Summary
Generation af inducerede pluripotente stamceller giver fascinerende udsigter for afledning af autologe transplantationer. Men progression gennem en pluripotent tilstand og møjsommelig re-differentiering stadig hindrer klinisk oversættelse. Her beskriver vi afledningen af voksne humane fibroblaster og deres direkte omdannelse til inducerede neurale progenitorceller og den efterfølgende differentiering til neurale slægter.
Abstract
Generation af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) fra voksne hudfibroblastre og efterfølgende differentiering i somatiske celler giver fascinerende udsigter for afledning af autologe transplantationer, der omgår histokompatibilitets barrierer. Men progression gennem en pluripotent tilstand og efterfølgende fuldstændig differentiering i ønskede slægter fortsat en vejspærring for den kliniske oversættelse af iPSC teknologi på grund af den tilhørende neoplastisk potentiale og genomisk instabilitet. Nylig, vi og andre viste, at somatiske celler ikke alene kan omdannes til iPSCs men også i forskellige typer af multipotente somatiske stamceller ved hjælp af definerede faktorer, derved omgå progression gennem pluripotent tilstand. Især den direkte omdannelse af humane fibroblaster i inducerede neurale progenitorceller (iNPCs) varsler muligheden for en hidtil ukendt autolog celle kilde til forskellige anvendelser, såsom udskiftning celle, sygdomsmodellerog narkotika screening. Her beskriver vi isolering af voksne humane primære fibroblaster efter hudbiopsi og deres effektive direkte omdannelse til iNPCs ved rettidig begrænset ekspression af Oct4, Sox2, Klf4, samt c-Myc. Sox2-positive neuroepitelceller kolonier vises efter 17 dages induktion og kan etableres INPC linier effektivt ved monoklonalt isolering og ekspansion. Præcis justering af viral infektionsmultiplicitet og supplering af leukæmi inhibitorisk faktor under induktionsfasen repræsenterer kritiske faktorer for at opnå virkningsgrader på op til 0,2%. Hidtil kunne patientspecifikke INPC linjer udvides i mere end 12 passager og ensartet vise morfologiske og molekylære funktioner i neurale stamceller / progenitorceller, såsom udtryk for Nestin og Sox2. De INPC linjer kan differentieres til neuroner og astrocytter som bedømt ved farvning mod TUJ1 og GFAP hhv. Afslutningsvis rapporterer vi en robust protokol for afledning og dystrect konvertering af humane fibroblaster i stabilt udvides neurale stamceller, der kan give en cellulær kilde til biomedicinske anvendelser, såsom autolog neurale celle udskiftning og sygdom modellering.
Introduction
I 2006 Yamanaka og kolleger kunne vise for første gang muligheden for omprogrammering af somatiske celler i en pluripotent tilstand 1. Denne dedifferentiering blev opnået ved overekspression af fire transkriptionsfaktorer Oct4, Sox2, Klf4, og c-Myc i murine fibroblaster. De genererede såkaldte inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) viser funktionel ækvivalens til embryonale stamceller (EKSF) og kan således opdeles i alle celletyper i den voksne organisme. Et år senere omprogrammering til iPSCs kunne også opnås for humane fibroblaster 2. Forsøg i dyremodeller viser, at iPSC-afledte celler generelt kan anvendes til celle substitutionsbehandling, fx i Parkinsons sygdom (PD) 3-5. Men flere begrænsninger forbundet med brugen af iPSCs repræsenterer, vejspærringer for den fulde virkeliggørelse af deres terapeutiske potentiale. Først og fremmest, omprogrammering af celler i en pluripotent tilstand og efterfølgendekvalitetskontrol er generelt en tidskrævende og ineffektiv proces gav i omfattende og dermed bekostelige celledyrkningsprocedurer. For det andet behøver iPSCs at være re-differentieret i den ønskede celletype af interesse før biomedicinsk ansøgning og sandsynligheden for resterende pluripotente celler i differentierede befolkning rummer et betydeligt tumorigent potentiale og dermed viser en høj risiko efter celle transplantation 6. For det tredje er den omprogrammering proces normalt opnås ved at inducere de omprogrammering faktorer ved lenti- eller retroviral infektion. Integrationen af disse vira i værtsgenomet kan føre til insertionsmutagenese og / eller ukontrolleret reaktivering af transgenerne 7,8. Ikke-integrerende systemer er blevet udviklet til at levere de omprogrammeringsbeslutninger faktorer til målceller, hvilket minimerer risikoen for insertionsmutagenese og transgen reaktivering. Eksempler på disse transgene-fri tilgange er omprogrammering af celler ved anvendelse af ikke-integrerendeAdeno eller Sendai-virus 9,10, DNA-baserede vektorer 11 eller anvendelsen af DNA-fri metoder, ligesom transfektion af syntetisk mRNA 12 eller transduktion af rekombinante proteiner 13,14. En anden lovende metode til afledning af transgen-fri iPSC er brugen af loxP-modificerede lentiviral omprogrammering konstruktioner og efterfølgende sletning af transgener ved hjælp af Cre-loxP DNA-rekombination systemet 15,16.
En mere enkel tilgang til at generere neurale celler til erstatning celleterapi repræsenterer direkte omdannelse af fibroblaster til post-mitotiske neuroner 17-20. Vierbuchen et al. Rapporterede, at overekspression af transkriptionsfaktorer Ascl1, Brn2 og Myt1l resulterer i frembringelsen af 20% neuroner fra murine fibroblaster 17. Blev det i 2011 viste, at de samme tre transkriptionsfaktorer i kombination med overekspression af NeuroD1 muliggøre transdifferentiering af humane fibroblaster i neuRons 19. Menneskelige induceret neuroner kunne også dannes ved overekspression af Ascl1 og Ngn2 under dobbelt SMAD- og GSK3β- hæmning 20. Især direkte omdannelse af fibroblaster til neuroner frembringer en ikke-proliferativ, post-mitotisk cellepopulation, der ikke tillader yderligere ekspansion og biobank.
For nylig blev den direkte omdannelse af fibroblaster i en prolifererende neurale stamceller / progenitorcellepopulationen rapporteret 21-26. For overskuelighedens skyld vil alle disse celletyper navngives som inducerede neurale stamceller (iNPCs) i denne rapport. Han et al. Overudtrykt Brn4, Sox2, c-Myc og Klf4 at generere iNPCs. Ligesom deres neurale stamceller modstykker afledt enten primær væv eller pluripotente celler disse iNPCs er tripotential og kunne differentieres i neuroner, astrocytter og oligodendrocytter 21. Vores gruppe rapporteret en lidt anden konvertering protokol involverer overekspression af Sox2, Klf4Og c-Myc og induceret Oct4-udtryk kun 5 dage. Med denne tilgang kan vi generere stabilt prolifererende iNPCs fra murine embryonale og voksne fibroblaster, der udviser fuldstændig lyddæmpning af omprogrammering faktorer 22. I modsætning til iPSCs, behøver iNPCs ikke udviser en tumorigent potentiale efter transplantation 27. Vi brugte konverteret celler med succes i en dyremodel for demyelinisering, myelin mangelfuld rotter viser, at iNPCs er klinisk nyttige 22. Indtil da kunne NPC'ere kun genereres fra pluripotente stamceller eller primær nervevæv 28-32. iNPCs er stabilt ekspanderbare celler, der kan kryopræserveres og er i stand til at differentiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Der er gjort en stor indsats for at tilpasse den direkte konvertering protokollen fra mus til humane celler 23,26,33,34. I 2012 blev det offentliggjort, at overekspression af enkeltfaktor Sox2 i fibroblaster er tilstrækkelig til at generere murine og humane iNPCs
Adskillige undersøgelser viser den cellulære funktionalitet NSC eller deres differentierede modparter i forskellige dyremodeller. Neurale progenitorer fra humane pluripotente stamceller er blevet transplanteret i musemodeller af neuroinflammatoriske lidelse multipel sklerose 35,36. Anvendeligheden af hESC-afledte neurale progenitorceller i EAE (eksperimentel autoimmun encephalomyelitis) -mice blev første gang vist i 2008 35. Multipotente neurale precursorceller blev injiceret i ventriklerne af muse hjerne og transplantation resultated i en reduktion af kliniske symptomer på EAE. Kim et al. Genereret oligodendrogliale forstadier fra hESCs og transplanteres dem intracerebroventrikulært i EAE-mus. Selvom transplantationer ikke overlevede i mere end 10 dage, viste mus signifikant forbedring af neurologiske funktion og reduktion af proinflammatoriske immunceller i den hvide substans 36. Stamcelle-terapi er også blevet anvendt til præklinisk målretning af Parkinsons sygdom som NPC'ere med held kan anvendes i de respektive dyremodeller. Til dette blev der progenitorceller enten afledt fra føtalt hjernevæv 37 differentieret fra pluripotente stamceller 38-40 eller mesenchymstamceller 41 blev anvendt. I 2012 viste vi, at muse iNPCs er i stand til at producere proteolipidprotein, de store myelinprotein komponent, efter transplantation ind i hjernen på myelin-deficiente (MD) rotter 22. Ved at proof-of-principle eksperiment den terapeutiske applicabiltet af iNPCs blev først bevist og snart bekræftet af en anden undersøgelse 32. Det fulde potentiale af terapeutisk brug af menneskelige iNPCs forbliver dog på at blive udforsket.
Her viser vi en robust og integreret proces af (i) afledning af humane primære celler fra voksne patienter via hudbiopsi, at (ii) direkte omdannelse af humane fibroblaster i en neural progenitor tilstand og (iii) evne iNPCs opdeles i neuronal og glia slægter. Brug af denne protokol vil bidrage til at fremskynde dannelsen af autologe humane celler til terapeutiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De humane fibroblaster anvendt i denne undersøgelse blev indhentet fra en hud slag biopsi efter at få informeret samtykke og etisk efter den etiske komité ved universitetet i Würzburg, Tyskland (etisk rapport nr: 96/11 dateret 2011/10/06).
1. Punch Biopsi
- Desinficere huden af patienten. Bedøve huden lyder biopsi tages fra (fortrinsvis en mindre sol-eksponerede område) ved anvendelse af 0,5 til 1 ml mepivacain hydrochlorid intrakutant og forberede hudbiopsi anvendelse af en steril 3mm biopsitang, skylles biopsi med DPBS + 1 pl / 1ml Gentamicin og fjern fedt. Skyl biopsi to gange med DPBS + Gentamicin, aspireres DPBS fuldstændigt og dække biopsi med Dispase II (2,4 U / ml) og inkuberes 16-18 timer ved 4 ° C.
- Aspirer Dispase helt vaskes to gange med DPBS og fjern epidermis med en pincet. Vask biopsi to gange med DPBS, tilsættes 2 ml Collagenase Type 2 (500 U / ml CDU), overførsel i 15 ml rør og tilsæt Collagenase op til 5 ml samlede volumen. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Centrifuger i 5 minutter ved 180 xg og kassér supernatanten bagefter. Resuspender pellet i 10 ml DMEM-FCS-Gentamicin-medier (10% FCS, 1 pl / ml gentamicin) og centrifugeres igen i 5 minutter ved 180 x g. Kassér supernatanten og resuspender pellet i 1,5 ml DMEM-FCS-Gentamicin-medier. Overførsel til T25 vedhængende væv kultur-kolbe og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2.
- Skift medier hver 3. dag.
- Efter ca. 2 uger, når celler sammenflydende omkring hud dele, opdele celler ved anvendelse af trypsin / EDTA (0,05%): udvaskede celler en gang med DPBS, der inkuberes 5 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 efter tilsætning af 2 ml Trypsin / EDTA (0,05%), tilsættes 2 ml DMEM-FCS-Gentamicin-media, overførsel til 15 ml rør og centrifugeres ved 180 xg i 5 min; kassere supernatanten og resuspender pellet i passende mængde DMEM-FCS-Gentamicin-medier.
- Yderligere udvide cellerne ved at ændre mediet hver 3 rd dag og opsplitning som beskrevet ovenfor, når cellerne er sammenflydende; tilsætning af Gentamicin kan stoppes efter passage 2.
- Før du bruger cellerne for direkte eksperimenter konvertering, skal du sørge for at udelukke mycoplasma forurening med standard-assays.
- Når celler er blevet udvidet, kan du direkte begynde konvertering eller fryse celler ned ved hjælp 10% DMSO og 90% FCS. Celler bør opbevares i -80 ° C i 2 dage og derefter overført til flydende nitrogen til langvarig opbevaring.
- Til tilberedning af konvertering, vask celler gang med DPBS, aspireres DPBS og tilsæt 2,5 ml Trypsin / EDTA (0,05%). Holde i 5 minutter ved 37 ° C, 5% CO2. Tap kolbe forsigtigt at frigøre celler, resuspender i 2,5 ml fibroblast (DMEM inkl. L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% Sodium pyruvat) og overføre til 15 ml rør. Centrifuger ved 180 xg i 5 min, og supernatanten aspireres. Resuspender celler i 1 ml fibroblast medier og pipette op og ned for at generere enkelt cellesuspension. </ Li>
- Tæl antallet af celler under anvendelse af en Fuchs-Rosenthal- eller Neubauer-celletælling kammer og plade 3 x 10 4 celler pr brønd af en 24 brønds-plade. Inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO2.
2. Infektion af humane fibroblaster med Sendai Virus og transdifferentiering
BEMÆRK: For at sikre sikkerheden, kan følgende trin håndterer virus skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab og en laminar flow hætte, og med passende personlige sikkerhedsudstyr, især en kirurgisk maske, for at forhindre slimhinde eksponering.
- Skifte cellerne til 100 pi fibroblast medier (Trin 1.9). Tø portioner af Oct4-, Klf4-, Sox2- og c-myc-Sendaivirus og resuspender hver virus i 1 ml fibroblast medier. Tilføje hver virus med en MOI på 3 til celler (virustiter varierer fra parti til parti, men en portion af hver virus kan generelt anvendes til infektion af 10 brønde i en 24 brønds-plade) og blandes forsigtigt. Inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO2
- Efter 24 timer aspirat mediet, og der tilsættes 500 pi neuroinduction medier (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 pM CHIR99021, 2 uM SB431542) og kultur ved 39 ° C, 5% CO2 fra nu af. Skift medierne hver anden dag.
- På dag 6 efter infektion forberede laminin-belagt 6-godt-plader: fortynd laminin til 1 ug / ml i DPBS, tilsættes 1 ml opløsning på 6 godt plader og holde ved 4 ° C i 24 timer.
- På dag 7 efter infektion opdele cellerne under anvendelse af DPBS / EDTA: aspirere medierne og vaske celler en gang med DPBS, tilsæt derefter 500 pi DPBS / EDTA og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Tilsættes 500 pi DMEM / F12 og fjern suspensionen fra pladen i et 15 ml rør og centrifugeres ved 180 xg i 5 min.
- Aspirere supernatanten og resuspender pellet i 1,5 ml neuroinduction medier, plade på laminin-overtrukne 6 brønde plader og tilføj ROCK inhibitor Y27632 i en endelig koncentration på 10 uM til cellerne, kultur ved 39 ° C, 5% CO2.
- Skift medierne hver anden dag.
- Fra dag 14 efter infektion dyrkning af cellerne ved 37 ° C, 5% CO2. Neuroepitelceller kolonier fremgå omkring dag 17 efter infektion ved fasekontrastmikroskopi. De bør være stor nok til at blive plukket omkring dag 20 efter infektion.
3. Isolering af formodede INPC Kolonier
- En dag før plukke, pels én 48 godt plade med laminin: fortynd laminin til 1 ug / ml i DPBS, tilsættes 300 pi løsning på plader og holde ved 4 ° C i 24 timer. En dag senere aspirér laminin fra plader og tilsættes 200 pi neuroinduction medier til brøndene.
- Vask de 6 godt plader indeholdende kolonierne skal plukkes én gang med DPBS og der tilsættes 2 ml DPBS per brønd af 6 godt plade. Pick kolonierne mekanisk: skrabe rundt kolonier under anvendelse af en tynd nål for at slippe af omgivende celler; indstille 2001 l Pipetman på 50 pi og vælge kolonierne ved hjælp af de respektive pipettespidser.
- Overføre en koloni hver i én brønd i en laminin-overtrukne 48-brønd plade og frembringe en enkelt cellesuspension mekanisk ved pipettering op og ned 10 gange. Tilføj ROCK inhibitor Y27632 i en slutkoncentration på 10 uM til cellerne.
- Grow cellerne på 48 brønd-plade ved 37 ° C, 5% CO2 i 2 dage. Skift medierne hver anden dag, indtil cellerne når 80-90% konfluens (ca. 3 -. 4 dage).
4. Udvidelse og Cryo-bevarelse af iNPCs
- Passage og Udvidelse af iNPCs
- Aspirere mediet og vaske cellerne med DPBS. Aspirer DPBS og der tilsættes 200 pi DPBS / EDTA og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2, tilsættes 200 pi DMEM / F12 og ophæve suspension fra pladen i et 15 ml rør, centrifugeres ved 180 xg i 5 min .
- Aspirere supernatanten og resuspender pellet i 0,5 ml neuroinduction medier (trin 2.2), pladen på laminin-overtrukne 12 brønds-plader og tilføj ROCK inhibitor Y27632 i en endelig koncentration på 10 uM til cellerne, dyrkning ved 37 ° C, 5% CO2. Efter celler nå 80-90% sammenflydning kan de enten udvides yderligere eller frosset ned som følger.
- Indefrysning af iNPCs
- Aspirere mediet og vaske cellerne med DPBS. Aspirer DPBS og tilføje 300 pi DPBS / EDTA og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2, tilsættes 300 pi DMEM / F12 og fjern suspensionen fra pladen i et 15 ml rør, centrifugeres ved 180 xg i 5 min.
- Aspirere supernatanten og resuspender pellet i 0,5 ml kommerciel NSC frysning medium. Overfør suspensionen til frysning hætteglas og sat i celle indefrysning container. Opbevares ved -80 ° C i 2 dage, derefter overføre til flydende nitrogen til langvarig opbevaring.
5. Differentiering af iNPCs
- Differentiering mod neuronal afstamning
- Kultur celler på laminin-overtrukne plader som beskrevet ovenfor. Skift medier til neuro-diff-medier (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 uM C-vitamin, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF), når celler er ca. 70% sammenflydende. Skift medier hver anden dag i tre uger. Må ikke delt celler under differentiering.
- Efter tre uger celler bør udtrykke neuronal markør TUJ1. For at få mere modne neuroner og neuronale undertyper fortsætter differentiering op til 3 måneder.
- Differentiering mod glial afstamning
- Skifte medie til glial induktion medier (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 uM β-mercaptoethanol, 100 uM ikke-essentielle aminosyrer, 1,5 mM L-glutamin, 5 ug / ml insulin, 40 ng / ml T3), herunder 20 ng / ml EGF til at inducere differentiering til gliale precursorceller. Fjern halvdelen af medierne og erstatte med frisk medium hver anden dag i ca 2 uger. I denne periode bør opdeles celler1: 3 i nærvær af 10 uM ROCK inhibitor Y27632 når 100% konfluens er nået.
- Efter 2 uger differentiere cellerne yderligere i astrocytter: når cellerne er næsten sammenflydende ændring medier til kommerciel tilgængelig astrocyt medier, skifter medier hver anden dag. Efter omkring 7 dage celler begynder at udtrykke astrocyt markører (f.eks GFAP). Hvis celler få 100% konfluente under differentieringen protokollen, opdele dem i et 1: 2-forhold i nærvær af 10 uM ROCK inhibitor Y27632.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenterer vi beskrivelse af en integreret proces, der tillader generering af inducerede neurale progenitorceller (iNPCs) fra humane fibroblaster, der er blevet opnået ved en punch biopsi fra huden inden for mindre end 8 uger (figur 1). Patient-specifkke iNPCs kan yderligere differentieres i neuronale og gliale slægter og havnen stort potentiale for udskiftning celleterapi og sygdom modellering.
Infektion af fibroblaster med Oct4-, Klf4-, Sox2- og c-myc- Sendai virus 23 og kultur i neuroinductive medieforhold 22,31 resulterede i en ændring i morfologi af fibroblaster og efterfølgende fremkomst af kolonier 17 dage efter infektion (figur 2). Fremstillede monoklonale cellelinier kan udvides og plette positive for neural stamcelle markører som Sox2, Sox1, Nestin, Vimentin, Otx2 og Pax6, samt for proliferation Ki67, hvorimod de ikke udtrykker pluripotency-associeret markør Oct4 (figur 3).
Desuden ved tilsætning af neuronale vækstfaktorer til celledyrkningsmedier de neurale progenitorceller kan differentieres til neuroner. Ved at anvende en differentiering protokol baseret på Izrael et al. 42 og efterfølgende endelige differentiering med astrocyt induktion medier cellelinier kan også differentieres til glia slægter som bedømt ved analyse af typiske morfologiske ændringer og farvning mod glial fibrillært surt protein (GFAP) (figur 4 ).
Figur 1. Skematisk fremstilling af tre-trins protokol anvendt i denne undersøgelse. Fibroblaster kan isoleres fra patienter med en punch biopsi og udvidet. Disse cellelinier kan derefter omdannes direkte til inducerede multipotente neurale progenitorceller (iNPCs) og monoclonally udvidet. INPC linjer kan bruges til langtidsopbevaring (biobank til gentagen eller standardiseret brug), eller de kan differentieres i neuronale og gliale slægter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Morfologiske analyser af direkte omdannelse af humane fibroblaster i inducerede neurale progenitorceller ved anvendelse fasekontrastmikroskopi (A) Humane fibroblaster tre dage efter infektion med OKSM -. Sendai-virus og to dage efter tilsætning af neuroinduction medium. Celler viser typiske fibroblastlignende morfologi. (B) Syv dage efter infektion celler med ændrede morfologi show op. Celler er opdelt for at reducere konfluens på samme dag. (C) ti dags efter infektion kun celler med ændret morfologi er til stede. (D) første lille neuroepitelceller-lignende kolonier kan findes 17 dage efter infektion. Disse kolonier stigning i størrelse (E), og outgrowing celler kan findes (F) tre dage senere. Celler opsamles på dag 21 efter infektion og ekspanderbare cellelinier kan genereres fra dem (GI). Forskellige kloner er vist i passagen 1 (G), passage 3 (H) og passagen 10 (I) efter plukningen, hhv. Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Analyse af neural stamcelle markør genekspression af genereret neural progenitor cell linjer. Antibody farvning af cellelinier efter 10 passager viste, at celler udtrykker de neurale stamceller cellemarkører Sox1, Sox2 (A) samt nestin og Pax6 (B). Celler er negative for pluripotens markør Oct4 indikerer fravær af pluripotens (C). Størstedelen af celler farvet positive for Ki67, der viser en høj proliferativ tilstand (C). Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Analyse af NPCs efter dirigeret differentiering til neuronale og gliale afstamninger. (A) For at opnå neuronale specifikation iNPCs blev differentieret i syv dage i nærværelse af BDNF, GDNF, C-vitamin og cAMP. (B) Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi isoleringen og direkte omdannelse af humane fibroblaster i udvides transgene-fri neurale stamceller og deres differentierede afkom som en formodet grundlag for celle-substitutionsterapi eller anvendelse i drug screening analyser. Direkte afstamning omdannelse af somatiske celler i NPC'ere er blevet opnået ved tvungen ekspression af afstamning-specifikke transkriptionsfaktorer 26,33,34. Alligevel, i mange tilfælde føtale fibroblaster blev anvendt til transdifferentiering eksperimenter 33,34. Til biomedicinske anvendelser brugen af disse celler er uhensigtsmæssigt, da denne celle kilde udelukker klinisk anvendelse til autolog celleudskiftning. For nylig blev offentliggjorte undersøgelser, der beskriver dannelsen af neurale precursorceller fra mere lettilgængelige væv, såsom hæmatopoietiske celler 43,44. Den vellykkede generation af tripotent neurale stamcellelinjer kunne påvises for murine B-celler afledt af blod af det inducerbare overexpresion af otte transgener 43. Desuden Castano et al. Offentliggjort en fremgangsmåde til induktion af neuronale stamceller fra humane hæmatopoietiske celler ved anvendelse Sox2- og c-myc-Sendai-virus 44. Protokollen beskrevet muliggør hurtig og effektiv generering af neurale celler fra CD133 + ledningen blodlegemer. Når de anvendes til konvertering af voksne perifere mononukleære blodceller protokollen gav dog lav effektivitet og udvidelsen kapacitet de genererede cellelinjer var meget begrænset 44. Således er den eneste undersøgelse offentliggjort med perifere blodceller i det menneskelige system til dato 44 viser tydeligt begrænsningerne ved denne særlige celletype i direkte eksperimenter konvertering. Da tilgængeligheden af patient-specifikke celler er afgørende for celle udskiftning autolog, udgør stadig den foretrukne celletype voksne fibroblaster, som let kan afledt via en hud dorn biopsi som beskrevet i vores studie.
Den overexpression af transgener nødvendige for transdifferentiering har mest været opnået ved integrative virale vektorer 26,33,34. Dette hindrer anvendeligheden af de afledte cellelinier til biomedicinske anvendelser siden integrationen af viraene i værtsgenomet kan føre til insertionsmutagenese eller uønsket reaktivering af transgenerne 7,8. Transdifferentiering ind NPC'ere uden transgen overekspression men baseret på kemisk behandling er blevet beskrevet for humane fibroblaster 45. Men i denne undersøgelse disse precursorceller var kun til stede i en forbigående tilstand da formålet med undersøgelsen var genereringen af modent Schwann-celler 45. For nylig er andre transgene-fri metoder baseret på anvendelse af Sendai-virus er blevet beskrevet for den direkte omdannelse af humane fibroblaster i NPCs 23,44 og synes at være den foretrukne strategi til dato. At udlede udvides NPC'ere, der efterfølgende kan differentieres i neuronale og gliale afstamninger,vi anvender overekspression af alle Yamanaka-faktorer af Sendai-virus sammen med varme inaktivering af virus 23 samt neural induktion ved tilsætning af små molekyler til dyrkningsmediet 22,31 med vigtige modifikationer som beskrevet i det følgende.
Selv om der i vore hænder, er protokollen effektivt arbejde med mange fibroblast testede linjer, er der en tydelig tendens til, at den direkte omdannelse af fibroblastceller fra gamle donorer udviser en dårlig proliferativ potentiel resultat i en lav effektivitet INPC generation. Vi observerede kolonidannende effektivitet på op til 0,2% efter en viral transduktion effektivitet på mere end 90% som bedømt ved infektion af celler med Oct4 kun og efterfølgende farvning. Denne effektivitet er omkring 3 gange højere end tidligere offentliggjort 23.
Den netop justerede anvendelse af en optimeret viral MOI er kritisk. Batch til batch variation i Sendai-virus titerhar der skal tages i betragtning. Da virus normalt erhverves kommercielt findes respektive oplysninger på producentens hjemmeside. Vi foreslår at anvende en relativt lav MOI på 3 for transdifferentiering eksperimenter.
Tilsætning af menneskelig LIF i vores hænder er afgørende for selv fornyelse af de etablerede INPC linjer som det er blevet beskrevet for differentiering af humane pluripotente celler i NPC'ere 31. Uden tilsætning af LIF, cellerne begynder at differentiere så tidligt som to dage efter tilbagetrækning i en ikke-reversibel måde.
Cellekultur efter infektion udføres ved 39 ° C og ikke ved anvendelse af standard 37 ° C celledyrkningsbetingelser. Denne temperaturstigning starter allerede én dag efter infektion og fører til en varme-inaktivering af Sendai-virus. Kulturen ved 39 ° C indtil dag 14 efter infektion er essentiel for dannelsen af neuroepitelceller kolonier.
Faktisk, sommetider INPC kolonier kommer op senest beskrevet i protokollen afsnit. Det er vores erfaring, så længe cellerne forbliver proliferativ de kan polyklonalt passage og isoleres ved manuel plukning. De etablerede cellelinier fra disse kolonier viser lignende egenskaber som beskrevet for de tidlige forekommende kolonier.
Under spaltningen af etablerede cellelinjer er det vigtigt ikke at pode et for lille antal celler, da de kræver celle-til-celle kontakter eller parakrine signaler at proliferere godt. Hvis celler podet i for lav spredning densitet vil ophøre. I dette tilfælde kan celler reddes af genudplade på en cellekultur skål med en mindre overflade at re-initiere proliferation.
For glial differentiering af iNPCs er det meget vigtigt at pode celler i en høj tæthed, og at dele dem, når pladen er næsten sammenflydende. Hvis celler splittet for tidligt, vil overvejende neuronal differentiering observeres.
indhold "> beskrevet i dette manuskript proces rummer potentialet til at blive anvendt i en halv- eller fuldt automatiseret måde, som ville være nødvendige for at opnå den ønskede biomedicinsk potentiale, herunder sygdom modellering og udskiftning celleterapi. Automatisering vil også gøre det muligt for omkostningseffektiv effektiv opskalering og parallelisering af frembringelsen af neurale progenitorceller.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke alle medlemmer af stamceller og regenerativ medicin Group fra University of Würzburg for nyttige forslag og Martina Gebhardt samt Heike Arthen for fremragende teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning BMBF (01 GN 0813), de bayerske Research Network induceret pluripotente stamceller "forIPS" og "Stiftung Sibylle Assmus ". Figur 1 blev fremstillet ved anvendelse Servier Medical Art, tilgængelig fra www.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
- Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657 (2012).
- Bosnali, M., Edenhofer, F.
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87 (2013).
- Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47 (2014).
- Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
- Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
- Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283 (2005).
- Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252 (2013).
- Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
- Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
- Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145 (2008).
- Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
- Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
- Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
- Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
- Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
- Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
- Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).
