियता के साथ ही तंत्रिका प्रेरण के साथ मिलकर सेंडाइ वायरस से सभी यामानाका कारकों की overexpression लागू होते हैं।

हमारे हाथ में, प्रोटोकॉल कुशलता का परीक्षण कई तंतुप्रसू लाइनों के साथ काम कर रहा है, हालांकि, पुराने दाताओं से fibroblast कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रूपांतरण INPC पीढ़ी के एक कम क्षमता में एक गरीब proliferative संभावित परिणाम का प्रदर्शन करते है कि एक स्पष्ट प्रवृत्ति है। हम Oct4 केवल और बाद में धुंधला के साथ कोशिकाओं के संक्रमण से न्याय के रूप में 90% से अधिक की एक वायरल पारगमन दक्षता के बाद अप करने के लिए 0.2% की क्षमता कॉलोनी बनाने मनाया। इस दक्षता पहले से 23 प्रकाशित की तुलना में लगभग 3 गुना अधिक है।

एक अनुकूलित वायरल MOI के ठीक समायोजित आवेदन महत्वपूर्ण है। सेंडाइ वायरस अनुमापांक में बैच परिवर्तनशीलता के बैचखाते में लिया जाना है। वायरस आमतौर पर व्यावसायिक रूप से प्राप्त कर लिया जाता है, संबंधित जानकारी निर्माता के मुखपृष्ठ पर पाया जा सकता है। हम transdifferentiation प्रयोगों के लिए 3 के एक अपेक्षाकृत कम MOI के उपयोग करने के लिए सुझाव देते हैं।

NPCs के 31 में मानव pluripotent कोशिकाओं के भेदभाव के लिए वर्णित किया गया है के रूप में हमारे हाथ में मानव lif की वृद्धि स्थापित INPC लाइनों के आत्म नवीकरण के लिए महत्वपूर्ण है। LIF के अलावा बिना, कोशिकाओं के रूप में जल्दी दो दिनों एक गैर प्रतिवर्ती ढंग से वापसी के बाद के रूप में अंतर करने के लिए शुरू करते हैं।

संक्रमण के बाद सेल संस्कृति 39 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया और मानक 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति शर्तों का उपयोग नहीं कर रहा है। तापमान में यह वृद्धि एक दिन के संक्रमण के बाद पहले से ही शुरू होता है और सेंडाइ वायरस की एक गर्मी निष्क्रियता की ओर जाता है। संक्रमण के बाद 14 दिन तक 39 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति neuroepithelial कालोनियों की पीढ़ी के लिए आवश्यक है।

वास्तव में, कभी कभी INPC कालोनियों प्रोटोकॉल खंड में वर्णित की तुलना में बाद में आते हैं। हमारे अनुभव में, जब तक कोशिकाओं प्रफलन रहने के रूप में वे polyclonally passaged किया जा सकता है और मैनुअल उठा कर अलग किया। जल्दी होने वाली कालोनियों के लिए वर्णित के रूप में उन कालोनियों से स्थापित सेल लाइनों इसी तरह की संपत्ति दिखा।

स्थापित सेल लाइनों के बंटवारे के दौरान यह है कि वे अच्छी तरह से पैदा करने के लिए सेल के लिए सेल संपर्कों या पैराक्राइन संकेतों की आवश्यकता के रूप में कोशिकाओं का एक बहुत छोटी संख्या में बीज के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। कोशिकाओं में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं तो बहुत कम घनत्व प्रसार थम जाएगी। इस मामले में, कोशिकाओं के प्रसार को पुनः आरंभ करने के लिए एक छोटे सतह के साथ एक सेल संस्कृति डिश पर replating द्वारा बचाया जा सकता है।

INPCs की glial भेदभाव के लिए यह एक उच्च घनत्व में कोशिकाओं को बीज के लिए और प्लेट लगभग मिला हुआ है जब उन्हें विभाजित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को बहुत जल्दी विभाजित कर रहे हैं, मुख्य रूप से neuronal भेदभाव मनाया जाएगा।

सामग्री "> इस पांडुलिपि में वर्णित प्रक्रिया एक अर्द्ध या पूरी तरह से स्वचालित ढंग से लागू किया जाना संभावित है, रोग मॉडलिंग और सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी सहित वांछित जैव चिकित्सा क्षमता हासिल करने के लिए आवश्यक होगा जो harbors। स्वचालन भी लागत सक्षम होगा तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं की पीढ़ी के कुशल पैमाने अप और parallelization।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए उपयोगी सुझाव और मार्टिना गेभार्ट के साथ-साथ हीके Arthen के लिए स्टेम सेल और वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय के पुनर्योजी चिकित्सा समूह के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), शिक्षा जर्मन मंत्रालय और रिसर्च BMBF (0813 01 जीएन), बवेरियन अनुसंधान नेटवर्क प्रेरित pluripotent स्टेम सेल "forIPS" और "Stiftung Sibylle Assmus से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया "। चित्रा 1 www.servier.com से उपलब्ध Servier मेडिकल कला, का उपयोग कर उत्पादन किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte media ScienCell 1801
B27 LifeTechnologies 17504-044
BDNF Peprotech 450-02
Biopsy Punch pfm medical 48301
cAMP Sigma A6885
CHIR99021 Axon medchem 1386
Collagenase Type2 Worthington Biochemical LS004177
Dispase PAN  P10-032100
DMEM LifeTechnologies 41966-029
DMEM F12 LifeTechnologies 11320-033
DMSO Roth 4720
DPBS LifeTechnologies 14190-094
EGF Life Technologies PHG0313
FCS Biochrom AG 50115
GDNF Peprotech 450-10
Gentamicin Sigma G1397
GFAP-antibody Dako Z0334
GlutaMAX LifeTechnologies 35050-038
hLIF Peprotech 300-05
Insulin Seralab GEM-700-112-P
Ki67-antibody NeoMarkers RM-9106-S
L-Glutamine LifeTechnologies 25030-024
Laminin Sigma L2020
N2 LifeTechnologies 17502-048
Nestin-antibody R&D Systems MAB1259
Neurobasal LifeTechnologies 21103-049
Non-essential amino acids LifeTechnologies 11140-050
NSC freezing media Sigma C6295
Oct4-antibody Santa Cruz sc9081
Pax6-antibody Covance PRB-278P
SB431542 Invivogen inh-sb43
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit  LifeTechnologies A1378001
Sodiumpyruvate Life Technologies 11360-039
Sox1-antibody R&D Systems AF3369
Sox2-antibody R&D Systems MAB2018
T3 Santa Cruz sc-205725
Trypsin/EDTA Life Technologies 15400-054
TUJ1-antibody Covance MMS-435P-250
Vitamin C Sigma A4544
Y27632 Calbiochem CAS 146986-50-7
β-Mercaptoethanol LifeTechnologies 21985023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
  4. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  5. Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
  6. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  7. Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
  8. Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
  9. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
  10. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
  11. Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
  12. Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657 (2012).
  13. Bosnali, M., Edenhofer, F. Generation of transducible factors. Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).
  14. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  15. Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87 (2013).
  16. Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47 (2014).
  17. Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  18. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
  19. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  20. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
  21. Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
  22. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  23. Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
  24. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
  25. Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
  26. Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
  27. Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
  28. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283 (2005).
  29. Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
  30. Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
  31. Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
  32. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252 (2013).
  33. Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
  34. Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
  35. Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145 (2008).
  36. Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
  37. Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
  38. Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
  39. Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
  40. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
  41. Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
  42. Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
  43. Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
  44. Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
  45. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 101 प्रत्यक्ष रूपांतरण वंश reprogramming transgene मुक्त reprogrammed कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं transdifferentiation neuronal भेदभाव glial भेदभाव सेल थेरेपी स्टेम कोशिका जीव विज्ञान रोग मॉडलिंग तंत्रिका कोशिका प्रतिस्थापन स्टेम।
वयस्क मानव fibroblasts की व्युत्पत्ति और विस्तार तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में उनके प्रत्यक्ष रूपांतरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meyer, S., Wörsdörfer, P., … More

Meyer, S., Wörsdörfer, P., Günther, K., Thier, M., Edenhofer, F. Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (101), e52831, doi:10.3791/52831 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter